郭正昌趙澤玉張宗耀周 翔周 波

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科,合肥 230032)

小腸類器官是小腸干細胞在體外進行3D 培養(yǎng)時,以連續(xù)分化的方式形成的一種多細胞類型的三維結(jié)構(gòu),其與體內(nèi)小腸上皮的生理結(jié)構(gòu)和功能有很大的相似性。 作為一個新的小腸上皮研究模型,由Clever 教授及其團隊[1]于2009 年通過體外三維培養(yǎng)富含亮氨酸重復序列的G 蛋白偶聯(lián)受體(Lgr5)基因表達的腸道干細胞率先完成體外的構(gòu)建。

研究表明,許多腸道疾病的病變起始于腸道上皮,在炎癥性腸病中腸道上皮中的杯狀細胞水平降低導致粘蛋白的分泌減少,這也被認為是炎癥性腸病的一個特征性標志[2]。 另外,許多腸道感染性疾病也被證實與病原體和腸道上皮細胞之間的相互作用有關(guān)。 現(xiàn)已有研究者開始利用小腸類器官模型來開展病原體與宿主之間的相互作用關(guān)系及其致病機制的研究[3-5]。 此外,小腸作為人重要的器官之一,執(zhí)行著消化、吸收、分泌、免疫屏障等多方面的功能,腸道疾病的發(fā)生也與腸道屏障的破壞有關(guān)[6-9]。 小腸類器官作為模擬體內(nèi)小腸上皮的模型,自成功構(gòu)建以來,已在腸道感染性疾病[10]、再生醫(yī)學[11]、腫瘤學[12]、藥理學[13]和營養(yǎng)學[14]的研究中得以應用,然而,現(xiàn)在國內(nèi)關(guān)于小腸類器官的研究鮮有開展。

由于小腸類器官的構(gòu)建步驟復雜,模型構(gòu)建尚未成熟,本研究著重探索及優(yōu)化小腸隱窩的分離、培養(yǎng)、小腸類器官傳代、凍存及復蘇的方法,在此基礎(chǔ)上研究R-Spondin1(R 脊椎蛋白1)濃度對小腸類器官形成的影響及小腸類器官的蛋白提取方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 小鼠3 只,體重20～25 g,6～8周齡,雌雄不限,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(皖)2017-001]提供,安徽醫(yī)科大學實驗倫理委員會審批號(LLSC20180416)。 無菌手術(shù)在安徽醫(yī)科大學實驗動物中心屏障設(shè)施中進行[SYXK(皖) 2017-0124]。 并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Advanced DMEM/F12(美國Invitrogen 公司,貨號：12634-010)；類器官完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1% L-glutamine(美國Invitrogen 公司,貨號：25030)；1% pen/strep(美國Invitrogen 公司,貨號：15140-148)；1% Hepes 10 mmol/l(美國Invitrogen 公司,貨號：15630080)； N2 supplement 1 ∶100(美國Invitrogen 公司,貨號：17502-048)；B27 supplement 1：50(美國Invitrogen 公司,貨號：17504-044)；0.1 μg/mL Recombinant Mouse Noggin Protein(美國R＆D Systems 公司,貨號：1967-NG-025)； 0.5 μg/mL Recombinant Mouse RSpondin1 Protein(美國R＆D Systems 公司,貨號：3474-RS-050)；0.05 μg/mL Recombinant Mouse EGF Protein(美國R＆D Systems 公司,貨號：2028-EG-200)；Matrigel Matrix 基質(zhì)膠(美國BD 公司,貨號：356231)；EDTA(美國Sigma 公司,貨號：431788-25G)； DPBS ( 美國 Hyclone 公司, 貨 號：SH3002802.02)；腸類器官凍存液：80% Advanced DMEM/F12(美國Invitrogen 公司,貨號：12634 -010)；10%DMSO(美國Sigma 公司,貨號：D2650-100ML)；10%FBS(美國Gibco 公司,貨號：10270-106)。 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；電泳儀(北京六一)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學)；脫色搖床(金壇市泰納儀器)；曝光儀(上海勤翔)。RIPA 裂解液(碧云天公司,貨號：P0013B)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小腸類器官的分離

將小鼠腹腔麻醉后脫頸椎處死,放于75%乙醇中浸泡10 min。 在生物安全柜中,于小鼠會陰處開一小口,沿著腹正中線切開皮膚至劍突下,用Alice鉗將皮膚向兩邊拉開,逐層進腹。 找到胃的幽門,在幽門下5 cm 處及距回盲部5 cm 處分別離斷小腸。 將小腸放入冰DPBS 中,小心的去除殘留的腸系膜及血管,然后用10 mL 注射器吸取冰DPBS 從靠近幽門端輕柔的沖洗腸腔,使腸內(nèi)容物排出。 用眼科剪小心的縱向切開小腸,用細胞計數(shù)板輕輕地刮去小腸絨毛,將刮去絨毛的小腸切成2 ～3 mm 的小段收集到50 mL 的離心管中。 用移液槍吸取15 mL 的冰DPBS,輕柔地反復吹打幾次,重復上述步驟,至上清液變澄清。 棄上清,并取20 mL 2.5 mmol/L 的EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于離心管中,將離心管放于冰上置于20 r/min 的搖床上搖晃30 min。 然后用潤濕的移液器輕柔的吹打3 次,將吹打后的溶液過70 μm 的濾網(wǎng)到50 mL 錐形管中,標記為第1 管,重復上述步驟依次標記2、3、4、5 管。 分別取10 μL 濾液于載玻片上觀察,保留小腸隱窩較多且雜細胞較少的管。 將目標管放于離心機中,4℃、1200 r/min 離心5 min,棄上清,沉淀在10 mL 5% BSA/DPBS 溶液中重懸,再以相同的離心參數(shù)離心,重復3 次,最后1 次重懸后取10 μL 懸液計數(shù),并計算離心管中的隱窩總數(shù)。

1.3.2 小腸類器官的培養(yǎng)

盡可能多的棄去上清液,以1 μL 基質(zhì)膠12.5個隱窩計算應加入的基質(zhì)膠體積,在離心管中用移液器重懸腸隱窩,注意不要吹出氣泡,基質(zhì)膠易凝,此步驟冰上操作。 用移液器吸取50 μL 懸液,一次性打入到在培養(yǎng)箱中孵育過的24 孔板中,種板后將24 孔板放于培養(yǎng)箱中孵育30 min 至基質(zhì)膠完全聚合。 待基質(zhì)膠完全聚合后沿孔壁添加500 μL 類器官生長培養(yǎng)基。 24 孔板放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d(培養(yǎng)基變黃)更換培養(yǎng)液。

1.3.3 小腸類器官的傳代

培養(yǎng)7 ～10 d 或類器官中央變黑時可以傳代,提前將24 孔板放于培養(yǎng)箱中預孵育至少30 min。吸走待傳代孔的培養(yǎng)液,每孔中加1 mL 冰DPBS,1 min 后挑起基質(zhì)膠,用1 mL 槍頭將基質(zhì)膠輕輕吹散,用配備27?2G 針頭的1 mL 注射器一次性吸走懸液,重復操作1 次,將懸液加入5 mL 離心管中,1200 r/min,4℃、離心5 min,離心,棄上清,按每孔1∶3傳代。 鋪板及培養(yǎng)同類器官的培養(yǎng)步驟。

1.3.4 小腸類器官的凍存

選擇生長狀態(tài)良好的類器官(一般傳代后3 ～4 d),進行凍存,每兩孔凍存一管。 吸去培養(yǎng)液,加入1 mL 細胞凍存培養(yǎng)液,用1000 μL 的槍頭將基質(zhì)膠吹散,后將懸液加到細胞凍存管中,放于程序性降溫凍存盒中,于-80℃冰箱放置1 d,后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。

1.3.5 小腸類器官的復蘇

預先將24 孔板放于培養(yǎng)箱預孵30 min。 取出液氮中的凍存管,放于37℃水浴鍋中,當凍存液剛好溶解時取出,用配備27?2G 針頭的1 mL 注射器抽吸一次,然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中,于1200 r/min、4℃的離心機中離心5 min,棄上清,加入5 mL 冰DPBS 重懸,重復上述離心步驟,棄上清。 按照之前類器官培養(yǎng)的步驟鋪板和培養(yǎng),每凍存管小腸類器官傳4 孔。

1.3.6 小腸類器官的蛋白提取

小腸類器官在基質(zhì)膠中3D 培養(yǎng)與傳統(tǒng)的貼壁和懸浮培養(yǎng)不同,蛋白提取時操作也有所區(qū)別,本研究探索了小腸類器官蛋白提取的方法。 首先吸除24 孔板中的培養(yǎng)基,加入1 mL 冰DPBS,將24 孔板放于冰上30 min 溶解基質(zhì)膠,用1000 μL 槍頭的移液槍重懸,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中,另外加入5 mL 冰DPBS,800 r/min、4℃離心5 min,小心的去除上清,再次用5 mL DPBS 重懸腸類器官,在同樣條件下再次離心,去除上清液,保留沉淀。然后按照每2 孔類器官加入200 μL RIPA 裂解液,冰上充分裂解后離心收集上清。

1.3.7 R-Spondin1 濃度對小腸類器官生長的影響

Wnt 激動劑R-Spondin1 與Lgr5 結(jié)合,是單個lgr5+小腸干細胞構(gòu)建小腸類器官的重要因素之一[1],然而,在腸類器官體外培養(yǎng)過程中R-Spondin1的濃度使用仍有爭議[15-16]。 在此我們通過在培養(yǎng)基中設(shè)置0.25 μg/mL、0.50 μg/mL、0.75 μg/mL 這3 個濃度梯度,通過在不同時間點對腸類器官的形態(tài)觀察,來探索R-Spondin1 的濃度對腸類器官形成的影響。

2 結(jié)果

2.1 合理的腸隱窩比例更有利于腸類器官的形成

小腸隱窩分離后,將懸液置于倒置顯微鏡下觀察,剛分離出的小腸隱窩在形態(tài)學呈短棒狀結(jié)構(gòu)(圖1A)。 短棒狀結(jié)構(gòu)較多,游離的細胞單較少,以圖1A 的標準分離出來的小腸隱窩與單細胞的比例關(guān)系培養(yǎng)后更易形成類器官。

2.2 小腸類器官的建立及傳代培養(yǎng)

剛分離出的小腸隱窩呈短棒狀(圖1A),分離培養(yǎng)后6 h 開始出現(xiàn)圓圈狀結(jié)構(gòu)(圖1B)；培養(yǎng)第2天,圓圈狀結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)出芽趨勢,中間可見管腔(圖1C)；培養(yǎng)第3 天小腸類器官變大,出芽更加明顯(圖1D)；培養(yǎng)后第4 天,小腸類器官體積變大且管腔壁明顯增厚,出芽數(shù)增多(圖1E)；培養(yǎng)后第5天,出芽數(shù)繼續(xù)增多(圖1F)；培養(yǎng)后第6.5 天形成圍繞中央管腔的花環(huán)狀結(jié)構(gòu),管腔中央脫落的細胞開始凋亡,顏色變深(圖1G),此時可進行傳代；切割傳代后觀察小腸類器官被切割成小腸類器官碎片(圖1H)；在與原代培養(yǎng)細胞相同的條件下,小腸類器官碎片在第4 天重新長成成熟的類器官結(jié)構(gòu)(圖1I),此時的小腸類器官可用于后續(xù)實驗。

2.3 Western blot 驗證蛋白提取方法有效

對提取的蛋白進行蛋白電泳,管家基因GAPDH表達如圖2 所示,這證實了上述蛋白提取方法是有效的,此模型作為疾病的模型,某種干預因素施加后,用上述方法提取蛋白可以在蛋白水平驗證干預因素對腸道上皮的影響。

圖1 小腸類器官的形成及傳代過程中的形態(tài)改變Note.A, Small intestinal crypts just separated.B, Small intestinal crypts have been cultured for 6 hours and have formed a circle structure.C,Small intestinal organoids started to bud after 2 days of culture.D, Small intestinal organoids on day 3 of culture.E, Increased number of small intestinal organoids budding on the 4th day of culture.F, Small intestine organoids on day 5 of culture.G, The small intestine organoids on the 6.5th day of culture present a characteristic floral ring structure.H, The small organoids pieces after passage.I, The mature small intestinal organoid structure is reformed on the fourth day after passage.Figure 1 Small intestine organoid formation and morphological changes during passage

圖2 Western blot 驗證蛋白提取有效Note.The protein was collected and analyzed by western blot,which showed that the housekeeping gene GAPDH was expressed, which confirmed that the protein extraction was effective.Figure 2 Western blot demonstrated that protein extraction was effective

2.4 低R-Spondin1 濃度小腸類器官的成熟受限

如圖3 所示,小腸隱窩分離后在含有低濃度的R-Spondin1 培養(yǎng)基中小腸隱窩的成圈時間無明顯差別,在后續(xù)的培養(yǎng)過程中低濃度的腸類器官大部分成為類球體,出芽數(shù)明顯減少,大部分不出芽。 在較高濃度的R-Spondin1 培養(yǎng)基中培養(yǎng)小腸類器官能順利出芽,且最終可以形成成熟的腸類器官,低于0.50 μg/mL 的R-spondin1 會影響腸類器官的成熟。 本研究還發(fā)現(xiàn)在低濃度R-Spondin1 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類球體在移入較高濃度的R-Spondin1 小腸類器官培養(yǎng)基中能重新成長為成熟的腸類器官。

3 討論

圖3 不同濃度R-Spondin1 小腸類器官形態(tài)比較Note.The small intestinal organoids were cultured under a concentration gradient of R-spondin1 at 0.25 μg/mL,0.50 μg/mL, and 0.75 μg/mL, and the morphological changes of small intestinal organoids were observed on day 1, day 3, and day 6.Figure 3 Comparison of morphology of small intestinal organoids with different concentrations of R-Spondin1

小腸上皮是單個細胞層,由增殖的隱窩和分化的絨毛組成,包括分泌細胞(如杯狀細胞和腸內(nèi)分泌細胞)、吸收細胞(如腸細胞)、潘氏細胞和干細胞等小腸細胞類型[17-18]。 小腸上皮的更新依賴于位于腸隱窩底部附近的腸道干細胞,它們快速分裂、運輸擴增的子細胞至隱窩的其余部分,并逐漸轉(zhuǎn)移至腸絨毛的側(cè)翼,在那里子細胞分化,吸收營養(yǎng),最終在絨毛頂端凋亡。 腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持主要依靠四條典型的信號通路控制：WNT[19]、Notch[20]、EGF、BMP[21]。 Clever 教授[1]通過在添加有EGF(表皮生長因子)、Noggin(頭蛋白)、R-spondin1 這些細胞因子的培養(yǎng)基中,3D 培養(yǎng)Lgr5 基因表達的腸道干細胞成功的完成了小腸類器官的構(gòu)建。 作為一種新興的模型,小腸類器官已經(jīng)獲得了廣泛的關(guān)注,因為小腸類器官的結(jié)構(gòu)包括大部分小腸上皮細胞類型[22],此外,單細胞測序顯示小腸類器官含有先前未鑒定的細胞亞型[23-24]。 因此,小腸類器官概括了自然組織的主要特征,這對于研究細胞類型的動態(tài)平衡和疾病狀態(tài)之間相互作用的復雜性具有很高的價值[25]。 小腸類器官相關(guān)病理檢測技術(shù)的發(fā)展也將推動小腸類器官體外培養(yǎng)體系的應用[26]。

然而國內(nèi)外關(guān)于小腸類器官的構(gòu)建現(xiàn)仍無統(tǒng)一標準,類器官構(gòu)建的難點在于細節(jié)的把控,小腸絨毛的處理不當、培養(yǎng)密度的大小以及污染等問題都會很大程度上的影響小腸類器官構(gòu)建的成功率。腸道上皮分離物中隱窩和游離單細胞的比例是后期培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵,本文通過用細胞計數(shù)板刮去小腸絨毛,多次吹打,過濾選定小腸隱窩數(shù)量較多而游離的單細胞較少的目標管進行培養(yǎng)。 通過取樣觀察在培養(yǎng)前建立了可以進行后續(xù)培養(yǎng)的腸隱窩與單細胞比例的標準(圖1A),這很大程度上提高了小腸類器官培養(yǎng)的成功率,避免了盲目培養(yǎng)帶來的實驗成本的增加。 在傳代過程中綜合使用了機械法和消化法兩種方法處理成熟的類器官,我們發(fā)現(xiàn)機械法在傳代過程中能更好的保持隱窩的數(shù)量及活性。 蛋白組學是基礎(chǔ)性研究的重要組成部分,小腸類器官由于其在三維條件下培養(yǎng),其蛋白提取過程與傳統(tǒng)的貼壁及懸浮培養(yǎng)大有不同,本研究中我們通過在低溫條件下溶解基質(zhì)膠成功的收集了小腸類器官,蛋白質(zhì)的成功提取將有助于研究干擾因素在蛋白層面對小腸道上皮的影響。 R-Spondin1作為小腸培養(yǎng)過程中重要的細胞因子,在此研究中我們發(fā)現(xiàn)當其濃度低于0.50 μg/mL 不利于腸類器官的成熟,因此使用合理的R-Spondin1 濃度也決定著小腸類器官培養(yǎng)的成功。

目前以類器官作為疾病的模型及前臨床模型已開始用于科學研究。 由于類器官作為疾病的前臨床模型在藥物開發(fā)、基因及細胞療法等方面有良好的應用前景,而國內(nèi)關(guān)于類器官的研究正處于起步階段。 本文繼續(xù)完善了小腸類器官的分離、培養(yǎng)、傳代、凍存和復蘇及蛋白提取工作,可以為小腸類器官的構(gòu)建及應用提供新的參考。