王 潔高嵩鈺朱仁心肖 良*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)(第二軍醫(yī)大學(xué))基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員五大隊十五隊,上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)(第二軍醫(yī)大學(xué))海醫(yī)系環(huán)境與勞動衛(wèi)生學(xué)教研室,上海 200433；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)(第二軍醫(yī)大學(xué))海軍醫(yī)學(xué)系,上海 200433)

新冠病毒以其極強的傳染性和高致死率引發(fā)了全球范圍內(nèi)的大規(guī)模疫情。 截至2021 年1 月12日12 時,全國累計報告確診病例97754 例,現(xiàn)有確診病例1454 例,境外輸入4443 例,海外現(xiàn)有確診病例25484895 例。 為了控制疫情的進(jìn)一步發(fā)展,急需快速有效針對新冠病毒的檢測手段。 針對這一問題,國內(nèi)外各研究團(tuán)隊和機構(gòu)開發(fā)出了不同的檢測手段,當(dāng)前市面上已有的新冠病毒的檢測手段主要有核酸檢測方法、免疫學(xué)檢測方法、病毒分離鑒定等,本文就各種檢測手段的背景原理、適用范圍以及優(yōu)缺點等方面作一綜述。

1 核酸檢測方法

目前,新冠病毒的實驗室檢測主要依賴核酸檢測。 核酸檢測在感染早期即可呈現(xiàn)陽性,但對于樣品保存、核酸提取的實驗條件、操作人員的熟練程度以及操作環(huán)境等都有較高要求,給大面積早期篩查和診斷帶來一定的困難。

1.1 全基因組測序

目前使用最為廣泛的一種基因測序技術(shù)為高通量測序(high-throughput sequencing, HTS),也叫做新一代測序(next generation sequencing, NGS)。其中,病原體宏基因組測序(mNGS)是目前臨床實踐中最常用的病原體基因測序方法。 它是一種基于新一代測序技術(shù)的無偏好性的技術(shù),可以一次性完成細(xì)菌、真菌、病毒以及各種病原體(例如寄生蟲)的檢測。 mNGS 技術(shù)首先需要將病毒RNA 制備成測序儀可以識別和分析的DNA 文庫,然后使用測序儀同時對數(shù)以百萬計的核酸序列進(jìn)行檢測。 檢測結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)軟件處理,最終展現(xiàn)出與病毒序列相關(guān)的信息。 2003 年鑒定SARS 耗時5 月余、2013 年鑒定H7N9 耗時1 月余,而在此次武漢的疫情爆發(fā)后短短2～3 周內(nèi),中國科學(xué)家就通過基因測序的方法鑒定出新型冠狀病毒,并成功繪制出其全基因組序列信息。 但因mNGS 技術(shù)操作較為復(fù)雜、檢測時間相對較長(24 ～72 h)、檢測靈敏度相對較低等原因,在檢測新型冠狀病毒上不易實現(xiàn)大范圍推廣和快速診斷[1]。 而Parabricks 軟件可輔助mNGS 技術(shù)檢測新冠病毒以應(yīng)對疫情,通過利用NVIDIA Parabricks 軟件的Genome Analysis Toolkit工具包以及GPU 加速計算,可以大幅度提高序列數(shù)據(jù)分析的速度[2]。 Parabricks 團(tuán)隊的軟件可以在一臺服務(wù)器上快速分析一個人的全部基因組變異,并且將分析時間縮短至1 h 以內(nèi)。 此次疫情的傳播速度是歷史上前所未有的,如此的效率提升將極大地促進(jìn)人們對病毒進(jìn)化和疫苗開發(fā)的了解。

1.2 RT-PCR

實時熒光RT-PCR,即實時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 它首先將提取的病毒基因組RNA 通過反轉(zhuǎn)錄變成互補DNA(cDNA),然后再用病原體特異性的引物,以cDNA 作為模板擴增病原體核酸序列,擴增的過程中熒光染料能同步整合在產(chǎn)物上,研究者可以通過熒光信號的強弱,進(jìn)行實時檢測。RT-PCR 診斷耗時短,檢測樣本多,結(jié)果判定簡單快速,檢測成本低,特別適合本次大面積流行的新冠肺炎疫情。 但是該檢測方法需要分子檢測實驗室和專業(yè)的儀器以及操作人員,操作不當(dāng)或者實驗室條件不足都可能會因氣溶膠污染而造成假陽性。

新冠病毒的檢測可以通過基于RT-PCR 的試劑盒進(jìn)行。 由華西醫(yī)院應(yīng)斌武教授團(tuán)隊與柯博文教授、耿佳教授團(tuán)隊合作自主研發(fā)的多重?zé)晒釸TPCR 檢測試劑盒以新型冠狀病毒ORFIab 基因和N基因中的保守序列為靶點,設(shè)計特異性引物和寡核苷酸熒光探針,以高特異性的操作對病毒核酸進(jìn)行檢測[3]。 該產(chǎn)品創(chuàng)新性構(gòu)建了防污染系統(tǒng),有效降低了產(chǎn)物氣溶膠的污染。 但是該試劑盒使用時不僅需要試劑本身,還需要運作RT-PCR 的精密儀器和經(jīng)過訓(xùn)練的操作人員。 而且,現(xiàn)有試劑盒中的試劑和測試條件可能沒有得到進(jìn)一步的優(yōu)化,這將會影響檢測本身的靈敏度和特異性,出現(xiàn)“假陽性”和“假陰性”結(jié)果。 所謂假陽性指的是體內(nèi)沒有病毒,卻檢測出了新冠病毒RNA,一般是系統(tǒng)污染造成的。 所謂假陰性指的是一個新冠肺炎患者應(yīng)該被確診為陽性,但卻未檢測到新型冠狀病毒RNA。 產(chǎn)生假陰性的原因可能包括：①因病毒變異,引物和探針不能識別變異后的序列。 ②采樣部位不含病毒或病毒含量較低,不能真實反映疾病情況。 ③提取核酸質(zhì)量差,或提取效率低,病毒核酸有損失。④試劑檢測下限不夠,或試劑性能、儀器設(shè)備穩(wěn)定性欠佳⑤實驗操作不當(dāng)。 為規(guī)避假陰性,可以從以下幾個方面做出改進(jìn)：①采集達(dá)到一定數(shù)量的病毒RNA：要求采樣部位含有病毒并且病毒含量要達(dá)到檢測的試劑下限。 可通過對疑似病人多個部位同時采樣或同一部位反復(fù)檢測來增加采集到病毒RNA 的幾率。 ②輔助CT 影像：CT 檢測只需幾分鐘,比較快捷。 但新冠肺炎是一種病毒性肺炎,其影像學(xué)表現(xiàn)與許多其他病毒性肺炎的影像學(xué)發(fā)現(xiàn)相似,因此難以做出鑒別診斷。 因此CT 影像診斷只能作為輔助手段檢測新冠病毒,在一定程度上規(guī)避假陰性。 以往使用RT-PCR 檢測盒檢測新冠病毒必須在中心實驗室進(jìn)行,檢測效率較低。 歐洲的Novacyt 公司開發(fā)的便攜式RT-PCR 儀器,能夠在2 h內(nèi)獲得檢測結(jié)果。 Qiagen 和Biomeme 公司也開發(fā)了將樣本處理和RT-PCR 檢測整合在一起的可移動檢測儀,讓對樣本的檢測更為自動化,并且可以在疫情一線進(jìn)行。

1.3 CRISPR

CRISPR 系統(tǒng)由向?qū)NA(gRNA)和Cas 蛋白組成,gRNA 能夠指導(dǎo)Cas 蛋白識別并切割帶有特異序列的RNA 或者DNA 分子。 Cas13a 蛋白在特異性切割靶標(biāo)RNA 時,會繼續(xù)切割非靶標(biāo)RNA,利用這一特點,在整個體系中加入帶有熒光標(biāo)記的RNA信號分子,當(dāng)帶有熒光的RNA 被切開時就會發(fā)出熒光信號。 該技術(shù)檢測時間相較于RT-PCR 更短,但是CRISPR 系統(tǒng)出現(xiàn)時間尚短,仍存在有脫靶的可能,其靈敏度和特異性還有待考證。

CRISPR 技術(shù)的先驅(qū)張峰教授的團(tuán)隊[4]使用基于CRISPR 的技術(shù)開發(fā)了一種檢測新型冠狀病毒RNA 的方法。 該方法僅需純化的核酸分子樣品,并且只需簡單的三個步驟即可在1 h 內(nèi)完成檢測。 它的優(yōu)勢在于不需要復(fù)雜的儀器,且最后的檢測在試紙上即可進(jìn)行。 此外, 新開發(fā)的工具利用了SHERLOCK 技術(shù),這套系統(tǒng)無論對RNA 還是DNA,靈敏度都達(dá)到了單分子級。

總體來看,僅通過從患者體內(nèi)分離和純化RNA,然后使用上述步驟,就預(yù)期能夠在1 h 內(nèi)進(jìn)行診斷,而無需各種復(fù)雜的設(shè)備。 但目前這一手段尚未用于檢測患者樣本,還不能直接用于臨床診斷。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(RT-LAMP)

環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)技術(shù)的特點是為目標(biāo)基因的特定區(qū)域設(shè)計特異性引物,并使用鏈置換DNA 聚合酶在恒溫條件下保溫數(shù)十分鐘以實現(xiàn)核酸擴增。 RT-LAMP 法具有擴增快、操作簡便、檢測簡便、檢測結(jié)果可直觀判斷等優(yōu)點,有助于COVID-19 的快速、可靠的臨床診斷。

沈陽化工大學(xué)尹秀山團(tuán)隊[5]開發(fā)了一種基于RT-LAMP 技術(shù)的新冠病毒檢測方法iLACO,可在15～40 min 內(nèi)快速檢測新冠病毒。 由于當(dāng)新冠病毒RNA 與反應(yīng)混合物中的pH 指示劑耦合時,可以通過觀察顏色的變化獲得檢測結(jié)果。 陽性反應(yīng)可導(dǎo)致pH 指示劑從粉紅色變?yōu)辄S色,陰性反應(yīng)時pH 指示劑仍保持粉紅色。

從方法學(xué)上來看,核酸檢測技術(shù)是最直接最本質(zhì)的病原學(xué)證據(jù),優(yōu)于其他臨床表現(xiàn)、臨床體征及CT 檢測等經(jīng)驗判讀。 這就是我們說病毒核酸檢測是確診感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”的原因。 但核酸檢測法的缺點在于：檢測程序較復(fù)雜,需要花費數(shù)小時,且檢測結(jié)果需要經(jīng)過復(fù)核,重復(fù)實驗則需要花費更多的時間,導(dǎo)致在確診之前,很多患者得不到及時的隔離和治療；此外,由于口咽拭子病毒含量較低、病毒RNA 易降解等原因,核酸檢測常出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

2 免疫學(xué)檢測方法

2.1 間接免疫熒光法

間接免疫熒光法以熒光素標(biāo)記抗球蛋白抗體,抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后,熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體與已結(jié)合的抗體發(fā)生作用,從而推知抗原或抗體的存在。 間接免疫熒光法因其方法簡便、特異性強、陽性與陰性樣品的信號強度對比明顯、能夠精確地判斷組織或細(xì)胞內(nèi)熒光的分布等優(yōu)點,成為各類呼吸道病原體的有效檢測工具。 其缺點是敏感性偏低、不能量化指標(biāo)、周期長。

呼吸疾病國家重點實驗室從一例新冠病毒感染重癥患者的糞便中成功分離出活的新冠病毒[6]。目前已利用間接免疫熒光實驗結(jié)果顯示患者血漿可識別該分離株感染細(xì)胞。

2.2 熒光免疫層析法

熒光免疫層析法是將免疫層析法與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法,通過熒光素所發(fā)的熒光即可在熒光顯微鏡下對抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。

目前,萬孚生物公司已成功研發(fā)出2019-nCoV新型冠狀病毒IgM 抗體檢測試劑(熒光免疫層析法)。 該試劑的優(yōu)點是全自動穿刺進(jìn)樣,封閉獨立操作,可最大程度避免產(chǎn)生氣溶膠,降低了對操作者和環(huán)境污染的風(fēng)險,可在10 min 內(nèi)完成檢測,可廣泛用于發(fā)熱門診、急診、門診檢驗、中心實驗室以及基層醫(yī)療等各級醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu),能快速分流病人和緩解臨床診療壓力[7]。

此外,由河南省生物工程技術(shù)研究中心王云龍教授團(tuán)隊成功研制出的全場景新冠病毒免疫熒光層析快檢試劑盒,只需患者一滴血就可在10 min 內(nèi)完成新冠病毒的快速篩查[8]。 該試劑盒可以無需設(shè)備,多種應(yīng)用場景快速、方便的篩查新冠病毒疑似感染人群。 與核酸檢測方式聯(lián)合應(yīng)用,可縮短檢測窗口期,提高陽性檢出率,在新冠肺炎的輔助診斷方面,具有十分重要的作用。

2.3 免疫膠體金層析技術(shù)

氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下,可聚合成一定大小的金顆粒,并由于靜電形成帶負(fù)電的疏水膠溶液,故稱膠體金。 膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷,可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合。

目前,由華西醫(yī)院應(yīng)斌武教授團(tuán)隊與柯博文教授、耿佳教授團(tuán)隊合作,自主研發(fā)了"新型冠狀病毒2019-nCoV IgG/IgM 抗體聯(lián)合檢測試劑盒(膠體金法)"診斷產(chǎn)品[9]。 該試劑盒采用肉眼觀察的方法,只需一滴血清、血漿或全血即可在10 min 內(nèi)完成所有測試,無需任何設(shè)備,操作簡單,可快速篩查可疑患者,從而提供了有效的排除手段。 但是此方法敏感性較低,如果材料等質(zhì)量有誤差,會影響檢測結(jié)果,也會因病人感染時間較短或者采樣部位導(dǎo)致病毒含量較低,導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。

2.4 IgG 及IgM 抗體免疫檢測

研究表明,新型冠狀病毒入侵人體3 ～5 d 后,其特異性IgM 抗體多會呈現(xiàn)陽性,隨后特異性IgG抗體開始由陰轉(zhuǎn)陽,且恢復(fù)期其滴度較急性期大幅增高。 因此,以檢測病人IgM 抗體和IgG 抗體為主的免疫檢測方法是核酸檢測方法的重要補充。

目前,南開大學(xué)科研團(tuán)隊成功研制出新冠病毒IgM/IgG 抗體聯(lián)合檢測試劑盒。 其中的快速測試卡可在15 min 左右完成檢測,具有操作簡便、容易判讀、靈敏度高等優(yōu)勢[10]。 但在感染早期,人體內(nèi)可能還沒有產(chǎn)生抗體,抗體檢測存在窗口期。 因此,抗體檢測可用于對核酸檢測陰性的病例進(jìn)行輔助診斷,也可以對病例進(jìn)行排查篩查,但不能代替核酸檢測方法。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附劑測定法是利用抗原與抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。冠狀病毒有四種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：S 蛋白、M 蛋白、E蛋白、N 蛋白。 針對SARS 冠狀病毒的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)N 蛋白是引起SARS 患者產(chǎn)生抗體的主要抗原。由于新冠病毒與SARS-CoV 的N 蛋白具有高度的序列相似性,據(jù)此推測,N 蛋白也可作為抗原用于新冠病毒的ELISA 法檢測[11]。 對新冠病毒的N 蛋白基因進(jìn)行擴增與克隆,構(gòu)建N 蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒,利用大腸桿菌得到大量重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物N蛋白,純化后的N 蛋白就可以作為抗原進(jìn)行ELISA檢測。

ELISA 檢測法的優(yōu)點是其臨床標(biāo)本容易采集,而且患者血清中一般不含冠狀病毒或者含量低,大大降低檢測人員感染風(fēng)險；有較高的特異性和靈敏度；儀器操作簡單[12]。 其缺點是血清中的IgG、IgM一般在感染后7 ～14 d 才會出現(xiàn),尚不能達(dá)到早期診斷的目的。

3 病毒分離培養(yǎng)

病毒培養(yǎng)是診斷流感病毒感染的傳統(tǒng)方法之一。 病毒分離培養(yǎng)可以在前期確定侵害性病原物起到關(guān)鍵作用,但是傳統(tǒng)的分離鑒定方法需要連續(xù)培養(yǎng)多天,敏感性和特異性都會低于核酸檢測方法,且較為耗時,不能滿足大量疑似患者篩查需求。

上海市疾病預(yù)防控制中心和復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室新型冠狀病毒攻關(guān)團(tuán)隊,利用病毒分離培養(yǎng)技術(shù)成功分離并鑒定出新冠病毒毒株[13]。 經(jīng)進(jìn)一步純化、擴增和鑒定后,該毒株將為新型冠狀病毒疫苗、抗病毒藥物研制和致病機理研究等提供重要的毒種資源,并可實時進(jìn)行藥物篩選及抗體中和試驗和對病毒變異的監(jiān)測。

4 其他方法

4.1 基因芯片技術(shù)

4.1.1 呼吸道疾病多病原體測序芯片

生捷科技公司和浙江清華長三角研究院共同研制了呼吸道疾病多病原體測序芯片,該芯片基于新一代原位合成超高密度基因芯片技術(shù),可以同時對包括新冠病毒在內(nèi)的100 多種病毒進(jìn)行高通量測序,實現(xiàn)精確檢測新冠病毒和其他常見呼吸道病原體[14]。 該測序芯片具備成本低、數(shù)據(jù)分析簡單的特點,非常適合作為臨床精準(zhǔn)診斷的輔助檢測工具。

4.1.2 全新微流控生物芯片

博奧生物研發(fā)成功的快速檢測呼吸道多病毒的全新微流控生物芯片,通過采集患者咽拭子、痰液等分泌物樣本,1.5 h 內(nèi)便可一次性檢測包括新冠病毒在內(nèi)的19 種呼吸道常見病毒[15]。 該芯片系統(tǒng)能達(dá)到快速確認(rèn)新冠病毒、同時排查其他引起相似癥狀病毒的目的,可以對大量就診人群實現(xiàn)快速及分類鑒別,從而大幅降低疑似病例數(shù)量。

4.2 快速檢測方法

ID NOW 是美國使用最廣泛的分子即時檢測技術(shù)之一,由于其易用性、便攜性和快速的結(jié)果,ID NOW 在COVID-19 大流行中為一線醫(yī)護(hù)人員提供了重要工具。 ID NOW 應(yīng)用RPA (recombinase polymerase amplification)技術(shù),利用專有酶和恒溫控制來實現(xiàn)快速的RNA 擴增。 這種成熟的分子系統(tǒng)將RNA 放大了數(shù)億倍,從而使病毒可在13 min 或更短的時間內(nèi)被檢測到。 目前ID NOW 檢測COVID-19 僅獲得FDA 在緊急使用下的授權(quán),可用于實驗室和患者護(hù)理場所[16]。

除此之外,以色列希伯來大學(xué)研究人員研發(fā)出一種比傳統(tǒng)方法更快速、材料更易得的新冠病毒檢測新方法。 該方法使用磁性納米粒子材料,可以更快從拭子樣本中提取核糖核酸分子,檢測速度是原有方法的4 至10 倍,且這種材料在以色列市場供應(yīng)充足,價格低廉[17]。

5 小結(jié)

在本次疫情中,可通過流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、核酸檢測、基因測序以及抗體檢測等手段來綜合判斷患者是否感染新冠病毒,但在檢測過程中要特別注意“假陽性”和“假陰性”的問題。 從目前來看,不同檢測方法均存在著各自的優(yōu)勢和弊端,只有綜合運用各種檢測工具,才能實現(xiàn)快速高效的檢測,縮短新冠患者的診斷周期。 目前新冠病毒的檢測方法追求的是檢測時間縮短、檢測步驟簡化、檢測成本降低、檢測環(huán)境安全、檢測結(jié)果精確,因此檢測方法的改進(jìn)依然值得進(jìn)一步地探索。