李雨真金春暉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無(wú)錫醫(yī)院,腫瘤科,江蘇 無(wú)錫 214071)

在我國(guó),胃癌(gastric cancer,GC)發(fā)病率隨著人口老齡化的越來(lái)越嚴(yán)重將成上升趨勢(shì),而它又是死亡率較高的惡性腫瘤[1-2]。 現(xiàn)如今,缺乏有效的抗腫瘤藥物是關(guān)鍵因素,故臨床前研究至關(guān)重要,動(dòng)物模型與其密切相關(guān)[3]。

現(xiàn)代研究表明,癌癥是一種高度異質(zhì)性疾病,是由細(xì)胞中基因組、表觀基因和轉(zhuǎn)錄組改變的結(jié)合引起,即使源于同一器官的腫瘤也存在著很大的差異性,所以腫瘤的精準(zhǔn)治療尤為重要[4]。 精準(zhǔn)腫瘤學(xué)是一種癌癥治療的策略,使用癌癥的分子譜分析來(lái)對(duì)患者進(jìn)行分層,尋找到疾病的原因和治療的靶點(diǎn),最終實(shí)現(xiàn)對(duì)于疾病和特定患者進(jìn)行個(gè)性化精準(zhǔn)治療的目的[5]。

傳統(tǒng)的細(xì)胞系腫瘤模型(cell line-derived xenograft,CDX)是將人體腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)、傳代,建立穩(wěn)定的細(xì)胞系后再注入免疫缺陷小鼠體內(nèi),然而該模型不能很好地保留原腫瘤的生物學(xué)特性[6],故實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)缺乏真實(shí)性與可靠性,無(wú)法提供腫瘤的精準(zhǔn)化治療策略。 于是,人源性異種移植模型(patient-derived xenograft model,PDX)應(yīng)運(yùn)而生,它與病人原始腫瘤的生物特征有很高的一致性的,比如,方天等[7]建立的肺癌PDX 模型與患者原代腫瘤有相同的組織學(xué)特點(diǎn)和排列結(jié)構(gòu),驗(yàn)證了在組織與基因水平上,PDXs 的患者腫瘤中有相當(dāng)程度的腫瘤特征可以被保留；再者,有研究表明在人群水平上,PDXs 與人類(lèi)癌癥的基因組圖譜非常相似,更廣泛地代表了患者間的多樣性[8-9]。 總之,它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)細(xì)胞系模型的不足,為腫瘤研究提供了新的平臺(tái)選擇。 本文總結(jié)了胃癌PDX 模型的建立方法,歸納了近幾年來(lái)的研究應(yīng)用,提出了建立胃癌PDX 模型的挑戰(zhàn),現(xiàn)綜述如下。

1 胃癌PDX 模型的建立方法

建立一個(gè)完整的PDX 模型主要取決于三個(gè)關(guān)鍵要素它們分別是移植樣本,工具小鼠以及移植部位的選擇。

1.1 移植樣本的獲取及保存

本文主要討論的是胃癌PDX 模型的建立,所以移植樣本自然是患者來(lái)源的胃腫瘤組織,可以在手術(shù)過(guò)程中獲得,也可以直接在胃鏡下活檢取得。 通常,從切除到植入的最佳時(shí)限是30 min～1 h[10]。 手術(shù)和活檢樣本應(yīng)立即放入預(yù)先裝有冷無(wú)菌培養(yǎng)基的收集管中,或者鹽水(0.9%氯化鈉)和標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基(例如RPMI 或DMEM)都是可以短期保存樣本的培養(yǎng)基。 但是,如果無(wú)法在最佳時(shí)限內(nèi)植入樣本,則應(yīng)將其保存在已證明可長(zhǎng)時(shí)間支持細(xì)胞生存能力的培養(yǎng)基中。 有研究表明,HypothermosolTM有助于維護(hù)腫瘤細(xì)胞活力長(zhǎng)達(dá)48 h[11]。 值得一提的是,在采集樣本及處理樣本時(shí),必須嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作,以防止污染,降低植入的失敗率。

1.2 工具小鼠的選擇

大量實(shí)驗(yàn)研究表明,具有免疫缺陷的小鼠更易接收樣本,然而市面上有四種免疫缺陷小鼠系,它們分別是裸鼠(nude mice)、重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(severe combined immunodefi-ciency mice, SCID)、非肥胖糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(non-obese diabeticmice/Severe combined immune deficiency mice, NOD/SCID)以及NOG 小鼠。 有研究者開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)腫瘤植入指數(shù)(tumor engraftment index,TEI)定量評(píng)估各種小鼠免疫缺陷的方法,用于幫助實(shí)驗(yàn)者們選擇合適的研究模型,其中,NOD-scid-IL2Rg-/-(NSG)的TEl 得分最高,即免疫缺陷程度最大,適合作為多種人源腫瘤組織的移植宿主[12],而NOD.Cg-Prkdc-scidIL2rgtm1Sug/JicCr1(NOG)小鼠的異種移植成功率高、生存時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)也是異種移植良好的模型[13]。

1.3 移植部位和方式的選擇

距離成功的最后一步便是選擇恰當(dāng)?shù)囊浦卜绞?較常見(jiàn)的有皮下移植、腎包膜移植以及原位移植。 皮下移植操作簡(jiǎn)便,且易于觀察和檢測(cè)移植瘤的大小,但移植失敗率較高,也無(wú)法適用于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究；腎包膜移植操作難度較大但成瘤率較高,現(xiàn)有研究表明七甲川菁染料(heptamethine cyanine dyes)具有腫瘤成像和靶分子的雙重功能,已經(jīng)可以用于篩選多個(gè)不同類(lèi)型的移植于腎包膜內(nèi)的PDX 模型,包括胃癌、肝細(xì)胞癌(hepatocellular,HCC)和腎癌(renal carcinoma, RCC)等[14]。 原位移植因其容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特性,所以常常用于建立胃癌轉(zhuǎn)移模型。 王潔等[15]利用臨床腫瘤標(biāo)本成功建立胃癌轉(zhuǎn)移模型并驗(yàn)證了移植瘤組織結(jié)構(gòu)與患者基本保持一致。

2 胃癌PDX 模型的研究應(yīng)用

2.1 個(gè)體化治療

胃癌PDX 模型已被證實(shí)其腫瘤在病理學(xué)特點(diǎn)、遺傳表征及對(duì)藥物反應(yīng)方面均與原發(fā)瘤保持高度一致[16],于是,“小鼠替身”的概念便被引入,它們代替病人去測(cè)試不同藥物方案的治療效果,從中篩選出最有效的治療方案,大大減少了患者因無(wú)效治療而損失的時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本。 眾所周知,曲妥珠單抗在改善HER-2 陽(yáng)性胃癌患者的治療效果中發(fā)揮了重要作用。 但是,一旦疾病進(jìn)展,就缺乏二線(xiàn)治療的證據(jù)。 受此啟發(fā),Aguilar-Mahecha 等[17]將一例HER-2 陽(yáng)性胃癌伴有肺肝轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行“阿凡達(dá)”試驗(yàn),以測(cè)試T-DM1 能否作為該患者的二線(xiàn)治療藥物。 其中治療決策由PDX 數(shù)據(jù)指導(dǎo),并用連續(xù)血液標(biāo)本ctDNA 標(biāo)記監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)。 研究結(jié)果表明,在治療選擇有限的患者中,使用PDX 模型識(shí)別個(gè)性化有效療法是十分可行的,并且ctDNA 的水平是反應(yīng)和疾病進(jìn)展的敏感預(yù)測(cè)指標(biāo),并且優(yōu)于CEA測(cè)試。

2.2 潛在靶點(diǎn)的驗(yàn)證與靶向藥物的研究

到目前為止,適用于胃癌患者的靶向治療藥物品種并不多,所以,潛在靶點(diǎn)的探索和新型靶向藥物的研究至關(guān)重要。 近幾年來(lái),PDX 模型為潛在靶點(diǎn)方面做出了不少的貢獻(xiàn)。 例如,Wang 等[18]建立了9 個(gè)PDX 模型,驗(yàn)證了一些關(guān)鍵分子如EGFR、HER-3、MET 和PDL-1,并在其中的一個(gè)PDX 模型中發(fā)現(xiàn)攜帶c-Met 或FGFR-2 基因擴(kuò)增的大部分胃癌患者可以受益于c-Met 或FGFR-2 靶向治療或聯(lián)合靶向治療。 Zhu 等[19]研究發(fā)現(xiàn)了抗CLDN18.2 ADC 和抗CLDN18.2 CD3 雙特異性分子對(duì)已建立的胃和胰腺腺癌患者來(lái)源的腫瘤具有療效,證實(shí)了CLDN18.2 是治療胃和胰腺腺癌的潛在藥物靶標(biāo)。Seo 等[20]首次報(bào)告GPR177 在胃癌患者中高表達(dá),建立胃癌PDX 模型表明GPR177 可作為預(yù)后標(biāo)志物的新型候選藥物,也是胃癌患者有治療希望的靶標(biāo)。 Zhang 等[21]通過(guò)PDX 模型驗(yàn)證了環(huán)狀RNA circNRIP1 的腫瘤促進(jìn)劑作用,發(fā)現(xiàn)circNRIP1 抑制劑可通過(guò)AKT1/mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)途徑阻斷胃癌細(xì)胞的惡性行為,為circNRIP1 抑制劑用于胃癌治療提供了依據(jù)。 Corso 等[22]建立了一個(gè)包括100 位患者來(lái)源的異種移植、原代細(xì)胞系和細(xì)胞質(zhì)的廣泛、多層次的胃癌模型平臺(tái)。 根據(jù)組織學(xué)、微衛(wèi)星穩(wěn)定性、Epstein-Barr 病毒(EBV)狀態(tài)和分子結(jié)構(gòu)對(duì)樣本進(jìn)行分類(lèi),從中鑒定了micro satellite instability(MSI)信號(hào)通路,并有助于進(jìn)展期胃癌的精準(zhǔn)治療。

與此同時(shí),一些新的生物標(biāo)志物也在PDX 模型中得到驗(yàn)證。 例如,Li 等[23]發(fā)現(xiàn)患者血漿cfDNA中羥甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine 5hmC)水平升高的基因富含PDX 模型血漿cfDNA 中5hmC水平較高的基因,驗(yàn)證了癌癥患者血漿cfDNA 與原發(fā)腫瘤的相關(guān)性,表明循環(huán)cfDNA 的5hmC 生物標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌和胃癌的預(yù)測(cè)能力很強(qiáng),優(yōu)于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物。 近期的一項(xiàng)研究建立胃癌PDX 模型驗(yàn)證了TfR1 是胃癌的潛在識(shí)別生物標(biāo)志物,并發(fā)現(xiàn)負(fù)載阿霉素的HFn 納米載體(doxorubicin HFn nanocarrier, HFn-Dox)對(duì)GC-PDX 腫瘤具有優(yōu)異的抗腫瘤作用,為疾病的診斷和治療提供了新的方法[24]。

PDX 模型在靶向藥物研究方面也發(fā)揮了自身的價(jià)值,例如,Chen 等[25]采用分子譜清晰的5 株人GC 細(xì)胞系和8 個(gè)患者源性異種移植瘤(PDX)模型評(píng)價(jià)阿法替尼的抗腫瘤活性和機(jī)制,發(fā)現(xiàn)阿法替尼對(duì)EGFR/HER2 高擴(kuò)增(拷貝數(shù)26) 或過(guò)表達(dá)(HC34)的PDX 模型具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用,為未來(lái)的臨床開(kāi)發(fā)阿法替尼作為單一療法或聯(lián)合治療胃癌提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

2.3 人-鼠共臨床試驗(yàn)

“共同臨床試驗(yàn)”結(jié)合了PDX 模型臨床前實(shí)驗(yàn)和患者Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)的一種研究,旨在開(kāi)發(fā)個(gè)性化抗癌治療的精密醫(yī)學(xué)[26]。 一項(xiàng)奧拉帕利(olaparib)和替莫唑胺(temozolomide)聯(lián)合治療方案在復(fù)發(fā)性小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)患者中的I/II 期研究以及在患者源性異種移植物(PDXs)中進(jìn)行生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合臨床試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)此方案在來(lái)自4 名患者的PDX 模型中的療效與在現(xiàn)實(shí)中看到的情況相同,并且在PDX 模型中對(duì)“OT”的敏感性和耐藥性的候選生物標(biāo)志物,也在患者樣品中得到了驗(yàn)證[27]。 然而遺憾的是,關(guān)于胃癌的相關(guān)研究寥寥無(wú)幾,可能與現(xiàn)在胃癌PDX 庫(kù)的PDX 數(shù)量較少有關(guān),所以,胃癌PDX 模型還有很大的前景,等待更多的研究者們?nèi)ヌ剿骱屯诰颉?/p>

3 建立胃癌PDX 模型的挑戰(zhàn)

3.1 淋巴瘤的轉(zhuǎn)化

與其他腫瘤PDX 模型不同的是,胃癌PDX 模型有著較高的淋巴瘤(lymph-gland, LT)發(fā)生率[28]。對(duì)于形成這些LT 的原因,不同的人有著不同的觀點(diǎn),一些人認(rèn)為是來(lái)源于患者的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的被激活和過(guò)度生長(zhǎng)[29]。 一些人認(rèn)為,在人體內(nèi)處于潛伏狀態(tài)的EBV 感染的B 細(xì)胞,在被移植到缺乏功能性免疫細(xì)胞的小鼠后,活化形成了淋巴瘤[22]。還有一些人認(rèn)為,慢性炎癥引起淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加,而胃癌病例中的基底炎癥發(fā)生率高,于是增加了胃癌PDX LT 的形成率[28-31]。 目前,有研究表明,常規(guī)利妥昔單抗給藥對(duì)減少肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)和肝細(xì)胞癌PDX 模型中淋巴瘤的產(chǎn)生效果顯著,但尚無(wú)有效的方法來(lái)預(yù)防EBV 相關(guān)的B 細(xì)胞淋巴瘤[32]。

3.2 建模時(shí)間長(zhǎng)

腫瘤異種移植通常需要漫長(zhǎng)的4 ～8 個(gè)月的等待,還需要產(chǎn)生足夠的組織來(lái)試驗(yàn)藥物療效。 而晚期患者并沒(méi)有足夠的時(shí)間也沒(méi)有足夠的金錢(qián),所以,縮短建模時(shí)間以及加快藥物敏感性測(cè)試顯得尤為重要。 對(duì)于前者,有學(xué)者提出以斑馬魚(yú)胚胎作為受體構(gòu)建胃癌PDX 模型可相對(duì)節(jié)約時(shí)間成本[33]；對(duì)于后者,有研究者開(kāi)發(fā)了一種miniPDX 模型,將患者來(lái)源的腫瘤細(xì)胞注入中空纖維膠囊內(nèi),快速有效地檢測(cè)藥物敏感性的方法[34]。 此方法在一例Mini-PDX 模型結(jié)合DNA-WES/RNA 分析指導(dǎo)轉(zhuǎn)移性十二指腸腺癌患者個(gè)體化治療的研究中得到驗(yàn)證[35]。

3.3 傳代不穩(wěn)定性

在連續(xù)傳代過(guò)程中,人類(lèi)基質(zhì)逐漸被小鼠基質(zhì)而取代,導(dǎo)致腫瘤的特殊調(diào)節(jié)機(jī)制以及諸如間質(zhì)液壓力等物理特性的改變,從而擾亂腫瘤微環(huán)境,使得相關(guān)藥物的研究存在較大的誤差[36]。 一項(xiàng)針對(duì)24 種癌癥的1110 個(gè)PDX 樣本的研究發(fā)現(xiàn),在PDX傳代期間獲得的拷貝數(shù)改變(copy number alteration, CNA)與患者腫瘤進(jìn)展期間獲得的拷貝數(shù)改變有所不同,于是基因組改變是否會(huì)對(duì)模型產(chǎn)生負(fù)面影響的問(wèn)題也隨之而來(lái)[37]。

3.4 無(wú)法評(píng)估免疫療法

如前所述,建立PDX 模型的關(guān)鍵之一是使用免疫缺陷宿主菌株進(jìn)行腫瘤植入和繁殖。 因此無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估免疫療法,例如疫苗和免疫調(diào)節(jié)劑以及激活抗腫瘤免疫系統(tǒng)的藥物療效[38]。 Lin 等[39]將人類(lèi)CD34 + HSPC 或PBMC 移植到CDX 或PDX 小鼠模型中,成功建立了PBMCs-CDXs,PBMCs-PDX和auto-PBMCs-PDX 人源化免疫重建小鼠系統(tǒng)模型,為藥物開(kāi)發(fā),評(píng)估免疫療法以及指導(dǎo)臨床決策提供有希望的平臺(tái)。

3.5 保存困難，耗費(fèi)較大

為了PDX 模型后續(xù)再移植效率的提高,實(shí)驗(yàn)室需要有長(zhǎng)期的低溫有效冷凍保存的條件。 并且,以該類(lèi)模型為基礎(chǔ)的腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究需要研究者投入大量的人力物力財(cái)力。 目前,全球已建成的PDX 庫(kù)包括美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NCI)的患者模型存儲(chǔ)庫(kù)、異種移植公共存儲(chǔ)庫(kù)(PRoXe)、歐洲EuroPDX 資源等大規(guī)模PDX 模型平臺(tái)[40],都是國(guó)家級(jí)多機(jī)構(gòu)平臺(tái)通過(guò)一系列復(fù)雜而困難的程序以確保實(shí)驗(yàn)方案的實(shí)施。 而人源性類(lèi)器官(patientderived organoids, PDOs)是經(jīng)過(guò)體外三維培養(yǎng)構(gòu)建的多細(xì)胞團(tuán),不僅能夠無(wú)限增值,還可以通過(guò)基因改造技術(shù),實(shí)現(xiàn)疾病模型的建立,相對(duì)PDX 模型來(lái)說(shuō)可以節(jié)省大量的時(shí)間與資源[41-42]。

4 總結(jié)

現(xiàn)如今,癌癥的研究朝著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展,強(qiáng)調(diào)個(gè)體化治療,但是在個(gè)性之中也別忽視了共性。 目前已有多個(gè)胃癌PDX 模型庫(kù),涵蓋了常見(jiàn)的病理類(lèi)型、甲胎蛋白AFP 分泌型及HER2 陽(yáng)性型[43],為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了良好的研究平臺(tái),但是,庫(kù)中模型數(shù)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床試驗(yàn)的需求,因此,更大樣本量的胃癌PDX 庫(kù)的建立需要后繼者們共同來(lái)完成。與此同時(shí),胃類(lèi)器官及胃癌類(lèi)器官與PDX 互相補(bǔ)充,聯(lián)合使用,進(jìn)一步完善了腫瘤體外及體內(nèi)的研究設(shè)計(jì)。 相信在不久的將來(lái),治療手段的豐富應(yīng)用,抗胃癌藥物的大量研發(fā)會(huì)使胃癌病人對(duì)疾病不再恐懼。