王子璇,商巾杰

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

蛋白質(zhì)的組裝被認(rèn)為是多肽一級(jí)序列本身固有特性的唯一結(jié)果. 然而,在某些情況下,需要來(lái)自其他蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息才能正確折疊并隨后組裝成寡聚物[1]. 這些“輔助”分子被稱(chēng)為分子伴侶,其中一個(gè)亞家族是伴侶蛋白[2],包括10 kDa和60 kDa蛋白質(zhì). 分子伴侶在原核生物、葉綠體和線(xiàn)粒體中大量存在,為正常細(xì)胞生長(zhǎng)所必需,且是應(yīng)激誘導(dǎo)的,在熱休克條件下起到穩(wěn)定或保護(hù)分解多肽的作用. 其中,Hsp60屬于一類(lèi)60-65 kDa的分子伴侶,是由14-18個(gè)亞基組成的雙圓環(huán)形狀蛋白結(jié)構(gòu)[3-4]. 一般來(lái)說(shuō),細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯后產(chǎn)生的多肽通過(guò)與Hsp10復(fù)合體相互作用,在Hsp60復(fù)合體的空腔中折疊成正確的蛋白結(jié)構(gòu),這一過(guò)程需要ATP的參與[5].

Hsp60屬Ⅰ類(lèi)分子伴侶,又被稱(chēng)為HSPD1或Cpn60,存在于線(xiàn)粒體中維持其蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài). 其在健康和疾病中發(fā)揮著多重作用,尤其是作為一系列獲得性和遺傳性疾病的致病因子[6-8]. 因其有望給分子伴侶疾病的診斷和治療方法帶來(lái)新的發(fā)展,如各類(lèi)癌癥、炎癥、自身免疫性疾病及一系列神經(jīng)退行性疾病[8-11],Hsp60抑制劑和調(diào)節(jié)劑可能會(huì)作為新型抗癌藥物發(fā)揮功能[12],近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Hsp60的研究興趣一直在穩(wěn)步增長(zhǎng).

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)作為模式生物,為分析高等真核生物的基因結(jié)構(gòu)和功能提供了極好的模型系統(tǒng). 相較于另一種模式生物——芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae),裂殖酵母細(xì)胞中熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式更為相似[13]. 目前對(duì)裂殖酵母中熱休克蛋白的研究還不多. 本文對(duì)粟酒裂殖酵母中Hsp60蛋白進(jìn)行了研究,經(jīng)生物信息學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn),Hsp60定位于線(xiàn)粒體基質(zhì). Hsp60蛋白水平在高溫刺激時(shí)顯著增加,而生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)其蛋白表達(dá)無(wú)影響,這也為今后利用Hsp60作為線(xiàn)粒體蛋白表達(dá)的參照物提供了理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

粟酒裂殖酵母yHL6381(h+leu1-32his3-D1ura4-D18ade6-M210),由南京師范大學(xué)微生物所實(shí)驗(yàn)室保存,培養(yǎng)基為YES(100 mL):3 g葡萄糖,0.5 g酵母粉,20 mg Adenine,20 mgL-histidine,20 mgL-leucine,20 mg Uracil.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

酵母粉購(gòu)自O(shè)XOID;Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum購(gòu)自Sigma-Aldrich;Western Blot 中使用的抗體購(gòu)自金斯瑞生物科技股份有限公司;其他常用試劑購(gòu)自南京丁貝生物科技有限公司.

S buffer:sorbitol 25.48 g,HEPES 0.9532 g,1 mol/L MgCl250 μL. 加80 mL超純水完全溶解,用KOH調(diào)節(jié)pH至6.5,用雙蒸水溶解至100 mL,4 ℃保存.

勻漿buffer:2 mol/L山梨醇 30.0 mL,1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)1.0 mL,0.1 mol/L EDTA 1.0 mL,10 mmol/L PMSF 1.0 mL,用雙蒸水溶解至100 mL.

SEM buffer:100 mmol/L MOPS(pH 7.2)10.0 mL,2.5 mol/L 蔗糖10.0 mL,0.1 mol/L EDTA 1.0 mL,用雙蒸水溶解至100 mL.

Extraction buffer:0.1 mol/L Na2CO3,1 mmol/L PMSF,1 μg/mL pepstatin,用NaOH調(diào)pH至11.5.

Solubilization solution:2% SDS,0.8% β-巰基乙醇,20% 甘油,50 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),0.02%溴酚藍(lán).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 線(xiàn)粒體的粗提取

取YES固體培養(yǎng)基上的酵母菌,接入5 mL YES中,30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h. 將培養(yǎng)的母液轉(zhuǎn)接至200 mL YES液體培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)起始OD600=0.2,30 ℃與37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,收菌. 用超純水和S buffer各清洗一遍菌體,離心收菌. 用S buffer重懸菌體,稱(chēng)重菌體,加入菌體質(zhì)量4倍的S buffer和1/10倍溶壁酶Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum,37 ℃ 200 r/min 孵育2～4 h,用顯微鏡觀(guān)察裂解情況,裂解至80%以上的酵母變圓后離心收菌,加入菌體4倍體積的預(yù)冷的勻漿buffer吹打混勻,將菌液轉(zhuǎn)移至Dounce組織勻漿器中,冰上研磨15-20次. 4 ℃ 4 000 r/min離心5 min,取上清液. 4 ℃ 5 000 r/min離心5 min,取上清液,重復(fù)一次. 4 ℃ 12 000 r/min離心5 min,棄上清液. 加5 mL SEM buffer,置于冰上吹打混勻. 4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,棄上清液. 沉淀為粗線(xiàn)粒體. 加1 mL SEM buffer,重懸沉淀,-80 ℃保存.

1.2.2 分離線(xiàn)粒體基質(zhì)蛋白與膜蛋白

取1.2.1中提取的粗線(xiàn)粒體,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,棄上清液. 加入預(yù)冷的Extraction buffer重懸線(xiàn)粒體,冰浴30 min,每10 min混勻一次. 冰浴結(jié)束后超速離心,4 ℃ 100 000 g離心1 h. 取上清液,4 ℃ 100 000 g再次超速離心1 h. 取上清液,加入等體積20%三氯乙酸溶液,冰上沉降15 min. 4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min,棄上清液,用1 mL預(yù)冷的丙酮重懸沉淀. 4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,棄上清液,于室溫?fù)]發(fā)丙酮. 加入Solubilization solution重懸沉淀,此時(shí)樣品為可溶性蛋白和與膜結(jié)合力弱的蛋白(S). 取第一次超速離心的沉淀,加入預(yù)冷的Extraction buffer重懸,4 ℃ 100 000 g超速離心1 h,棄上清液. 加入Solubilization solution重懸沉淀,此時(shí)樣品為疏水性膜蛋白(P). 蛋白樣品煮沸后可用于Western Blot檢測(cè),或-80 ℃保存.

1.2.3 Western Blot 檢測(cè)蛋白水平

取粗線(xiàn)粒體樣品,加入5×Protein Loading buffer后100 ℃煮沸10 min,上樣于12%聚丙酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳. 300 mA,90 min轉(zhuǎn)膜. Blocking buffer(0.137 mol/L NaCl,0.02 mol/L Tris,5%脫脂奶粉)封閉NC膜1.5 h. TBST(0.02 mol/L Tris,0.137 mol/L NaCl,0.1% Tween 20,調(diào)pH至7.4)振蕩清洗,加入一抗,4 ℃ 12 h或常溫2 h孵育,TBST清洗后,加入二抗,避光孵育1 h,ODYSSEY掃描顯示結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 Hsp60蛋白結(jié)構(gòu)分析

使用MitoProt II軟件預(yù)測(cè)Hsp60的線(xiàn)粒體定位序列(mitochondria targeting sequence,MTS),顯示其定位于線(xiàn)粒體信號(hào)肽為N端前33個(gè)氨基酸,具體序列為MVSFLSSSVSRLPLRIAGRRIPGRFAVPQVRTY,其中包含6個(gè)堿性氨基酸和6個(gè)羥基氨基酸殘基,但沒(méi)有酸性氨基酸殘基. 在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中,Hsp60蛋白存在一個(gè)Chaperonin Cpn60/TCP-1 family結(jié)構(gòu)域,其位置為第54到第558個(gè)氨基酸,如圖1所示.

MTS:線(xiàn)粒體定位序列圖1 Hsp60蛋白特征Fig.1 Protein features of Hsp60

使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)對(duì)Hsp60蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模,蛋白三維結(jié)構(gòu)模型的模板為HomosapiensHSPD1(SMTL id 4pj1.1),序列相似度為56.90%. Hsp60二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋(紫色)與β折疊(綠色)構(gòu)成,模型顯示了一種“美式足球”型中間物,有14個(gè)亞基,由兩個(gè)7亞基的分子伴侶環(huán)組成,如圖2所示.

紫色顯示α螺旋結(jié)構(gòu);綠色顯示β折疊結(jié)構(gòu)圖2 Hsp60蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.2 3D structure of Hsp60

2.2 生物信息學(xué)分析

本研究通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)了芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)與人類(lèi)(Homosapiens)的Hsp60的同源基因,并對(duì)其蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)比對(duì),如圖3所示. 可以發(fā)現(xiàn),在蛋白中段屬于 Chaperonin Cpn60/TCP-1 family結(jié)構(gòu)域中有大量相同序列與保守序列(黃色、藍(lán)色),而N端的線(xiàn)粒體定位序列部分有較大差異. 其中,Hsp60與人和芽殖酵母分別有56%或67%的同源性和71%或79%的同源性. 本研究在117—122位氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)高度保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)(GDGTTT/S),且在C端發(fā)現(xiàn)了一個(gè)富含Gly+Met的模體.

2.3 Hsp60蛋白定位

為了證實(shí)Hsp60的線(xiàn)粒體定位,首先通過(guò)粗提線(xiàn)粒體方法,用Hsp60自身抗體檢測(cè)其在不同細(xì)胞組分中的表達(dá)量. 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在線(xiàn)粒體(M)和全細(xì)胞蛋白(T)中可檢測(cè)得到Hsp60,除線(xiàn)粒體以外的部分(PMS)Hsp60信號(hào)極弱,說(shuō)明Hsp60定位于線(xiàn)粒體而不是細(xì)胞質(zhì)或其他組分,如圖4(a)所示.

黃色表示相同序列;綠色表示微弱相似度序列;藍(lán)色表示保守序列圖3 Hsp60同源蛋白序列比對(duì)Fig.3 Protein sequence alignment of Hsp60 homologous

T:全細(xì)胞;PMS:上清;M:粗提線(xiàn)粒體;S:上清;P:沉淀圖4 Hsp60定位于線(xiàn)粒體Fig.4 Hsp60 locates in the mitochondria

為進(jìn)一步探究Hsp60在線(xiàn)粒體中的定位,使用Na2CO3處理粗提線(xiàn)粒體. 使用Na2CO3處理線(xiàn)粒體后,線(xiàn)粒體膜會(huì)破碎,釋放出基質(zhì)蛋白,通過(guò)離心方法,即可分離線(xiàn)粒體基質(zhì)蛋白與膜蛋白. 若蛋白信號(hào)在上清(S)中能夠檢測(cè)得到,則說(shuō)明蛋白質(zhì)定位于線(xiàn)粒體基質(zhì);若蛋白信號(hào)在沉淀(P)中能夠檢測(cè)得到,則說(shuō)明蛋白質(zhì)定位于線(xiàn)粒體膜上. 檢測(cè)結(jié)果如圖4(b)所示,只有在粗提線(xiàn)粒體(M)和上清(S)中可檢測(cè)到Hsp60蛋白信號(hào),說(shuō)明Hsp60定位于線(xiàn)粒體基質(zhì)而不是線(xiàn)粒體膜上.

2.4 不同生長(zhǎng)條件下Hsp60蛋白表達(dá)量研究

本文檢測(cè)了野生型細(xì)胞在30 ℃和37 ℃條件下Hsp60蛋白水平,以及生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的蛋白水平,如圖5所示. 細(xì)胞在30 ℃和37 ℃培養(yǎng)12 h后,提取線(xiàn)粒體,檢測(cè)其Hsp60、Cox4蛋白的表達(dá)量,其中Cox4作為對(duì)照內(nèi)參. 可以發(fā)現(xiàn),Hsp60蛋白水平在37 ℃條件下顯著增加(見(jiàn)圖5(a)). 本文還檢測(cè)了細(xì)胞在正常生長(zhǎng)條件下的Hsp60蛋白水平. 細(xì)胞在30 ℃培養(yǎng)12 h、60 h后,提取線(xiàn)粒體,檢測(cè)其Hsp60、Cox4蛋白的表達(dá)量,其中Cox4作為對(duì)照內(nèi)參. 可以發(fā)現(xiàn),在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期Hsp60蛋白水平無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖5(b)).

LP:對(duì)數(shù)期;SP:穩(wěn)定期圖5 不同生長(zhǎng)條件下Hsp60蛋白表達(dá)量Fig.5 Hsp60 Protein expression at different temperatures

3 結(jié)論

本文經(jīng)生物信息學(xué)研究分析,發(fā)現(xiàn)裂殖酵母Hsp60是一類(lèi)高度保守的蛋白,其中部屬于Chaperonin Cpn60/TCP-1 family結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在人、芽殖酵母中都具有相似性. Chaperonin Cpn60/TCP-1 family結(jié)構(gòu)域在原核生物、真核生物中都十分保守,其蛋白家族包含兩種伴侶蛋白,一種為10 kDa伴侶蛋白(細(xì)菌中的Cpn10-或GroES),以6-8個(gè)相同亞基的環(huán)狀寡聚物形式存在;另一種為60 kDa伴侶蛋白(細(xì)菌中的Cpn60-或GroES),由2個(gè)堆疊的環(huán)組成,每個(gè)環(huán)包含7個(gè)相同的亞基,Hsp60屬于此類(lèi)伴侶蛋白.

Hsp60在N端含有線(xiàn)粒體定位序列,由細(xì)胞核基因編碼,在細(xì)胞質(zhì)中合成后定位于線(xiàn)粒體的蛋白質(zhì). 芽殖酵母中的HSP60會(huì)定位于線(xiàn)粒體并在線(xiàn)粒體內(nèi)正確加工為有功能的蛋白質(zhì)[14]. 人類(lèi)可以檢測(cè)到HSPD1在細(xì)胞中定位于線(xiàn)粒體基質(zhì)[15]. 除此之外,其定位還與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān),如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中HSPD1會(huì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累[16]. 本文通過(guò)提取細(xì)胞線(xiàn)粒體及使用Na2CO3處理線(xiàn)粒體,通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)蛋白水平,發(fā)現(xiàn)Hsp60定位于線(xiàn)粒體基質(zhì).

Hsp60作為一個(gè)高度保守的熱激蛋白,在不同的物種中已被廣泛研究. 在芽殖酵母中,當(dāng)細(xì)胞從25 ℃轉(zhuǎn)移到39 ℃條件下培養(yǎng)時(shí),Hsp60的mRNA水平會(huì)升高2～3倍[17]. 而在裂殖酵母中僅有文獻(xiàn)報(bào)道,25 ℃培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到35 ℃培養(yǎng)條件下時(shí),Hsp60的mRNA水平會(huì)瞬間升高,然后逐漸降低[18],而蛋白水平的變化還未知. 本文檢測(cè)了不同條件下Hsp60的蛋白水平,發(fā)現(xiàn)Hsp60在37 ℃熱激條件下,其蛋白表達(dá)量顯著增加,之后會(huì)輕微降低,這與mRNA水平一致,說(shuō)明Hsp60在高溫刺激下蛋白表達(dá)水平上升,是一個(gè)定位于線(xiàn)粒體基質(zhì)的熱激蛋白.

本研究發(fā)現(xiàn)在使用Western Blot方法研究不同生長(zhǎng)時(shí)期線(xiàn)粒體蛋白水平變化時(shí),Hsp60蛋白表達(dá)量保持不變,因此可使用Hsp60與Cox4作為內(nèi)參蛋白;由于Hsp60在熱激條件下表達(dá)量會(huì)顯著上升,在研究熱激條件下線(xiàn)粒體蛋白水平變化時(shí)應(yīng)使用Cox4作為內(nèi)參蛋白,而不能使用Hsp60. 本研究表明,Hsp60可以為研究線(xiàn)粒體蛋白不同生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量水平提供良好的內(nèi)參工具.