張 云,黃 鷹

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

線粒體是半自主性細胞器,包含自身的基因組mtDNA(線粒體DNA),編碼少部分線粒體蛋白質(zhì). 裂殖酵母的線粒體基因組有8個mRNA(表達蛋白分別為Cox1、Cox2、Cox3、Cob1、Atp6、Atp8、Atp9、Var1)、2個 rRNA和一個編碼tRNA 5′末端加工酶中RNA的組分rnpB. 線粒體由線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜組成[1],是細胞功能的核心. 多年來人們對于線粒體的研究重點一直放在其主要功能方面,即以ATP的形式為細胞提供大部分能量,然而線粒體在其他各種代謝過程中也是必不可少的,包括氧化磷酸化、氨基酸代謝和鐵硫團簇的形成[2-4]等. 包括人類和酵母在內(nèi)的各種生物體中,線粒體在調(diào)節(jié)細胞凋亡和衰老方面發(fā)揮著重要作用. 人類線粒體功能障礙會導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生,如糖尿病、心臟病和癌癥. 線粒體功能異常也與神經(jīng)退行性疾病有關(guān),如帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥和亨廷頓病[5-7].

酵母ATP合酶是一種旋轉(zhuǎn)的分子機器,主要負責(zé)產(chǎn)生ATP,為細胞生命活動提供能量. ATP合酶由17個不同的亞基組成,分為可溶性F1區(qū)段和膜嵌入F0區(qū)段[8]. F1區(qū)段的催化頭和F0區(qū)段中的膜集成式電機模塊通過兩個桿相連,即F1中央桿和F0外圍桿[9]. ATP合酶是真核細胞中最重要的酶之一,負責(zé)在有氧條件下合成真核細胞中90%以上的ATP. 大多數(shù)酵母ATP合酶亞基蛋白由細胞核基因組編碼,在胞質(zhì)核糖體上翻譯并被運輸至線粒體[10-11]. 酵母細胞作為研究ATP合酶的模式生物,便于研究者更加深入地了解ATP合酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、功能和生物發(fā)生過程[12].

芽殖酵母中Atp25蛋白的相關(guān)研究較為透徹,ATP25對于ATP合酶中ATP9mRNA穩(wěn)定性和Atp9蛋白的表達是必需的,ATP25缺失引起ATP9mRNA及其翻譯產(chǎn)物的缺失,從而阻止功能性F0的裝配,因而ATP25對ATP合酶功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要[13-15]. 粟酒裂殖酵母作為一種獨特的酵母,其與高等真核生物有許多共同的特征. 在裂殖酵母中,Atp25蛋白的定位及其對線粒體功能的影響尚未明確. 本文主要研究粟酒裂殖酵母中Atp25蛋白定位和參與線粒體功能的機制.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株:粟酒裂殖酵母單倍體菌株yHL6381(h+,his3-D1,leu1-32,ura4-D18,ade6-M210)、大腸桿菌EscherichiacoliTop10.

質(zhì)粒:pFA6a-KanMX6、pJK148、pYJ19.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:Tryptone 1g,Yeast Extract 0.5 g,NaCl 1 g,Agar Powder(固體)1.5 g,ddH2O 100 mL;YES培養(yǎng)基:Yeast Extract 0.5 g,Glucose 3 g,Adenine、Histidine、Uracil、Leucine各250 mg,Agar Powder(固體)2 g,ddH2O 100 mL;EMM-Leucine培養(yǎng)基:C8H5KO40.3 g,Na2HPO4·12H2O 0.555 g,NH4Cl 0.5 g,100×Salt Stock 1 mL,1 000×Vitamin 100 μL,1 000×Mineral Stock 10 uL,Adenine、Histidine、Uracil各250 mg,Glucose 2 g(單獨滅菌),Agar Powder(固體)2 g,ddH2O 100 mL;YES+3%甘油:Yeast Extract 0.5 g,Glycerinum 3 mL,Adenine、Histidine、Uracil、Leucine各250 mg,Agar Powder(固體)2 g,ddH2O 100 mL.

1.1.3 試劑與儀器

試劑:Proofast Siper-Fidelity DNA Polymerase購自ATG公司;4×Wiper Mix、5×Super Mix、SYBR qPCR Master Mix和產(chǎn)物純化試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成;質(zhì)粒提取試劑盒購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;3.5×MES、37.5%丙烯酰胺、10% APS、TEMED購自上海生工生物工程股份有限公司;Mitotrack線粒體染色劑購自南京丁貝生物科技有限公司;T4 DNA連接酶購自Takara公司.

儀器:Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng);Applied Biosystems儀器;上海知楚振蕩培養(yǎng)箱;垂直電泳儀;恒溫培養(yǎng)箱;高壓滅菌鍋;高速離心機;BIO-RAD Thermal Cycler PCR儀等.

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

采用生物軟件Vector NTI中AlignX進行蛋白序列分析;采用在線網(wǎng)站(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.hml)分析線粒體定位序列;采用在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu).

1.2.2 菌株構(gòu)建

通過查閱Pombase網(wǎng)站獲得atp25基因序列,在外顯子上下游設(shè)計引物,擴增得到上下游同源臂,通過酶切酶連將其構(gòu)建到質(zhì)粒pFA6a-KanMX6上,獲得重組質(zhì)粒. 以重組質(zhì)粒為模板PCR獲得上游同源臂、KanMX6、下游同源臂單一目的片段,經(jīng)過醋酸鋰轉(zhuǎn)化將目的片段導(dǎo)入野生型yHL6381菌株中,通過同源重組的方法獲得Δatp25菌株;PCR擴增atp25外顯子序列及其啟動子、終止子序列,將其構(gòu)建到質(zhì)粒pJK148上,獲得重組質(zhì)粒,NruⅠ限制性內(nèi)切酶分別切割重組質(zhì)粒、pJK148空載質(zhì)粒獲得線性片段并導(dǎo)入Δatp25菌株中,通過同源重組整合到Leu位點得到全長回補菌株Atp25、空載回補菌株P(guān)JK148;PCR擴增atp25外顯子序列將其構(gòu)建到質(zhì)粒pYJ19上,獲得重組質(zhì)粒,NruⅠ限制性內(nèi)切酶切割重組質(zhì)粒并導(dǎo)入Δatp25菌株中,通過同源重組整合到Leu位點得到Atp25-GFP菌株;構(gòu)建pPFA6a-上游同源臂-myc-hph-下游同源臂重組質(zhì)粒,PCR獲得單一目的片段,導(dǎo)入菌株yHL6381中得到Atp25-Myc菌株.

1.2.3 表型實驗

將菌株(yHL6381、Δatp25、PJK148、Atp25)分別接種至5 mL液體培養(yǎng)基YES中,30 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng);轉(zhuǎn)接至新鮮的YES中調(diào)整OD=0.2,振蕩培養(yǎng)過夜測量OD值,取菌液調(diào)整初始OD=3,進行10倍梯度稀釋,使用漩渦儀振蕩混勻,取3 μL菌液點圈至YES、YES+3%甘油固體板,倒放置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)天,拍照培養(yǎng)皿.

1.2.4 熒光定位實驗

將菌株Atp25-GFP接種至5 mL EMM-Leucine液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜,再轉(zhuǎn)接至新鮮的液體培養(yǎng)基中,調(diào)整OD=0.2,放入振蕩培養(yǎng)箱30 ℃、200 r/min培養(yǎng)7 h至OD=0.6～0.8之間,取約100 μL菌液離心,1×PBS清洗細胞3次,最后100 μL 1×PBS重懸細胞,加入1 μL Mitotrack Red染料,振蕩染色30 s,離心棄上清,10 μL 1×PBS重懸菌液,取2.5 μL制片,進行熒光觀察.

1.2.5 存活率測定

將yHL6381、Δatp25菌株接種至YES液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min過夜振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)接至新鮮的YES液體培養(yǎng)基,調(diào)整OD600=0.2,30 ℃、200 r/min培養(yǎng),每隔12 h取一次菌液,調(diào)整OD=3后進行稀釋,12 h、24 h、36 h稀釋10-4倍,48 h、60 h稀釋10-3倍,72 h稀釋10-2倍,取100 μL涂布于YES平板,重復(fù) 3組,30 ℃培養(yǎng)3 d,計算每個時間點下培養(yǎng)基中的菌落數(shù),得出不同時間點的存活率(不同時間點的存活率=不同時間點的活菌數(shù)/12 h的活菌數(shù)×100%).

1.2.6 Western-blot檢測Atp25蛋白線粒體定位

將Atp25-myc菌株接種至5 mL液體培養(yǎng)基YES中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜,再轉(zhuǎn)接至500 mL新鮮的液體培養(yǎng)基YES中,調(diào)整OD=0.2,培養(yǎng)一段時間待菌液OD=1左右,離心收集菌后,提取線粒體,通過Western-blot檢測Atp25蛋白的定位,其中Sla1蛋白、Hsp60蛋白分別為細胞核蛋白、線粒體基質(zhì)蛋白.

1.2.7 Western-blot檢測線粒體呼吸鏈蛋白表達水平

取兩份等量的yHL6381、Δatp25菌株的線粒體加入5×Protein loading buffer,第一份線粒體45 ℃溫浴 3 min 檢測Cox1、Cox3、Cob1蛋白;第二份線粒體100 ℃處理10 min檢測Hsp60、Cox2、Atp6蛋白;將樣品加至10% SDS-PAGE膠槽;電泳:80 V 0.5 h,120 V 1 h;轉(zhuǎn)膜(NC膜):300 mA,1.5 h;封閉液封閉1～2 h;TBST洗膜3次/5 min;一抗孵育2 h;TBST洗膜3次/5 min;二抗避光孵育1 h;TBST洗膜3次/5 min;Odessey Infrared Imaging儀器掃描結(jié)果.

1.2.8 qRT-PCR檢測線粒體呼吸鏈蛋白的mRNA水平

分別活化菌株yHL6381、Δatp25菌株,接種至5 mL液體培養(yǎng)基YES中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h,再轉(zhuǎn)接至10 mL新鮮的液體培養(yǎng)基中,調(diào)整OD=0.2,培養(yǎng)一段時間待菌液OD=1左右,Yeast RNA Kit 試劑盒提取酵母細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,以cDNA為模板進行qRT-PCR檢測線粒體呼吸鏈蛋白mRNA水平.

2 結(jié)果與討論

2.1 Atp25蛋白定位在線粒體

表1 Atp25蛋白線粒體定位序列(MTS)分析結(jié)果Table 1 MTS analysis results of Atp25 protein

2.1.1 生物信息學(xué)分析Atp25蛋白大小及線粒體定位

通過在線網(wǎng)站PomBase、Saccharomyces Genome Database(SGD),獲得粟酒裂殖酵母Atp25蛋白和芽殖酵母Atp25蛋白的氨基酸序列. 裂殖酵母Atp25蛋白由核基因組編碼,具有542個氨基酸,其分子量大小為62.62 kDa. 芽殖酵母Atp25蛋白具有612個氨基酸,分子量大小為70.43 kDa. Align X進行蛋白序列比對,結(jié)果顯示芽殖酵母Atp25和裂殖酵母Atp25的相似性為27.6%(見圖1). 在線網(wǎng)站MitoProt Ⅱ分析結(jié)果顯示Atp25蛋白定位在線粒體的概率為60.36%(見表1).

圖中加陰影及*的部分為完全相同序列圖1 ScAtp25和SpAtp25相似性比對結(jié)果Fig.1 The similarity comparison results of ScAtp25 and SpAtp25

2.1.2 熒光顯微鏡觀察Atp25蛋白線粒體定位

生物信息學(xué)分析結(jié)果預(yù)測Atp25蛋白定位在線粒體,為進一步驗證Atp25蛋白的定位,本文構(gòu)建了Atp25-GFP菌株(Atp25蛋白C端融合表達GFP標簽),通過熒光顯微鏡Green通道觀察Atp25蛋白在酵母細胞中的分布,然后利用Mito Tracker Red染料對Atp25-GFP菌株進行線粒體染色,線粒體在熒光顯微鏡Red通道下發(fā)出紅色熒光,將兩者進行Merge有非常高的黃色共定位,Atp25蛋白分布與線粒體分布相重合,表明Atp25蛋白定位在線粒體(見圖2).

圖2 熒光顯微鏡觀察Atp25-GFP與線粒體的共定位Fig.2 Fluorescence microscope observation for the localization of Atp25-GFP and Mito Tracker labeled mitochondria

圖3 Western-blot檢測Atp25蛋白定位Fig.3 Western-blot detection of Atp25 protein localization

2.1.3 Western-blot檢測Atp25蛋白線粒體定位

通過熒光顯微鏡可初步觀察Atp25定位在線粒體. 為進一步驗證,本文提取了Atp25-myc菌株的線粒體,在提取過程中保留T(全蛋白提取樣品)、Mt(線粒體蛋白樣品)和PMS(除線粒體外其他組分蛋白),以細胞核蛋白Sla1和線粒體基質(zhì)蛋白Hsp60作為對照. 如圖3所示,Western-blot結(jié)果顯示在線粒體樣品中檢測到Atp25蛋白,表明Atp25蛋白定位在線粒體,并在線粒體中發(fā)揮功能.

2.2 Δatp25菌株存在生長及呼吸缺陷

2.2.1 菌株的構(gòu)建

(1)Δatp25菌株的構(gòu)建及驗證

PCR獲得atp25上下游同源臂(圖4A和4B),上下游重組質(zhì)粒酶切驗證(圖4C和4D),將含有同源臂以及KanMX6目的片段醋酸鋰轉(zhuǎn)化導(dǎo)入野生型菌株yHL6381中,挑取轉(zhuǎn)化子進行驗證,設(shè)計驗證引物F1(上游引物的5′端)、R1(下游引物的3′端)、R2(KanMX6中間反向引物),使用引物F1+R1進行半長驗證(圖4E),使用F1+R2進行全長驗證(圖4F),結(jié)果顯示菌株構(gòu)建成功.

(2)全長回補菌株Atp25的構(gòu)建及驗證

PCR獲得atp25回補片段(圖4G);重組質(zhì)粒的酶切驗證(圖4H);NruⅠ酶切重組回補質(zhì)粒獲得線性片段導(dǎo)入到Δatp25菌株中,挑取轉(zhuǎn)化子驗證.

M:核酸Marker;A-F為Δatp25菌株的構(gòu)建:A-B分別為上游同源臂、下游同源臂;C為上游重組質(zhì)粒酶切驗證;D為下游重組質(zhì)粒酶切驗證;E-F為轉(zhuǎn)化子PCR驗證;G-H為回補菌株Atp25重組質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證.圖4 菌種的構(gòu)建與驗證Fig.4 Construction and verification of strains

2.2.2 Δatp25為呼吸缺陷型菌株

上述結(jié)果顯示Atp25蛋白定位在線粒體中. 為研究Atp25蛋白對線粒體功能的影響,將yHL6381、Δatp25、PJK148、Atp25菌株在YES、甘油培養(yǎng)基上點圈. 其中,YES為發(fā)酵型培養(yǎng)基,酵母細胞以無氧呼吸為主,不需要利用線粒體;3%甘油+0.1%葡萄糖為非發(fā)酵型培養(yǎng)基,酵母細胞進行有氧呼吸,完全依賴線粒體發(fā)揮功能. 通過表型實驗,研究Atp25蛋白是否參與線粒體呼吸作用. 結(jié)果顯示,YES培養(yǎng)基中這4株菌均正常生長;甘油培養(yǎng)基中,Δatp25、PJK148(對照菌)菌株生長緩慢,而全長回補菌株Atp25與yHL6381生長情況相同(圖5),表明Atp25蛋白缺失影響了酵母細胞正常的呼吸作用,Δatp25為呼吸缺陷型菌株.

2.2.3 Δatp25菌株存活率降低

研究結(jié)果表明Δatp25菌株為呼吸缺陷型菌株,為進一步研究Δatp25菌株的生長情況,將yHL6381、Δatp25菌株分別在YES培養(yǎng)基中培養(yǎng),每隔12 h進行平板菌落計數(shù). 結(jié)果顯示Δatp25菌株存活率顯著下降(圖6),表明Atp25蛋白缺失影響酵母細胞的正常生長,Δatp25菌株可能由于呼吸作用受損從而影響酵母菌的正常生長,因此Atp25蛋白對線粒體呼吸作用的正常發(fā)揮非常重要.

圖5 Δatp25菌株的表型結(jié)果Fig.5 Phenotypic results of Δatp25 strain

圖6 存活率測定結(jié)果Fig.6 Results of survival rate determination

2.3 Atp25蛋白缺失影響線粒體呼吸鏈蛋白表達水平

2.3.1 Δatp25菌株線粒體呼吸鏈蛋白表達水平下調(diào)

線粒體是通過有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場所,上述研究結(jié)果顯示Δatp25菌株不能在非發(fā)酵培養(yǎng)基上正常生長,表明Δatp25菌株為呼吸缺陷型菌株. 為進一步研究Atp25蛋白對線粒體呼吸作用的影響,本文利用Western-blot檢測yHL6381、Δatp25菌株線粒體呼吸鏈蛋白的表達水平,這些蛋白分別為電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ(Cob1)、Ⅳ(Cox1,Cox2,Cox3)、Ⅴ(Atp6)蛋白. Western-blot結(jié)果顯示Δatp25菌株中Cox1、Cox2,Cox3、Cob1、Atp6蛋白表達量顯著降低(見圖7),表明Atp25蛋白缺失影響線粒體呼吸鏈蛋白表達水平,從而影響裂殖酵母細胞正常的呼吸作用.

2.3.2 Δatp25菌株線粒體呼吸鏈蛋白mRNA水平無變化

上述研究結(jié)果顯示Δatp25菌株中線粒體呼吸鏈蛋白水平受到嚴重的影響. Atp25蛋白對線粒體呼吸作用非常重要,為進一步研究Atp25蛋白在轉(zhuǎn)錄水平對線粒體呼吸鏈蛋白的影響,本文通過qRT-PCR技術(shù)檢測yHL6381、Δatp25菌株線粒體呼吸鏈蛋白的mRNA水平,結(jié)果顯示Cox1、Cox2、Cox3、Cob1、Atp6的mRNA水平未受影響(見圖8),說明Atp25蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控線粒體呼吸鏈蛋白的表達,Atp25蛋白缺失導(dǎo)致線粒體呼吸鏈不能正常組裝,從而影響酵母菌正常的呼吸作用.

圖7 Western blotting檢測Δatp25菌株線粒體呼吸鏈蛋白表達量Fig.7 Western blotting for mitochondrial respiratory chain protein expression in Δatp25 strain

圖8 qRT-PCR檢測Δatp25菌株線粒體 呼吸鏈蛋白mRNA水平Fig.8 Detection of mitochondrial respiratory chain protein mRNA levels in Δatp25 strain by qRT-PCR

3 結(jié)論

裂殖酵母是一種單細胞生物,具有單倍體的優(yōu)點,可以很容易地進行基因操作. 裂殖酵母在生長、應(yīng)激反應(yīng)、細胞形態(tài)和細胞生物化學(xué)等方面具有豐富的遺傳表型多樣性[16]. 與芽殖酵母相比,RNA的剪接機制更類似于高等真核生物,裂殖酵母被認為是一種獨特的酵母,具有與哺乳動物細胞相似的特征,使裂殖酵母成為一個信息豐富和準確的真核分子生物學(xué)研究模型系統(tǒng)[17].

線粒體被稱為“細胞的發(fā)動機”,通過氧化磷酸化合成大量ATP,是細胞生命活動的主要能量來源. ATP的合成由ATP合酶復(fù)合體催化完成. 研究表明芽殖酵母Atp4蛋白和Atp10蛋白參與編碼ATP合酶F0亞基相關(guān)蛋白,參與線粒體的能量代謝過程并與線粒體ATP的產(chǎn)生密切相關(guān). 以裂殖酵母Atp4和Atp10蛋白參與線粒體功能的研究為出發(fā)點,探索其與線粒體的內(nèi)在聯(lián)系,為進一步研究Atp4和Atp10蛋白如何參與ATP合酶的組裝奠定基礎(chǔ)[18-19]. 芽殖酵母Atp25蛋白也是組裝ATP合酶的關(guān)鍵蛋白,Atp25蛋白由3個不同部分組成:N端MTS、與細菌Rsf相關(guān)的結(jié)構(gòu)域和穩(wěn)定ATP9mRNA的結(jié)構(gòu)域(M結(jié)構(gòu)域). 研究表明ATP25突變體中F0的功能性缺失與Atp9亞基的嚴重缺失有關(guān),芽殖酵母ATP25對于ATP9的表達是必需的,Atp25蛋白參與ATP合酶的膜扇區(qū)F0的組裝[20]. 通過序列比對和蛋白序列分析,粟酒裂殖酵母Atp25蛋白與芽殖酵母Atp25蛋白相似性達27.6%,且都含有RsfS、mRNA stabil結(jié)構(gòu)域. 芽殖酵母Atp25蛋白對于線粒體功能相關(guān)研究較為透徹,粟酒裂殖酵母中Atp25蛋白參與線粒體功能的機制尚不清楚.

本文主要研究粟酒裂殖酵母Atp25蛋白的定位和參與線粒體功能的機制,為進一步研究Atp25蛋白是否參與ATP合酶組裝提供理論基礎(chǔ). 首先通過熒光顯微鏡觀察和免疫印跡技術(shù)研究Atp25蛋白線粒體定位,說明Atp25蛋白在線粒體中發(fā)揮功能. 通過表型實驗研究Atp25蛋白與線粒體呼吸作用的關(guān)系,結(jié)果顯示Δatp25菌株為呼吸缺陷型菌株,通過測定Δatp25菌株的存活率,表明Atp25蛋白缺失縮短了酵母菌的生長壽命,Δatp25菌株可能由于呼吸作用受損從而影響酵母菌的正常生長,因此Atp25蛋白對線粒體呼吸作用非常重要. 進一步研究發(fā)現(xiàn)Δatp25菌株中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ(Cob1)、Ⅳ(Cox1,Cox2,Cox3)、Ⅴ(Atp6)蛋白水平顯著降低,線粒體呼吸鏈蛋白的mRNA水平未受影響,說明Atp25蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控線粒體呼吸鏈蛋白的表達,Atp25蛋白缺失導(dǎo)致線粒體呼吸鏈不能正常組裝,從而影響酵母菌正常的呼吸作用. 綜上所述,裂殖酵母Atp25是核基因組編碼蛋白質(zhì),在線粒體中發(fā)揮功能,對線粒體呼吸作用的正常發(fā)揮和酵母細胞的正常生長至關(guān)重要. 本文明確了粟酒裂殖酵母Atp25蛋白的定位以及對線粒體呼吸作用的重要性,為進一步研究Atp25蛋白提供理論基礎(chǔ).