段怡平 陳梁玥 柳家翠 黃奔 程慶元 馬甜甜 朱翠雯 秦菲

肝癌為常見(jiàn)的惡性腫瘤，以肝細(xì)胞癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）為主，肝癌病例數(shù)的增長(zhǎng)最為迅速，且5年總體生存率（overall sur?vival，OS）僅為18%。對(duì)于早期肝癌患者，手術(shù)切除仍是最主要的治療方法［1?2］，然而多數(shù)患者難以早期發(fā)現(xiàn)，且術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差［3］。因此，尋找新型有效的分子靶標(biāo)，對(duì)改善LIHC 的預(yù)后具有重要意義。6?磷酸果糖?2?激酶/果糖?2，6?二磷酸酶4（6?phosphofructo?2?kinase?fructose?2，6?bisphosphatase 4，PFKFB4），其編碼的蛋白質(zhì)可合成果糖2，6?二磷酸酯（Fructose?2，6?diphosphate，F(xiàn)26BP），刺激糖酵解［4］。PFKFB4在多種腫瘤過(guò)表達(dá)，以滿足癌細(xì)胞的生物需求。PFKFB4參與各種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞周期、自噬和轉(zhuǎn)錄調(diào)控［5］，且提示抑制PFKFB4表達(dá)可能是有效的癌癥治療策略［6］。近年來(lái)，有研究證實(shí)PFKFB4與乳腺癌［7］、小細(xì)胞肺癌［8］、膀胱癌［9］、胃癌［10］進(jìn)展密切相關(guān)，使患者預(yù)后較差。然而，PFKFB4在LIHC 發(fā)揮的作用和分子機(jī)理仍未闡明。本研究通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)探討PFKFB4在LIHC 患者中的預(yù)后價(jià)值，并預(yù)測(cè)其可能的分子機(jī)制，為L(zhǎng)IHC 提供新的分子靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載與預(yù)處理

在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome At?las，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）檢索并下載LIHC 的RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)（HTSeq?FP?KM，level 3）包括374 例腫瘤樣本和50 例正常樣本及424 例臨床數(shù)據(jù)。利用軟件Strawberry Perl 5.30.1 將基因表達(dá)數(shù)據(jù)整理成基因表達(dá)矩陣用于后續(xù)分析，并刪除臨床特征不明確和生存時(shí)間缺失的患者數(shù)據(jù)。

1.2 PFKFB4 表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)性分析

使用R 4.0.2 軟件提取PFKFB4在LIHC 組織樣本和正常組織樣本中的mRNA 表達(dá)量數(shù)據(jù)并分析比較兩組的表達(dá)水平差異，根據(jù)PFKFB4在LIHC 中的表達(dá)量中位值將患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組。通過(guò)IBM SPSS Statistics 25.0 軟件利用卡方檢驗(yàn)分析PFKFB4表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。利用R 4.0.2 軟件通過(guò)Kaplan?Meier 法分析兩組之間OS 的差異，使用單因素和多因素Cox回歸分析PFKFB4在LIHC 的預(yù)后價(jià)值。

利 用MEXPRESS 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//mex?press.be/）分析PFKFB4基因與臨床病理特征的聯(lián)系。同時(shí)，通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer?pku.cn/）、OncoLnc 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.oncolnc.org/）和Kaplan Meier?plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//kmplot.com/analysis/）驗(yàn)證PFKFB4的生存分析結(jié)果。

1.3 基因富集分析

利用GSEA 4.1.0 軟件以Molecular Signature Database（MsigDB）數(shù)據(jù)庫(kù)中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集作為功能基因集對(duì)PFKFB4進(jìn)行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法，隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)1 000 次，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。

使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO（本體論）富集分析，根據(jù)P?value 從小到大選取前十個(gè)富集通路作圖。

1.4 DNA 甲基化分析

通過(guò)MethSurv 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//biit.cs.ut.ee/methsurv/）對(duì)PFKFB4甲基化位點(diǎn)在LIHC 患者中的分布情況進(jìn)行分析，同時(shí)，利用UALCAN 在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析PFKFB4在LIHC 患者腫瘤組織和正常組織中的DNA 甲基化水平差異，再通過(guò)TCGA Wanderer 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//maplab.imppc.org/wanderer/）分析PFKFB4相關(guān)甲基化位點(diǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)、Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，將LIHC 患者的年齡、性別、TNM 分期等臨床指標(biāo)進(jìn)行量化賦值，利用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析，生存分析采用KM 法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFKFB4 在LIHC 組織中的表達(dá)

TCGA?LIHC 數(shù)據(jù)集分析顯示，PFKFB4在LIHC 樣本中的表達(dá)量高于正常樣本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1A?B）。UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果也顯示，PFKFB4在LIHC 組織中表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）（圖1C）。

圖1 PFKFB4 在LIHC 組織和正常組織的差異表達(dá)Figure 1 Differential expression of PFKFB4 in LIHC tissues and normal tissues

2.2 PFKFB4 表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性分析

PFKFB4表達(dá)水平與TNM 分期（P<0.05）和T分期顯著相關(guān)（P＜0.05）（表1）。Stage 分期Ⅱ、Ⅲ期的PFKFB4表達(dá)水平顯著高于Ⅰ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而Stage 分期Ⅳ期由于樣本數(shù)太少，故結(jié)果存在偏倚（圖2A）；T 分期的T2、T3、T4 期患者的PFKFB4表達(dá)水平均顯著高于T1 期患者的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2B）。MEXPRESS 分析結(jié)果顯示，PFKFB4的表達(dá)量與LIHC 患者的Stage 分期、樣本類型及患者OS 呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）（圖2C）。

2.3 PFKFB4 表達(dá)與LIHC 患者預(yù)后的關(guān)系

單因素和多因素Cox 回歸分析結(jié)果表明，PFKFB4（HR=1.91，95%CI：1.48～2.97，P<0.05）可以作為L(zhǎng)IHC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。在TCGA?LIHC 數(shù)據(jù)集中，在LIHC 患者中，PFKFB4高表達(dá)提示不良預(yù)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3A）。Kaplan Meier?plotter（HR=2.10，95%CI：1.33～2.73，LogrankP＜0.05）、GEPIA（HR=1.6，P＜0.05）和OncoLnc 在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果均顯示PFKFB4高表達(dá)與較差的OS 有關(guān)（圖3B?D）。

表1 PFKFB4 表達(dá)與LIHC 患者臨床病理特征的相關(guān)性分析［n（%）］Table 1 Relationship between PFKFB4 expression and clinicopathological characteristics of patients［n（%）］

圖2 PFKFB4表達(dá)量與LIHC患者臨床病理特征相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis between PFKFB4 expression and clinicopathological features of LIHC

表2 單因素和多因素Cox 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate cox regression analysis of PFKFB4 in LIHC

圖3 PFKFB4 表達(dá)在LIHC 中的預(yù)后分析Figure 3 Prognostic analysis of PFKFB4 expression in LIHC

2.4 GSEA 功能富集分析

在KEGG 數(shù)據(jù)集中，通過(guò)GSEA 分析預(yù)測(cè)，PFKFB4可能參與了DNA 復(fù)制、同源重組、堿基和核酸切除修復(fù)、細(xì)胞周期、RNA 降解和P53 信號(hào)通路（圖4A）。String 數(shù)據(jù)庫(kù)確定與PFKEB4相關(guān)性最強(qiáng)的50 個(gè)基因，利用GO 分析發(fā)現(xiàn)PFKFB4在糖酵解、細(xì)胞自噬和P53 介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程（BP）中可能發(fā)揮重要作用（圖4B）。

2.5 PFKFB4 基因甲基化分析

PFKFB4的甲基化位點(diǎn) cg16986746 和cg08568670 是LIHC 患者中甲基化水平最低和最高的兩個(gè)位點(diǎn)（圖5A），UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示其在LIHC 樣本中的整體甲基化水平比正常樣本低，并與PFKFB4的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（圖5B）。TCGA Wanderer 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFKFB4與LIHC 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的甲基化位點(diǎn)有6個(gè)，分別是cg04498104、cg25845890、cg01364498、cg14564247、cg12259140、cg17226356，均維持低甲基化修飾水平（P<0.05）（圖5C）。

3 討論

PFKFB4屬于雙功能酶家族，可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)6?磷酸果糖和F26P 的水平，而F26P 是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶1 的變構(gòu)激活劑［11］。PFKFB4控制著成年細(xì)胞的糖酵解速率，且在PI3K?AKT 信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用［12］。p53 可下調(diào)PFKFB4的表達(dá)，而PFKFB4的耗盡會(huì)減弱p53 缺陷細(xì)胞的合成活性，沉默PFKFB4可誘導(dǎo)體內(nèi)p53 缺陷癌細(xì)胞凋亡［6］。PFKFB4通過(guò)激活致癌類固醇受體共激活因子3 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄細(xì)胞重編程［7］，是癌癥快速增殖和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志［13］。PFKFB4在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞代謝及增殖，導(dǎo)致癌癥的惡化［10，14］。

增強(qiáng)的腫瘤糖酵解作用（Warburg 效應(yīng)）為促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移提供了代謝基礎(chǔ)，PFKFB4高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后很差，被證實(shí)是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子［15］。PFKFB4可抑制抑癌基因的表達(dá)，保證胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可作為胃癌潛在的分子靶標(biāo)［16］。PFKFB4在前列腺的小細(xì)胞癌組織中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖降解，與腫瘤的侵襲性相關(guān)，可能是重要的分子靶標(biāo)［17］。通過(guò)分析黑素瘤細(xì)胞系對(duì)低氧條件的反應(yīng)，對(duì)高表達(dá)和低表達(dá)PFKFB4的患者分別進(jìn)行Kaplan?Meier 生存分析，PFKFB4高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致黑色素瘤患者的預(yù)后不良［18］。癌癥的標(biāo)志之一是DNA 甲基化異常，這與基因表達(dá)異常有關(guān)。轉(zhuǎn)移性基因的低甲基化和激活是癌細(xì)胞的特征［19］，癌基因的低甲基化水平可激活癌基因高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，提示患者的不良預(yù)后。但仍未有研究探討PFKFB4在LIHC 的預(yù)后價(jià)值以及分子機(jī)制。

本研究通過(guò)分析結(jié)果提示著LIHC 的惡性進(jìn)展。生存分析結(jié)果顯示，PFKFB4上調(diào)的患者OS較差。Cox 回歸分析表明PFKFB4可作為L(zhǎng)IHC 的獨(dú)立預(yù)后因子。同時(shí)，功能富集分析發(fā)現(xiàn)PFKFB4可能參與了一些癌癥相關(guān)通路，為進(jìn)一步探索其在LIHC 發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

PFKFB4能促進(jìn)小細(xì)胞肺癌（Small Cell Lung Carcinoma，SCLC）的化學(xué)耐藥且與不良預(yù)后相關(guān)，可作為SCLC 潛在的治療靶點(diǎn)及化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素［8］。膀胱癌標(biāo)本中的PFKFB4高表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞代謝異常，阻斷PFKFB4的表達(dá)可能成為膀胱癌有效的治療策略，這為探索膀胱癌的治療方法提供了新的研究方向［9］。Hu 等人［20］證實(shí)PFKFB4是胰腺癌中蛋白酶體抑制劑的潛在生物標(biāo)志物，且可用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)。因此，可通過(guò)檢測(cè)PFKFB4表達(dá)量和甲基化水平，以判斷是否滿足使用分子抑制劑的條件，從而有效治療LIHC 患者。

綜上所述，PFKFB4在LIHC 中異常上調(diào)，其過(guò)表達(dá)和低甲基化水平也提示著患者較差的總體生存期及腫瘤的惡性發(fā)展，且主要參與糖酵解和P53等信號(hào)通路的調(diào)控。PFKFB4是LIHC 治療潛在的新型分子靶標(biāo)。