王曉娟,曹海泉,袁 寧,何明海

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院,南充市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科,南充 637000;2南充市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;3南充市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail:yixueyan2020@163.com)

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer,DFU)是糖尿病患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,與神經(jīng)病變、腎病、心肌病變、血管病變、酮癥酸中毒并列[1]。DFU創(chuàng)面愈合過程是一個(gè)復(fù)雜的、多階段的過程,由于各種復(fù)雜性,患者血管生成和再上皮化不足,嚴(yán)重炎癥是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)引起的另一個(gè)有害因素。此外,DFU是劇烈炎癥的結(jié)果[2]。由于糖尿病患者發(fā)生DFU的風(fēng)險(xiǎn)增加,導(dǎo)致生活質(zhì)量下降,生產(chǎn)力損失,也給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),患有DFU的2型糖尿病患者每年的直接和間接醫(yī)療費(fèi)用為13 561美元[3]。有證據(jù)表明導(dǎo)致傷口愈合延遲的各種因素包括血糖水平升高、胰島素抵抗增加、血管生成和膠原沉積減少、浸潤(rùn)反應(yīng)延遲、傷口部位血液供應(yīng)受阻、顆粒組織形成減少和血液黏度增加[4]。盡管在過去的幾十年里對(duì)DFU的研究取得了巨大的突破,但有效地治療DFU仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。有報(bào)道指出,維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果[5],但關(guān)于其對(duì)DFU創(chuàng)面修復(fù)的研究還尚未清晰,由此,本研究擬觀察維格列汀對(duì)DFU大鼠創(chuàng)面修復(fù)的影響,為其治療DFU提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年雌性SD大鼠45只,體質(zhì)量(210±10)g,購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(川)2019-031。飼養(yǎng)于恒溫(20-25 ℃)、恒濕(50%±5%)環(huán)境中,自然采光,自由飲水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組:空白組、模型組(糖尿病鼠足潰瘍)、維格列汀組,每組15只。

1.2 主要試劑及設(shè)備

維格列汀購自諾華公司(批號(hào):H20160037);IL-1β ELISA試劑盒(貨號(hào):ZC-36391)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào):ZC-36404)和TNF-α ELISA試劑盒(貨號(hào):ZC-37624)購自上海茁彩生物科技有限公司;蘇木素染液(批號(hào):C200301)、伊紅染液(批號(hào):C200403)購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。Collagen-Ⅰ(貨號(hào):ab260043)、Keap1(貨號(hào):ab139729)、Nrf2(貨號(hào):ab137550)、TGF-β(貨號(hào):ab215715)、α-SMA(貨號(hào):AF1032)一抗抗體購自英國(guó)Abcam公司;過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(上海晶天生物)、BMJ-A型包埋機(jī)購自常州郊區(qū)中威電子儀器廠;SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器有限公司;生化自動(dòng)分析儀(Beckman Coulter Inc.,愛爾蘭)。

1.3 糖尿病足潰瘍大鼠模型的建立及給藥

大鼠自適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,進(jìn)行模型制備,除空白組外,其余大鼠造模,造模前大鼠禁食12 h,但可飲水,造模大鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4-6周,大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg誘發(fā)罹患糖尿病,用藥72 h后,自尾靜脈微量采血檢測(cè)隨機(jī)血糖,當(dāng)血糖值超過16.7 mmol/L,即為糖尿病大鼠造模成功。隨后造模大鼠用10%戊巴比妥鈉麻醉,于大鼠的足背皮膚,以印章作3 mm×7 mm的矩形標(biāo)記,切除全層皮膚,75%酒精棉球消毒創(chuàng)面,形成足部皮膚潰瘍大鼠模型[6]。空白組大鼠始終予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),不進(jìn)行STZ注射,但進(jìn)行印章創(chuàng)口手術(shù)。大鼠創(chuàng)面造模成功后24 h,空白組和模型組予以等體積生理鹽水灌胃(2 ml/100 g),維格列汀組灌胃維格列汀(57 mg/kg),1次/d。分別連續(xù)給藥3,6,9 d,每組各取5只進(jìn)行取材,大鼠禁食12 h,用10%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉,剪取創(chuàng)面及周圍3 mm組織,將70%的組織迅速置于-20 ℃低溫冰箱保存,30%的組織用4%多聚甲醛溶液固定,待測(cè)。

1.4 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察

將4%多聚甲醛溶液固定的創(chuàng)面組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水,包埋,切片,放入蘇木精中染色約10 min,自來水沖洗使切片顏色變藍(lán),1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘,使細(xì)胞核呈紫藍(lán)色,1%氨水中數(shù)秒,至返藍(lán),1%伊紅染色3 min左右,脫水,透明,中性樹膠封存,鏡檢觀察組織病理變化。

1.5 生化參數(shù)測(cè)定

空腹動(dòng)物經(jīng)頸靜脈采集血樣,所有大鼠的血糖水平通過數(shù)字血糖儀獲得,采用生化自動(dòng)分析儀測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)濃度。

1.6 ELISA法檢測(cè)創(chuàng)面組織IL-1β、TNF-α和IL-6含量

取0.1 g創(chuàng)面組織,加入500 μl PBS研磨,12 000g4 ℃離心15 min收集上清液。分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔,空白孔不加樣品;標(biāo)準(zhǔn)品孔加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl,然后加入辣根過氧化物酶100 μl;待測(cè)樣品孔加入樣本50 μl,然后辣根過氧化物酶100 μl,37 ℃溫育60 min。隨后小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min后棄去,如此重復(fù)5次。按照ELISA試劑盒說明操作,最后每孔加終止液50 μl,終止反應(yīng),在15 min內(nèi),450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的濃度。

1.7 Western blot檢測(cè)創(chuàng)面組織Nrf2、Keap1、collagen-Ⅰ、TGF-β和α-SMA蛋白表達(dá)

取-20 ℃低溫冰箱保存的大鼠創(chuàng)面組織樣本,RIPA裂解液裂解,BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,樣品煮沸變性后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂玫攘康鞍踪|(zhì)上樣,選擇10%的SDS-PAGE進(jìn)行分離,分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉封閉1 h,封閉結(jié)束后按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕Y(jié)合一抗β-actin(1∶10 000)、Nrf2(1∶2 000)、Keap1(1∶1 000)、collagen-Ⅰ(1∶1 000)、TGF-β(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000),4 ℃孵育過夜后TBST清洗,然后選擇合適的二抗在室溫孵育1 h,TBST清洗,ECL暗室顯色。使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像,Image-ProPlus分析光密度,以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 維格列汀對(duì)潰瘍創(chuàng)面組織病理學(xué)變化的影響

空白組大鼠分別在給藥3,6,9 d真皮內(nèi)膠原纖維交錯(cuò)排列,成纖維細(xì)胞團(tuán)狀排列,胞質(zhì)紅染,皮下脂肪層及肌層結(jié)構(gòu)較清晰可見,細(xì)胞核形態(tài)正常。模型組大鼠在給藥后3 d創(chuàng)面組織內(nèi)表皮、真皮、皮下脂肪層大面積壞死脫落,細(xì)胞形態(tài)基本消失;給藥6 d創(chuàng)面組織內(nèi)表皮中復(fù)層扁平上皮層明顯增厚,表面覆有由變性壞死細(xì)胞及出血混合而成的痂皮,真皮層大量膠原纖維壞死和皮下脂肪層和肌層壞死;給藥9 d創(chuàng)面組織復(fù)層扁平上皮層明顯增厚,毛囊和皮脂腺等皮膚附屬器基本壞死消失,表皮表面覆有由變性壞死細(xì)胞及出血混合而成的痂皮,真皮層較多大量膠原纖維壞死,壞死區(qū)域可見較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。維格列汀給藥3 d創(chuàng)面組織內(nèi)表皮中復(fù)層扁平上皮層明顯增厚,表皮層細(xì)胞壞死,胞核崩解,見表皮表面覆有由變性壞死細(xì)胞及出血混合而成的痂皮;給藥6 d表皮層細(xì)胞壞死,表皮表面覆有由變性壞死細(xì)胞及出血混合而成的痂皮,真皮層較多膠原纖維壞死,出血;給藥9 d真皮層膠原纖維壞死區(qū)域可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維細(xì)胞增生,亦可見新生毛細(xì)血管形成,皮下肌層清晰可見,胞核形態(tài)正常,其他未見明顯病理變化;與模型組9 d相比,病理損傷明顯改變(見圖1)。

A.HE染色(×100) B.HE染色(×400)

2.2 維格列汀對(duì)潰瘍創(chuàng)面空腹血糖和血脂水平的影響

與空白組比較,給藥3 d,模型組TC、TG、HDL、LDL和GLU水平均無明顯變化(P>0.05);給藥6,9 d,TC、HDL和LDL明顯升高(P<0.05);與模型組比較,維格列汀給藥6,9 d,HDL和LDL水平明顯降低(P<0.05),而TC、TG和GLU水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

表1 各組大鼠空腹血糖和血脂水平變化

2.3 維格列汀對(duì)潰瘍創(chuàng)面炎癥細(xì)胞因子的影響

與空白組比較,給藥3,6,9 d模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯升高(P<0.05),與模型組比較,給藥9 d維格列汀組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低(P<0.05,見圖2)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 維格列汀對(duì)潰瘍創(chuàng)面Nrf2途徑的影響

與空白組比較,給藥3,6,9 d模型組Nrf2、collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA蛋白表達(dá)均明顯降低,Keap1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,給藥9 d維格列汀組Nrf2、collagen-Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);給藥6 d,Keap1蛋白表達(dá)明顯降低(見圖3)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

3 討論

糖尿病可影響皮膚損傷修復(fù)的止血、炎癥、增殖、成熟步驟,導(dǎo)致延遲修復(fù)或發(fā)展為慢性傷口,DFU是糖尿病最致命的并發(fā)癥之一,目前臨床上治療DFU的主要措施為降糖、降脂、抑制炎癥反應(yīng)等,但DFU的現(xiàn)有治療如改善感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度的肌醇,高壓氧治療等促進(jìn)創(chuàng)面愈合的療效有限[7]。研究證明維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果,可能是治療DFU的一種有前途的治療選擇[8]。因此,本研究評(píng)估維格列汀對(duì)糖尿病引起的傷口延遲愈合的潛在作用。在各種動(dòng)物模型中,STZ誘導(dǎo)的模型重復(fù)性較高,可模擬大多數(shù)延遲傷口愈合的臨床病理?xiàng)l件,包括再上皮化、傷口閉合和生長(zhǎng)因子形成[9]。研究報(bào)道傷口愈合是對(duì)創(chuàng)傷組織的一種反應(yīng),導(dǎo)致組織完整性的重建,因此,傷口收縮和閉合是開放創(chuàng)面愈合過程中的重要標(biāo)志,而創(chuàng)面模型的愈合階段在此過程中受到不同程度的影響[10]。與模型組大鼠相比,維格列汀組治療9 d創(chuàng)面膠原纖維排列整齊,成纖維細(xì)胞增多,新生血管形成,創(chuàng)面修復(fù)良好。研究指出改善創(chuàng)面愈合可以洞察疾病狀況[11]。在本研究中,維格列汀可明顯改善STZ引起的傷口延遲愈合。提示維格列汀能夠促進(jìn)DFU大鼠創(chuàng)面愈合,可成為治療DFU的潛在藥物。

血液循環(huán)中的葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡是由輸入葡萄糖速率和輸出葡萄糖速率之間的平衡來調(diào)節(jié)的。在正常情況下,胰島素抑制外周組織中葡萄糖的排出,但在糖尿病情況下,葡萄糖生成量增加,因此葡萄糖在循環(huán)中的出現(xiàn)超過了葡萄糖的消失,導(dǎo)致高血糖[12]。同樣,在本研究中,空白組大鼠有基礎(chǔ)水平的血糖,相反,DFU大鼠血糖水平升高,而維格列汀對(duì)DFU大鼠的血糖具有改善作用。維格列汀的有益作用可以歸因于改善胰島素敏感性,刺激葡萄糖代謝,并有助于將葡萄糖作為糖原儲(chǔ)存在脂肪細(xì)胞中,這種改善與維格列汀治療的DFU大鼠TC、TG和LDL水平的降低相一致,說明維格列汀具有良好的降血脂作用,這一觀察結(jié)果與大多數(shù)降血糖藥物具有改善糖尿病脂質(zhì)代謝異常的潛力是一致的[13]。研究顯示創(chuàng)面愈合作用機(jī)制可能有多種,包括促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移、加快膠原的成熟和減輕炎癥[14]。在生理?xiàng)l件下,活性氧有利于抵抗微生物的入侵,控制少量的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。然而,在糖尿病患者中,高血糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,從而使傷口愈合過程停止在不受調(diào)控的炎癥階段[15]。核相關(guān)因子2(Nrf2)是細(xì)胞防御機(jī)制的一部分,用于應(yīng)對(duì)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。在氧化損傷后,Nrf2從其細(xì)胞質(zhì)抑制因子Keap1中解離出來,與細(xì)胞核中編碼抗氧化酶的細(xì)胞保護(hù)基因結(jié)合,以刺激相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄,包括collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA[16]。Sun等[17]也證實(shí)Nrf2在糖尿病創(chuàng)傷愈合中起關(guān)鍵積極作用。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠創(chuàng)面愈合速度較慢,這是因?yàn)閯儕ZNrf2導(dǎo)致抗氧化防御反應(yīng)不足,提高了脂質(zhì)過氧化水平。而在維格列汀治療后,Nrf2被激活,進(jìn)而通過相關(guān)基因collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA使創(chuàng)面更快地縮小。研究報(bào)道[18]炎癥在傷口愈合過程中起著中心作用,血糖水平升高會(huì)導(dǎo)致過氧化物產(chǎn)生過多,從而刺激促炎介質(zhì)的釋放,臨床上糖尿病患者與局部傷口中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高有關(guān)。且文獻(xiàn)支持TNF-α和延遲愈合過程之間存在直接聯(lián)系[19]。此外,TNF-α可以抑制TGF-β的激活,從而抑制collagen-Ⅰ的增殖和合成,而IL-6的增加對(duì)血管生成有負(fù)面影響[20]。在本研究中,我們檢測(cè)了局部促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá),結(jié)果表明傷口愈合延遲與傷口區(qū)域炎癥反應(yīng)加重有關(guān),這與前人研究的發(fā)現(xiàn)一致[21]。而維格列汀的應(yīng)用明顯減少了傷口處的炎性滲入,表明其具有抗炎的潛力。

綜上所述,本研究結(jié)果證實(shí)了維格列汀對(duì)糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的潛在作用,維格列汀通過抑制炎癥標(biāo)志物(TNF-α、IL-6)、激活Nrf2、collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA發(fā)揮其潛能,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。