楊競霄,李菁華,李 煒,王芳芳,牛曉琳,王 靜,陳蕊蕊,王子寬*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科,西安 710038;2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院超聲科;3西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:wangzikuan@sohu.com)

心肌梗死是一種嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病,也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[1]。自從Jenning等[2]在60年前首次提出再灌注損傷的概念后,研究人員已經(jīng)對缺血再灌注損傷的機(jī)制有了非常深入的了解,最引人關(guān)注的主要包含離子通道障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、鈣超載和血管內(nèi)皮功能障礙等[3-6]。缺血再灌注損傷的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,不同信號通路都一定程度地參與了損傷的形成。然而,受到各種原因的限制,基礎(chǔ)研究并未能有效的轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。因此,尋找潛在的臨床治療藥物成為研究的重點(diǎn)。

葛根素(puerarin,Pue)是從葛根中提取的主要生物活性成分,化學(xué)名為8-β-D葡萄吡喃糖-4’,7-二羥基異黃酮[7]。在我國已被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病和糖尿病的治療[8]。研究表明,Pue對心肌缺血再灌注損傷具有重要的保護(hù)作用,其主要作用表現(xiàn)為改善耗氧量、降低心肌梗死面積和改善心臟舒張功能等[7,9,10]。先前的研究進(jìn)一步表明,這些保護(hù)作用可能與抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放、激活線粒體三磷酸腺苷(ATP)敏感鉀通道開放、激活鈣離子依賴的鉀通道和激活蛋白激酶C等有關(guān)[11]。以往的許多研究都集中在Pue的藥理學(xué)作用,Pue對心肌IR損傷的保護(hù)作用機(jī)制仍有待闡明。在心臟缺血再灌注損傷中,Pue對線粒體氧化應(yīng)激和線粒體能量代謝的作用還不清楚,本實(shí)驗(yàn)采用大鼠離體心臟缺血再灌注模型,探討Pue調(diào)控線粒體功能改善心臟缺血再灌注損傷的作用,這將為Pue成為臨床治療IR損傷的可能藥物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

從空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買30只雄性成年SD大鼠,體質(zhì)量在220-250 g之間;Pue和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購買于Sigma公司;在南京建成生物公司購買LDH、MDA、H2O2和ATP含量檢測試劑盒以及SOD活性檢測試劑盒。灌流液Krebs-Henseleit成分和含量如下:NaCl 120 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,CaCl21.25 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,Glucose 11 mmol/L,pH 7.4,用混合氣體(體積分?jǐn)?shù)95%O2/5%CO2)維持灌流液氧飽和度,并控制整個(gè)灌流過程中KH液溫度恒定為37 ℃。

1.2 離體心臟灌流和實(shí)驗(yàn)分組

腹腔注射10%水合氯醛(10 ml/kg)將大鼠麻醉,同時(shí)腹腔注射肝素(500 U/kg),麻醉好后立即剪開胸腔暴露心臟,沿主動(dòng)脈根部取下心臟并放入預(yù)冷的灌流液中,用結(jié)扎線快速固定在Langendorff灌流管口,打開三通閥使灌流液經(jīng)主動(dòng)脈根部逆行恒壓80 mmHg灌注離體心臟。在左心耳處剪口,將帶有球囊的導(dǎo)管在心臟處于舒張期時(shí)經(jīng)二尖瓣插入左心室,導(dǎo)管與壓力換能器連接并通過Labchart軟件記錄數(shù)據(jù)。通過調(diào)節(jié)球囊內(nèi)液體體積使左心室舒張末壓介于0-5 mmHg,等到心率和左室內(nèi)壓力穩(wěn)定后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分組。30只大鼠隨機(jī)分成3組。正常對照組(control):灌流液正常灌注160 min;缺血再灌注組(IR):全心缺血40 min,恢復(fù)灌流液灌注120 min;Pue處理缺血再灌注組(Pue+IR):全心缺血40 min,用含10 μmol/L Pue的灌流液灌注5 min,灌流液正常灌注115 min。

1.3 TTC檢測心肌梗死面積

灌流結(jié)束后,將心臟取下并凍存于-80 ℃冰箱30 min;等實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,全部心臟均按照心尖向心底部方向連續(xù)切6片厚度均一的薄片,將切片放入12孔板中并加入預(yù)冷的2% TTC溶液,37 ℃避光水浴15 min;然后放入盛有10%多聚甲醛的離心管中室溫浸泡2 d;將心臟切片按照一定順序排列并用數(shù)碼相機(jī)拍照,Image J軟件分析梗死面積。紅色區(qū)代表缺血心肌組織面積,白色區(qū)代表死亡心肌面積,心肌梗死面積百分比(%)=(梗死心肌面積/心肌總面積)×100%。

1.4 心臟功能的測定

實(shí)驗(yàn)全程用Labchart軟件實(shí)時(shí)記錄左心室內(nèi)壓力(left ventricular pressure,LVP),同時(shí)記錄左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)和左心室收縮峰壓(left ventricular peak systolic pressure,LVPSP)的數(shù)值。左室收縮和舒張功能分別用左室發(fā)展壓(LVDP)的大小和LVEDP的數(shù)值反映,而LVDP的大小由LVPSP和LVEDP的差值計(jì)算得來。

1.5 HE染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將心臟快速取下并放置于10%多聚甲醛溶液中固定,采用常規(guī)脫水復(fù)蠟步驟制備心臟蠟塊,并切成薄片。行常規(guī)HE染色方法,光鏡下觀察各組心臟纖維形態(tài)。

1.6 檢測冠脈流出液中LDH含量

根據(jù)南京建成生物公司提供的LDH的ELISA檢測試劑盒說明書,采集再灌注前5 min內(nèi)各組心臟冠脈流出液,按照試劑盒的步驟和要求采用酶標(biāo)儀檢測各組冠脈流出液中LDH的吸光值,并按照說明書將測量的LDH吸光值轉(zhuǎn)換成U/L來表示。

1.7 線粒體MDA、H2O2含量、SOD活性和ATP含量的檢測

剪取各組心臟左心室相同部位組織稱重,采用常規(guī)組織蛋白裂解方法,并采用BCA蛋白定量法將各組蛋白濃度調(diào)平,分別根據(jù)檢測線粒體MDA、H2O2含量、SOD活性和ATP含量的ELISA試劑盒步驟和要求,使用酶標(biāo)儀測量各組心肌組織線粒體中MDA、H2O2含量、SOD活性和ATP含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積和冠脈流出液中LDH含量的比較

與control組比較,IR組心肌梗死面積和冠脈流出液中LDH含量均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與IR組比較,Pue+IR組心肌梗死面積和冠脈流出液中LDH含量均顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖1)。結(jié)果提示,Pue可減輕IR引起的心肌損傷。

與control組比,##P<0.01;與IR組相比,**P<0.01

2.2 各組大鼠心肌纖維形態(tài)的比較

control組心肌纖維形態(tài)清晰,排列整齊;IR組心肌纖維斷裂明顯,排列混亂,細(xì)胞核逸出;而與IR組比較,Pue+IR組心肌纖維斷裂明顯減輕,細(xì)胞核逸出減少(見圖2)。結(jié)果提示,Pue可改善IR引起的心肌纖維排列紊亂,減輕纖維斷裂。

圖2 各組大鼠心肌纖維形態(tài)的比較(×400)

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的比較

與control組比較,IR組TUNEL染色顯示凋亡陽性細(xì)胞核明顯增多,凋亡率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與IR組比較,Pue+IR組TUNEL染色顯示凋亡陽性細(xì)胞核明顯減少,凋亡率降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖3)。結(jié)果提示,Pue可減輕IR引起的心肌細(xì)胞凋亡。

圖3 各組大鼠細(xì)胞凋亡的比較

2.4 各組大鼠心臟功能的比較

與control組比較,IR組心臟LVDP明顯降低,LVEDP顯著抬升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與IR組比較,Pue+IR組心臟LVDP明顯增加,LVEDP顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖4)。結(jié)果提示,Pue可以改善IR引起的心臟功能障礙。

與control組比,##P<0.01;與IR組相比,**P<0.01

2.5 各組大鼠心肌線粒體氧化應(yīng)激和ATP含量的比較

與control組比較,IR組線粒體MDA和H2O2含量顯著增加,SOD活性和ATP含量明顯降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與IR組比較,Pue+IR組線粒體MDA和H2O2含量明顯降低,SOD活性和ATP含量顯著增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖5)。結(jié)果提示,Pue可減輕IR引起的線粒體氧化應(yīng)激,增加ATP生成。

與control組比,##P<0.01;與IR組相比,**P<0.01

3 討論

快速恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)即再灌注是目前治療缺血引起的心肌損傷的最佳策略,但值得注意的是,再灌注恢復(fù)血液供應(yīng)的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致新的損傷,觸發(fā)心律失常,甚至發(fā)展為心力衰竭[12]。因此,如何在恢復(fù)缺血心肌再灌注的同時(shí)減輕其引起的額外損傷,并尋找有效的臨床治療藥物成為研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

Pue是一種異黃酮類化合物,是豆科植物野葛根中提取的最主要的活性成分,因其具有明確的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、抗細(xì)胞凋亡等藥理學(xué)作用,而被廣泛應(yīng)用于臨床心血管疾病的治療,而其作用機(jī)制在基礎(chǔ)研究中也得到了廣泛關(guān)注[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn),缺血后Pue處理可明顯改善IR損傷,表現(xiàn)為心肌梗死面積減小、冠脈流出液中LDH含量和細(xì)胞凋亡率降低;同時(shí)HE染色發(fā)現(xiàn)Pue可以減輕IR引起的心肌纖維斷裂。另外,心臟功能結(jié)果顯示,IR后Pue處理可以顯著提高左室收縮壓,降低左室舒張壓。以上這些結(jié)果進(jìn)一步明確了Pue抗心肌缺血再灌注損傷的作用。然而,Pue抗心肌缺血再灌注損傷的作用與線粒體氧化應(yīng)激的關(guān)系還不清楚。

心肌細(xì)胞內(nèi)含有數(shù)量龐大的線粒體可以產(chǎn)生大量ATP滿足其對能量的高度依賴,然而,缺血再灌注過程中出現(xiàn)的線粒體功能障礙加劇了心肌損傷,尤其是線粒體在能量代謝、ROS形成和凋亡啟動(dòng)等過程中發(fā)揮著重要作用[15-17]。MDA、H2O2和ROS在線粒體大量堆積,同時(shí)SOD活性被抑制,這會(huì)導(dǎo)致氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡的破壞,形成氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),IR組MDA和H2O2含量明顯增加,SOD活性降低,這說明氧化應(yīng)激程度加重,同時(shí),ATP含量明顯降低;而Pue處理IR后,可明顯降低MDA和H2O2含量,增加SOD活性,并提高ATP含量。這些結(jié)果證明Pue能夠減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷,增加ATP含量。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)從心肌梗死、心臟功能和細(xì)胞凋亡的角度進(jìn)一步證實(shí)了Pue具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用,并發(fā)現(xiàn)其是通過降低線粒體MDA和H2O2含量、增加SOD活性和ATP含量、抑制線粒體氧化應(yīng)激損傷來發(fā)揮作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為Pue成為臨床上潛在的防治缺血再灌注損傷的藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。