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長鏈非編碼RNA SPATA3-AS1在胃癌中的表達及意義

2021-02-16 04:03張鶴騰唐銀炳謝文杰陸佳偉汪貝貝侯雯躋周曉東蔣鵬程于強張文波鄒晨
關(guān)鍵詞:血漿標志物胃癌

張鶴騰,唐銀炳,謝文杰,陸佳偉,汪貝貝,侯雯躋,周曉東,蔣鵬程,于強,張文波,鄒晨

(1. 江蘇大學醫(yī)學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科,江蘇 鎮(zhèn)江 212002;3. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科,江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

胃癌死亡率高,是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因[1]。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)編制的2018年全球癌癥發(fā)病率和死亡率估算數(shù)據(jù)統(tǒng)計,胃癌發(fā)病率為5.7%,死亡率為8.2%[2]。在我國,胃癌已成為男性第二大(13.5%)常見癌癥及第三大(15.1%)癌癥相關(guān)死亡原因、女性第五大(7.1%)常見癌癥及第二大(11.1%)癌癥相關(guān)死亡原因[3-4]。通常早期胃癌無明顯癥狀,約80%患者在確診時已處于進展期,早期診斷及治療可以提高50%~70%患者5年生存率[5-6]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類由不同種類的RNA分子組成的不編碼或翻譯任何蛋白質(zhì)的長度大于200個核苷酸的功能性RNA分子,在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平均發(fā)揮重要的基因調(diào)控作用[7]。多種腫瘤的生物學行為與LncRNA功能失調(diào)密切相關(guān)[8-9],如LncRNA ELFN1-AS1促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲[10];LincRNA-ROR/miR-145軸通過靶向ZEB2誘導上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[11];LncRNA 91H通過與IGF2BP2相互作用調(diào)控IGF2表達,促進結(jié)直腸癌發(fā)生[12];在胃癌中LncRNA LOC400043通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路抑制胃癌進展[13];LncRNA-ATB[14]、LncRNA HEIH[15]、LncRNA PVT1[16]均在胃癌中表達上調(diào)并參與促進胃癌細胞的增殖、遷移、凋亡等;LncRNA AL139147.1在胃癌中呈高表達可促進胃癌細胞增殖[17];LncRNA HIF-1α和ANRIL在胃癌組織和患者血漿中均高表達[18]。

LncRNA SPATA3-AS1是人精子發(fā)生相關(guān)基因SPATA3的反義RNA,定位于染色體2q37.1,長度為3 526 bp。本課題組通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)SPATA3-AS1在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。為進一步研究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究對80例胃癌及癌旁組織和29例胃癌患者血漿中SPATA3-AS1的表達進行qRT-PCR檢測,隨后行細胞實驗研究SPATA3-AS1對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響和潛在機制。

1 病例和方法

1.1 研究對象

選擇2016年4月至2020年6月期間就診于江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科行胃癌根治術(shù)80例患者切除的癌組織與癌旁組織。術(shù)后病理檢查確診胃腺癌診斷,選取距腫瘤最遠邊緣>5 cm的胃組織為對照的癌旁組織。其中,男57例,女23例;年齡47~82歲,中位年齡67歲;腫瘤直徑≤5 cm者51例,>5 cm者29例;腫瘤TNM分期Ⅰ~Ⅱ期40例,Ⅲ~Ⅳ期40例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性40例,陽性40例。隨機收集上述29例患者清晨空腹肘正中靜脈血各5 mL,2 000 r/min室溫離心,取500 μL上層血漿于-80 ℃保存?zhèn)溆?。另選擇同期隨機選取的29例健康體檢者血漿。男23例,女6例;年齡47~77歲,中位年齡63歲;腫瘤直徑≤5 cm者14例,>5 cm者15例;Ⅰ~Ⅱ期10例,Ⅲ~Ⅳ期19例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性10例,陽性19例,本研究通過江蘇大學附屬人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒(海翊圣生物科技有限公司);FITC-Annexin V 及細胞凋亡試劑盒(上海通善生物技術(shù)有限公司);Transwell細胞遷移板(美國Corning公司);RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Thermo Fisher公司);人胃癌AGS、HGC-27細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心);胎牛血清(美國Gibco公司);胰蛋白酶(美國Amresco公司);Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司);RNA提取試劑盒、Trizol均購自上海一基實業(yè)有限公司。

1.3 qRT-PCR檢測SPATA3-AS1相對表達量

按制Trizol試劑說明書,提取標本、細胞及血漿中總RNA,檢測RNA濃度及純度,參照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。20 μL PCR反應(yīng)體系:DEPC水8.2 μL、SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL和各0.4 μL上、下游引物、cDNA 1 μL。每個樣本設(shè)3個復孔,SPATA3-AS1引物系列:上游為5′-CTTAAGGGGTCGCCTGAGTC-3′,下游為5′-GGCAGAAA GAAGCTGCCCTA-3′,以β-肌動蛋白作為組織和細胞的內(nèi)參基因,以U6作為血漿樣本的內(nèi)參基因,以-ΔCt值、-ΔΔCt值法計算相對表達量;qRT-PCR條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s,55 ℃退火30 s,40個循環(huán)。

1.4 細胞實驗

1.4.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組 細胞分為si-SPATA3-AS1組及si-NC組。分別在12孔板中接種處于對數(shù)生長期的AGS、HGC-27細胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度達60%~80%時行轉(zhuǎn)染。按說明使用Lipofectamine 2000試劑對AGS及HGC-27胃癌細胞進行轉(zhuǎn)染,每孔加入上述混合液100 μL及1 mL培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待培養(yǎng)48~72 h后回收。si-SPATA3-AS1序列為GCUGCUGGAACUGAAUAAATT,si-NC序列為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。

1.4.2 繪制細胞生長曲線、克隆形成實驗檢測胃癌細胞增殖水平 繪制細胞生長曲線:取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h的AGS、HGC-27細胞,胰蛋白酶消化并計數(shù),每組6個復孔,以1×104/孔濃度接種。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72 h更換一次培養(yǎng)基,光學顯微鏡下每天計數(shù)1次取平均值。連續(xù)計數(shù)5 d后進行細胞生長曲線的繪制。細胞克隆形成實驗:取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h的AGS、HGC-27細胞,胰蛋白酶消化,于6孔板中按103個/孔細胞數(shù)接種并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察細胞增殖情況。培養(yǎng)約10 d后出現(xiàn)肉眼可見的細胞集落時,用0.5%結(jié)晶紫染色15 min并拍照及計數(shù)。

1.4.3 Transwell實驗檢測AGS、HGC-27細胞遷移與侵襲 細胞遷移實驗:取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h的AGS、HGC-27細胞,調(diào)整細胞濃度約為1×105/mL。在Transwell 小室,上室每孔接種細胞數(shù)為2×104個,并在各對應(yīng)下室中每孔加入等量含血清培養(yǎng)基,孵育24 h;棉簽擦去上室未遷移細胞,細胞用0.5%結(jié)晶紫染色15 min并拍照。細胞侵襲實驗:將無血清培養(yǎng)基與Matrigel按7 ∶1比例混合稀釋;用基質(zhì)膠以50 μL/孔包被Transwell小室底部膜的上室面后放置于24孔板中,培養(yǎng)箱孵育2 h;余步驟同遷移實驗。

1.4.4 流式細胞凋亡實驗檢測胃癌細胞凋亡水平 取“1.4.1”轉(zhuǎn)染48 h后細胞并重懸,調(diào)整細胞密度為2×105/mL,加入FITC-Annexin V和Propidium iodide試劑,暗箱靜置15 min,流式細胞儀檢測胃癌細胞凋亡數(shù)。

1.4.5 qRT-PCR檢測敲減SPATA3-AS1后腫瘤相關(guān)mRNA表達 按制Trizol試劑說明書,取“1.4.1”轉(zhuǎn)染胃癌細胞,分別提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,其余步驟同“1.3”。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量,每個樣本設(shè)3個復孔,引物序列見表1。

表1 腫瘤相關(guān)基因引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 SPATA3-AS1在胃癌組織中表達及與臨床病理特征分析

qRT-PCR結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,胃癌組織中SPATA3-AS1相對表達量明顯上調(diào)(t=2.183,P<0.05)。見圖1。根據(jù)胃癌組織中qRT-PCR檢測結(jié)果,取SPATA3-AS1相對表達量的中位數(shù)為分界值,將胃癌組織分為SPATA3-AS1高表達組(n=40)和低表達組(n=40)。胃癌組織中SPATA3-AS1相對表達與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)、TNM分期 (P=0.007)及腫瘤浸潤深度(P=0.043)相關(guān),而與其他因素無關(guān)(P均>0.05)。見表2。Kaplan-Meier分析顯示,與低表達組相比,SPATA3-AS1高表達組患者5年生存率明顯降低(HR=2.292,95%CI:1.143~4.597,P=0.020)。見圖2。

2.2 SPATA3-AS1在血漿中的表達與臨床意義

與健康體檢者相比,胃癌患者血漿中SPATA3-AS1表達水平顯著增高(t=4.156,P<0.05)。見圖3。SPATA3-AS1表達與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05),高表達者具有較多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較高的腫瘤TNM分期。見圖4。此外,利用ROC曲線評估SPATA3-AS1在血漿中差異表達的敏感性及特異性,其曲線下面積為0.788,提示該指標具有較好的診斷價值。見圖5。

圖1 胃癌及癌旁組織中SPATA3-AS1表達水平比較

表2 胃癌患者癌組織中SPATA3-AS1的表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 SPATA3-AS1表達水平與胃癌患者生存率的相關(guān)性

圖3 胃癌患者與健康者血漿中SPATA3-AS1相對表達水平比較(n=29)

圖4 胃癌患者血漿SPATA3-AS1表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖5 胃癌患者血漿中SPATA3-AS1的ROC曲線

2.3 敲減SPATA3-AS1對細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

2.3.1 敲減SPATA3-AS1對細胞增殖的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示,與si-NC組相比,AGS、HGC-27細胞si-SPATA3-AS1組中SPATA3-AS1表達明顯降低(P均<0.01),證實敲減效果滿意。見圖6。細胞生長曲線結(jié)果顯示,與si-NC 組相比,AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組胃癌細胞數(shù)分別從第3天及第4天明顯減少。見圖7。計數(shù)及克隆形成實驗顯示,與si-NC 組相比,AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組細胞克隆形成率明顯降低(P均<0.01),由此表明,敲減SPATA3-AS1抑制AGS、HGC-27細胞增殖。見圖8。

2.3.2 敲減SPATA3-AS1對細胞遷移的影響 Transwell實驗顯示,與si-NC對照組相比,AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組細胞遷移能力均顯著降低(t=10.21,11.08,P均<0.01)。見圖9。

2.3.3 敲減SPATA3-AS1對細胞侵襲的影響 Transwell實驗顯示,與si-NC對照組相比,AGS、HGC-27細胞中si-SPATA3-AS1組細胞侵襲能力顯著降低(t=12.88,10.30,P均<0.01)。見圖10。

圖6 qRT-PCR檢測敲減SPATA3-AS1后 AGS、HGC-27細胞中SPATA3-AS1的表達

圖7 敲減SPATA3-AS1后AGS和HGC-27細胞的生長曲線

圖8 細胞平板克隆形成實驗檢測各組AGS和HGC-27細胞增殖

圖9 Transwell 實驗檢測AGS和HGC-27細胞遷移能力

圖10 Transwell實驗檢測AGS和HGC-27細胞侵襲能力

2.3.4 敲減SPATA3-AS1對細胞凋亡的影響 Transwell實驗顯示,與si-NC對照組相比,AGS、HGC-27細胞si-SPATA3-AS1組細胞凋亡能力均顯著升高(t=11.07,9.94,P均<0.01)。見圖11。

圖11 流式細胞儀檢測AGS和HGC-27細胞的凋亡

2.4 敲減SPATA3-AS1對腫瘤相關(guān)基因mRNA表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示,在AGS、HGC-27細胞株中,與si-NC對照組相比,si-SPATA3-AS1組EMT相關(guān)標志物發(fā)生顯著改變,其中間質(zhì)標志物N-cadmRNA顯著下調(diào),同時上皮標志物E-cadmRNA 顯著上調(diào),與此同時轉(zhuǎn)錄因子Twist1、SnailmRNA表達明顯降低(P<0.05或<0.01),而其他相關(guān)基因mRNA表達無明顯差異。見圖12。由此提示,SPATA3-AS1可能通過EMT途徑調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),相較于癌旁組織和健康者血漿,SPATA3-AS1在胃癌患者癌組織和血漿中的表達明顯上調(diào),且與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。其中,高表達SPATA3-AS1患者生存率低于低表達患者,提示SPATA3-AS1可能預(yù)測胃癌患者遠期生存率。此外,ROC曲線下面積為0.788,提示SPATA3-AS1作為胃癌診斷指標具有較高的價值。體外細胞實驗結(jié)果表明,相比于陰性對照組,敲減SPATA3-AS1處理后的胃癌細胞侵襲、遷移、增殖能力均降低但細胞凋亡增加,說明SPATA3-AS1促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。

a:P<0.01,b:P<0.05,與si-NC組相比

為進一步研究SPATA3-AS1 在胃癌細胞生物學表型中的調(diào)節(jié)作用,本研究對腫瘤相關(guān)基因進行篩查。qRT-PCR結(jié)果顯示,敲減SPATA3-AS1顯著抑制轉(zhuǎn)錄因子Twist1、SnailmRNA和間質(zhì)標志物N-cadmRNA表達,同時促進上皮標志物E-cadmRNA表達,提示SPATA3-AS1可能通過EMT途徑促進胃癌細胞表型惡化。EMT是上皮細胞獲得間充質(zhì)特征的過程,對胚胎發(fā)生、傷口愈合及降低癌細胞藥物敏感性方面至關(guān)重要[19]。EMT在多種惡性腫瘤形成過程中促進癌細胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移及其他惡性生物學行為。Twist1、Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子及N-cad、波形蛋白、E-cad等EMT相關(guān)基因的顯著表達,反映腫瘤細胞活躍的運動能力[20]。LncRNA可通過多種途徑調(diào)控胃癌EMT過程,如染色質(zhì)修飾[21]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[22]、調(diào)控mRNA[23]等。本實驗結(jié)果提示,SPATA3-AS1在胃癌細胞中可能通過上調(diào)Twist1、Snail、N-cad表達,下調(diào)E-cad表達,促進上皮源性細胞失去細胞極性,細胞黏附能力下降、遷移運動能力增強,導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展和遠處轉(zhuǎn)移,其具體機制還待進一步研究。本研究后續(xù)擬通過熒光原位雜交技術(shù)、細胞質(zhì)核分離實驗進行亞細胞定位,并通過RNA免疫共沉淀等實驗探討其可能的調(diào)控分子。

綜上所述,SPATA3-AS1在胃癌的EMT過程中發(fā)揮重要作用進而影響胃癌進展。其可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Snail,進而調(diào)控間質(zhì)標志物N-cad及上皮標志物E-cad表達,從而調(diào)控胃癌EMT。后續(xù)研究將進一步探討SPATA3-AS1、癌基因與 EMT之間的關(guān)系進而闡明SPATA3-AS1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制。

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