李雨函，曲俊彥，王華，申紅星

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院感染性疾病中心感染科，四川 成都 610041)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類新近發(fā)現(xiàn)的無游離3′或5′末端的非編碼RNA，不易被核酸外切酶降解，故比線性RNA更加穩(wěn)定。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾是RNA甲基中最豐富的修飾之一，由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶及閱讀蛋白三種調(diào)節(jié)因子共同動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制主要包括RNA輸出[1]、mRNA穩(wěn)定性[2]、mRNA剪接和免疫耐受[3]等。2017年以前，m6A甲基化修飾的研究只局限于mRNA水平，直到2017年3月，首篇circRNA m6A甲基化修飾發(fā)表，填補(bǔ)了此前信息空白[4]。進(jìn)一步研究表明，circRNA m6A甲基化修飾在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用[5]。因此，本文從如下幾個(gè)方面總結(jié)circRNA m6A甲基化修飾的生物功能，并對(duì)其研究進(jìn)展作一綜述。

1 circRNA與m6A甲基化

1.1 circRNA

circRNA作為一種獨(dú)特的非編碼RNA，在生物體內(nèi)普遍存在，由pre-mRNA轉(zhuǎn)錄物反向剪接而成，其5′端和3′端相互連接形成一個(gè)封閉的環(huán)，沒有5′帽結(jié)構(gòu)和3′多聚腺苷酸尾，致使其不易被核糖核酸酶降解，在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，在進(jìn)化上高度保守[6]。目前，研究表明circRNA功能主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：① 通過circRNA-miRNA-mRNA軸[7]，影響并調(diào)控基因表達(dá)[8-11]；② 結(jié)合兩種不同的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)其之間的相互作用[12-13]；③ 部分circRNA可作為模板翻譯產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)[14-15]。研究表明，circRNA在不同疾病中發(fā)揮不同的作用(表1)，與心血管疾病[8]、肝細(xì)胞癌[9-10]、阿爾茨海默病[11]、乳腺癌[13]和結(jié)腸癌[15]等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

表1 環(huán)狀RNA在不同疾病中的作用

1.2 m6A甲基化

研究表明，已鑒定出160多種RNA分子的修飾方式，但m6A修飾是真核生物中RNA甲基化最豐富的修飾，在維持機(jī)體生理狀態(tài)及某些病理過程中發(fā)揮著重要作用[16]。m6A甲基化修飾與多種疾病相關(guān)，如肝癌[17-18]、肥胖[19]、胰腺癌[20]、骨髓性白血病[21-22]等。m6A甲基化修飾是由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶及閱讀蛋白三種調(diào)節(jié)因子共同組成，甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化RNA特定位點(diǎn)形成m6A，去甲基化酶主要發(fā)揮m6A 修飾的 RNA 去甲基化的作用，由此使m6A修飾形成一種動(dòng)態(tài)可逆的過程(圖1)。

圖1 m6A甲基化修飾的動(dòng)態(tài)可逆過程

1.2.1 甲基轉(zhuǎn)移酶 甲基轉(zhuǎn)移酶主要由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like protein 3, METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14, METTL14)及Wilms腫瘤1-相關(guān)蛋白(Wilms tumor 1-associated protein, WTAP)組成。隨著研究的不斷深入，METTL16、RNA結(jié)合基序蛋白15/15B(RNA-binding motif protein 15/15B，RBM15/15B)、病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和鋅指CCCH區(qū)域結(jié)合蛋白13(ZC3H13)等甲基轉(zhuǎn)移酶的功能也經(jīng)證實(shí)。其中，METTL3起中心作用，與METTL14形成二聚體復(fù)合物，WTAP本身雖不具有甲基化活性，但可與上述二聚體復(fù)合物相互作用，與細(xì)胞核斑點(diǎn)中的各種mRNA前加工因子很好地協(xié)同定位于細(xì)胞核斑點(diǎn)區(qū)，從而影響細(xì)胞內(nèi)m6A甲基化修飾的效率[23-25]；METTL16不僅可作為甲基轉(zhuǎn)移酶影響RNA的結(jié)構(gòu)，也可作為許多潛在RNA的靶標(biāo)，如snRNA U6和mRNA MAT2A[26]； 病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶是m6A沉積所必需的甲基轉(zhuǎn)移酶，但其分子功能目前尚不清楚；RBM15/15B可以通過直接與mRNA上富含U的序列結(jié)合，招募甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體，從而影響mRNA翻譯[27]。

1.2.2 去甲基化酶 去甲基化酶包括脂肪肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)、AlkB同源蛋白5(ALKBH5)和AlkB同源蛋白13(ALKBH13)，其中FTO和ALKBH5是人類去甲基化酶種類中最豐富的蛋白，且都定位于細(xì)胞核斑點(diǎn)，參與mRNA的剪接過程，表明m6A修飾對(duì)mRNA剪接具有一定的影響[28]。上述兩種m6A去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)更加確切地表明m6A修飾是一種可逆修飾。

1.2.3 閱讀蛋白 閱讀蛋白與特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，通過識(shí)別RNA發(fā)揮自身作用[29]，不同的閱讀蛋白在m6A修飾中發(fā)揮不同的功能。閱讀蛋白主要由YTH結(jié)構(gòu)域蛋白1-2(YTH domain-containing protein 1-2, YTHDC1-2)和YTH結(jié)構(gòu)域家族1-3(YTH domain-containing family 1-3, YTHDF1-3)組成，識(shí)別m6A修飾并產(chǎn)生功能信號(hào)。不同的閱讀蛋白發(fā)揮不同作用，YTHDC1可促進(jìn)目的mRNA剪切成小片段，YTHDF2的主要功能是促進(jìn)mRNA降解；而YTHDF1和YTHDF3則影響mRNA翻譯過程[30]。胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs)作為一種新的m6A識(shí)別蛋白，可增強(qiáng)目的mRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)mRNA核輸出從而調(diào)控基因表達(dá)[31]。

2 m6A甲基化修飾對(duì)circRNA功能的影響

2.1 m6A甲基化相關(guān)蛋白修飾circRNA

研究表明，通過RNA免疫沉淀結(jié)合高通量測(cè)序分析數(shù)據(jù)，鑒定出1 155個(gè)和1 348個(gè)circRNA分別與YTHDF1和YTHDF2相互作用，發(fā)現(xiàn)無論親本基因mRNA有或者無m6A修飾circRNA，都可觀察到與YTHDF1和YTHDF2相互作用的m6A甲基轉(zhuǎn)移circRNA，說明circRNA m6A甲基化修飾識(shí)別蛋白及甲基轉(zhuǎn)移酶與mRNA m6A甲基化修飾相同[32]；但二者修飾位點(diǎn)不同，circRNA m6A甲基化修飾位點(diǎn)集中在外顯子上游和中間區(qū)域，而mRNA m6A甲基化修飾位點(diǎn)往往集中在最后一個(gè)外顯子，位于3′UTR區(qū)[33-34]。同時(shí)，通過對(duì)比HeLa細(xì)胞與人胚胎干細(xì)胞m6A甲基化修飾的circRNA發(fā)現(xiàn)，65% circRNA m6A甲基化修飾基因存在于HeLa細(xì)胞中，而人胚胎干細(xì)胞中未檢測(cè)到，并且在對(duì)兩種細(xì)胞中都表達(dá)的circRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩者m6A甲基化修飾狀態(tài)也具有較大差別[35]；由此說明circRNA m6A甲基化修飾具有細(xì)胞特異性。

m6A相關(guān)蛋白影響具有m6A修飾位點(diǎn)的circRNA豐度和功能，進(jìn)而影響circRNA在疾病中表達(dá)。最新研究表明，上調(diào)去甲基化酶FTO表達(dá)可提高h(yuǎn)sa_circ_0072309在非小細(xì)胞型肺癌中的豐度，從而促進(jìn)非小細(xì)胞型肺癌的發(fā)生[36]。通過對(duì)甲基化相關(guān)蛋白的研究，可經(jīng)m6A甲基化相關(guān)蛋白尋找到有差異表達(dá)的非編碼RNA。

2.2 m6A甲基化修飾影響circRNA翻譯

有研究指出，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site, IRES)能夠促進(jìn)circRNA翻譯的啟動(dòng)，而具有單一或多個(gè)位點(diǎn)m6A修飾的circRNA也可通過IRES啟動(dòng)翻譯，由此表明m6A修飾的存在可能影響circRNA翻譯的進(jìn)程[37]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，circFBXW7可以在m6A影響下通過驅(qū)動(dòng)IRES翻譯一種21 kD的新蛋白，此進(jìn)一步證實(shí)m6A甲基化修飾可影響circRNA編碼[38]。最近研究表明，circZNF609含有一個(gè)開放閱讀框，可將其中一段mRNA序列翻譯成氨基酸，并通過識(shí)別YTHD等m6A甲基化修飾蛋白調(diào)節(jié)翻譯過程[39-40]。學(xué)者們進(jìn)一步將m6A修飾的模序插入至circRNA編碼的起始位點(diǎn)，circRNA翻譯明顯增強(qiáng)；且METTL3和METTL14可促進(jìn)circRNA翻譯，而FTO抑制circRNA翻譯[41-42]。研究表明，乙肝病毒X蛋白上調(diào)METTL3表達(dá)，增加circARL3的m6A修飾，促進(jìn)circARL3反向剪接和翻譯[43]。將YTHDF1，YTHDF2及YTHDF3沉默后，YTHDF1對(duì)circRNA翻譯無影響，YTHDF2對(duì)circRNA和線性mRNA翻譯都有影響，而YTHDF3只對(duì)circRNA翻譯有影響，說明YTHDF3對(duì)m6A驅(qū)動(dòng)circRNA翻譯具有重要意義。

2.3 m6A甲基化修飾影響circRNA出核定位

研究人員利用RNA下拉(pull-down)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合質(zhì)譜分析及RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證實(shí)circNSUN2與m6A閱讀蛋白YTHDC1相互作用，促進(jìn)自身以m6A依賴的方式從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)輸出，促進(jìn)出核定位；且細(xì)胞質(zhì)中circNSUN2可與IGF2BP2及高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)結(jié)合，形成RNA-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2，增強(qiáng)HMGA2穩(wěn)定性[44]。由此表明，m6A甲基化修飾在circRNA的代謝中起著關(guān)鍵作用。IGF2BPs作為m6A甲基化修飾蛋白，可與多種mRNA結(jié)合，m6A甲基化修飾影響其與靶RNA結(jié)合的能力。近期研究揭示，circNDUFB2中m6A的修飾水平增強(qiáng)自身與IGF2BPs的結(jié)合強(qiáng)度，進(jìn)而加強(qiáng)三結(jié)構(gòu)域蛋白25(tripartite motif-containing protein 25，TRIM25)與IGF2BPs結(jié)合的活性，三者形成TRIM25/circNDUFB2/IGF2BPs三元復(fù)合物促進(jìn)IGF2BPs的泛素化和降解[45]。上述研究表明，m6A甲基化修飾影響circRNA出核，使circRNA在不同定位情況下執(zhí)行不同功能。

2.4 m6A甲基化修飾circRNA影響先天性免疫

將純化的外源性circNDUFB2轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可有效激活先天性免疫基因，誘導(dǎo)先天性免疫，并且起到抗病毒作用；維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid induced gene Ⅰ, RIG-Ⅰ)作為機(jī)體病毒識(shí)別和調(diào)控體內(nèi)先天性免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因，可檢測(cè)到外源性circNDUFB2豐度增加并與其結(jié)合，使兩者共同聚集在細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)激活免疫基因[46]。因此，外源性的circNDUFB2可作為強(qiáng)效佐劑誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生及抗腫瘤免疫等作用。circNDUFB2經(jīng)RIG-Ⅰ識(shí)別后激活線粒體抗病毒信號(hào)蛋白信號(hào)通路，招募免疫細(xì)胞，參與IGF2BPs降解和抗腫瘤免疫的激活，而m6A修飾的線性RNA可抑制RIG-Ⅰ活性[45-48]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，m6A甲基化修飾的人circRNA可抑制先天性免疫，且未被修飾的circRNA可激活RIG-Ⅰ，活化接頭蛋白及線粒體抗病毒信號(hào)蛋白下游轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)控因子3[49]。

3 結(jié)語

CircRNA不僅可以通過直接結(jié)合蛋白發(fā)揮作用，也可以形成circRNA-miRNA-mRNA分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控相關(guān)通路，并且具有翻譯潛能。m6A甲基化修飾作為真核生物RNA中最普遍的修飾方式，其主要影響mRNA的剪接、出核和翻譯。m6A修飾不僅存在于線性RNA，也與由mRNA剪接的circRNA密切相關(guān)，并在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。m6A修飾可以影響circRNA出核定位，circRNA也可結(jié)合m6A相應(yīng)的調(diào)控蛋白從而影響其穩(wěn)定性，兩者之間相互調(diào)節(jié)，互相滲透。