王雪華， 彭輝勇， 朱樟偉， 鄒君麗， 柳迎昭

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 1. 內(nèi)分泌科； 2. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

Graves病(Graves′ disease，GD)又稱(chēng)毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種自身免疫性甲狀腺疾病，主要表現(xiàn)為游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine， FT3)和游離甲狀腺激素(free thyroxine， FT4)升高，促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone， TSH)下降，其致病抗體主要為促甲狀腺激素受體抗體(TSH receptor autoantibody， TRAb)[1]。Graves病是甲狀腺功能亢進(jìn)的主要原因，約占甲狀腺功能亢進(jìn)的85%，甲狀腺功能亢進(jìn)可進(jìn)一步引起甲狀腺毒性周期性癱瘓、心血管系統(tǒng)疾病、卵巢早衰等[2-5]。為了實(shí)現(xiàn)Graves病的早期診斷和及時(shí)治療，有必要進(jìn)一步探索新型生物標(biāo)志物。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類(lèi)缺少5′帽和3′尾的封閉環(huán)狀非編碼RNA，具有廣泛性、保守性、穩(wěn)定性等特征。1979年，Hsu和Coca-Prados首次通過(guò)電子顯微鏡觀(guān)察到真核生物細(xì)胞質(zhì)中的circRNA，早期研究認(rèn)為circRNA是剪接的副產(chǎn)物[6]，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到其在多種生物學(xué)活動(dòng)及疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。然而，其在Graves病中的作用尚不清楚。本研究利用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)Graves病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中circRNA的表達(dá)譜進(jìn)行分析，探討差異表達(dá)的circRNA的生物學(xué)功能及其潛在診斷價(jià)值，為進(jìn)一步研究circRNA在Graves病中的作用提供新的視角。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年7月至11月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科診治的5例Graves病患者(GD組)和體檢中心5例健康對(duì)照者用于二代高通量測(cè)序；另選取40例Graves病患者(GD組)和40例健康對(duì)照者用于驗(yàn)證差異表達(dá)的circRNA。Graves病納入標(biāo)準(zhǔn)：① 臨床甲亢癥狀和體征；② 甲狀腺?gòu)浡阅[大(通過(guò)觸診和B超證實(shí))，少數(shù)病例可以無(wú)甲狀腺腫大；③ 血清TSH濃度降低，甲狀腺激素濃度升高；④ 血清TRAb或甲狀腺刺激性抗體(thyroid stimulating antibody， TSAb)陽(yáng)性；⑤ 甲狀腺攝碘率增加(排除一過(guò)性甲亢)；⑥ 眼球突出和其他浸潤(rùn)性眼征；⑦ 脛前黏液性水腫。其中，①②③④⑤項(xiàng)為診斷必備條件。健康對(duì)照組需滿(mǎn)足年齡和性別匹配、甲狀腺功能正常。所有納入病例需同時(shí)滿(mǎn)足血常規(guī)結(jié)果正常，無(wú)嚴(yán)重感染、腫瘤、其他自身免疫性疾病，近期未服用可能影響甲狀腺功能的藥物，年齡在20～60歲，GD組40例患者和40例對(duì)照組受試者信息統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

表1 GD組40例和對(duì)照組40例主要臨床資料統(tǒng)計(jì)

1.2 高通量測(cè)序分析Graves病患者PBMCs中circRNA表達(dá)譜

1.2.1 PBMCs分離與總RNA提取 使用EDTA-K2管采集5例Graves病患者和5例健康對(duì)照者外周血樣品，離心后將上層血漿收集到1.5 mL EP管中，并放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，剩余抗凝血用Ficoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液分離PBMCs，按照ES Science?RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提RNA，采用NanoDrop?ND-1000 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2 高通量測(cè)序 將上述RNA樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序由上海云序生物技術(shù)有限公司完成。文庫(kù)質(zhì)量控制和定量使用BioAnalyzer 2100儀器(美國(guó)Agilent Technologies公司)進(jìn)行?？俁NA中的rRNA通過(guò)核糖體RNA去除試劑盒(美國(guó)Illumina公司)完成。根據(jù)Illumina測(cè)序說(shuō)明，將10 pmol文庫(kù)變性為單鏈DNA分子，將其捕獲到Illumina Flowcell上并原位擴(kuò)增為簇。使用雙端PE模式在Illumina Hiseq測(cè)序儀上進(jìn)行150個(gè)循環(huán)測(cè)序。circRNA的對(duì)比鑒定通過(guò)STAR軟件(v2.5.1b)完成，并經(jīng)DCC軟件(v0.4.4)對(duì)circRNA進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。差異表達(dá)的circRNA篩選通過(guò)edgeR軟件(v3.16.5)進(jìn)行，火山圖、散點(diǎn)圖分析差異表達(dá)的circRNA。

1.3 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的circRNA

根據(jù)差異倍數(shù)(≥2)、P值(≤0.05)、在測(cè)序樣本中平均分布的程度以及circRNA潛在靶基因與Graves病可能的關(guān)聯(lián)等條件，篩選出6個(gè)circRNA，驗(yàn)證是否與高通量測(cè)序結(jié)果一致。選取40例Graves病患者和40例健康對(duì)照者并分離PBMCs，按照ES Science?RNA快速提取試劑盒提取RNA后，使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)合成cDNA。采用TB GreenTMPremix EXTaqTM(日本TaKaRa公司)試劑盒制備qRT-PCR反應(yīng)混合物。qRT-PCR擴(kuò)增條件：95 ℃初始變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR的引物序列見(jiàn)表2，使用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。結(jié)果由Applied Biosystems 7500儀器分析，采用2-△CT值計(jì)算circRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 預(yù)測(cè)circRNA可能靶向的miRNA及分析生物學(xué)功能

根據(jù)context+分?jǐn)?shù)、與circRNA結(jié)合的緊密程度以及文獻(xiàn)報(bào)道可能與Graves病發(fā)病相關(guān)的miRNA等條件，結(jié)合CircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)，每個(gè)差異表達(dá)的circRNA篩選10個(gè)最可能與之結(jié)合的miRNA，最后對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，分析潛在的生物學(xué)功能。

表2 qRT-PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Graves病患者PBMCs中circRNA表達(dá)譜

高通量測(cè)序檢測(cè)Graves病中的circRNA表達(dá)譜，分層聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，GD組患者和健康對(duì)照者PBMCs中circRNA表達(dá)譜具有明顯差異(圖1A)。根據(jù)差異倍數(shù)變化和P值繪制火山圖(圖1B)和散點(diǎn)圖(圖1C)結(jié)果顯示，與健康對(duì)照者相比，Graves病患者PBMCs中共有36 910個(gè)circRNA差異表達(dá)，包含23 215個(gè)上調(diào)和13 695個(gè)下調(diào)，其中顯著差異表達(dá)(差異倍數(shù)≥2，P≤0.05)的有669個(gè)，包括360個(gè)上調(diào)的circRNA和309個(gè)下調(diào)的circRNA。根據(jù)circRNA在基因組中的位置，將circRNA分為5類(lèi)(圖1D)：① 外顯子circRNA，占63.49%(23 433/36 910)；② 內(nèi)含子circRNA，占16.70%(6 165/36 910)；③ 外顯子-內(nèi)含子circRNA，占18.06%(6 665/36 910)；④ 反義circRNA，占0.71%(263/36 910)；⑤ 基因間circRNA，占1.04%(384/36 910)。

2.2 差異表達(dá)的circRNA驗(yàn)證結(jié)果

選取差異倍數(shù)改變最明顯的3個(gè)上調(diào)circRNA(has_circ_0114427、hsa_circ_0007470、hsa_circ_004 8232)和3個(gè)下調(diào)circRNA(hsa_circ_0002672、hsa_circ_0039161、hsa_circ_0002600)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)圖2，GD組has_circ_0114427、hsa_circ_0007470、hsa_circ_0048232表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)，hsa_circ_0002672表達(dá)明顯下調(diào)，與高通量測(cè)序結(jié)果一致；兩組間hsa_circ_0039161和hsa_circ_0002600表達(dá)無(wú)明顯差異。

2.3 miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

根據(jù)CircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與差異表達(dá)circRNA相結(jié)合的miRNA，列出與差異表達(dá)circRNA最有可能結(jié)合的前10位miRNA，見(jiàn)圖3。

2.4 差異表達(dá)circRNA 的GO分析和KEGG分析

由于篩選驗(yàn)證的6個(gè)circRNA中，3個(gè)上調(diào)的has_circ_0114427、hsa_circ_0007470、hsa_circ_0048232和1個(gè)下調(diào)的hsa_circ_0002672符合高通量測(cè)序結(jié)果。因此，我們著重分析了上調(diào)circRNA 前10位GO富集條目和KEGG信號(hào)通路。GO分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能中最豐富的GO條目分別是高分子代謝、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器和轉(zhuǎn)移酶激活。KEGG分析顯示，差異表達(dá)的circRNA可能參與甲狀腺激素信號(hào)、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、非小細(xì)胞肺癌等相關(guān)信號(hào)通路。見(jiàn)圖4。

(A) circRNA分層聚類(lèi)圖：每行代表circRNA，每列代表GD組或?qū)φ战M標(biāo)本；紅色代表上調(diào)circRNA，綠色代表下調(diào)circRNA。(B) circRNA火山圖：紅色方塊代表差異顯著表達(dá)的circRNA，灰色方塊代表無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的circRNA。(C) 差異表達(dá)circRNA散點(diǎn)圖：紅色代表上調(diào)circRNA，綠色代表下調(diào)circRNA，中間藍(lán)色代表無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的circRNA。(D) circRNA分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖：①：外顯子circRNA；②：內(nèi)含子circRNA；③：外顯子-內(nèi)含子circRNA；④：反義circRNA；⑤：基因間circRNA

圖2 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的circRNA

圖3 差異表達(dá)circRNA的潛在結(jié)合miRNA預(yù)測(cè)

圖4 差異表達(dá)circRNA的GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析

2.5 ROC曲線(xiàn)分析

對(duì)驗(yàn)證具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的has_circ_0114427、hsa_circ_0007470、hsa_circ_0048232和hsa_circ_0002672進(jìn)行ROC 曲線(xiàn)分析(圖5)，結(jié)果顯示has_circ_0114427曲線(xiàn)下面積最大(0.775 6)， 故hsa_circ_0114427具有作為Graves病診斷分子標(biāo)志物的潛能。

圖5 篩選驗(yàn)證的circRNA ROC曲線(xiàn)分析

3 討論

Graves病的發(fā)病率逐年增加，女性發(fā)病率達(dá)3%左右，為男性的4～6倍，其臨床表現(xiàn)涉及多個(gè)系統(tǒng)，主要癥狀有易激動(dòng)、心悸、失眠、食欲亢進(jìn)等，嚴(yán)重者發(fā)生甲亢危象、甲狀腺毒癥性心臟病等并發(fā)癥[8]。其免疫學(xué)機(jī)制可能涉及CD4+/CD8+T細(xì)胞失衡。據(jù)報(bào)道，Th1細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ可影響甲狀腺細(xì)胞分泌趨化因子配體10(CXCL-10)，CXCL-10具有將CD8+和CD4+效應(yīng)T細(xì)胞吸引到炎癥部位，誘導(dǎo)T細(xì)胞極化并增強(qiáng)T細(xì)胞依賴(lài)性炎癥反應(yīng)的能力[9-10]。Th17/Treg細(xì)胞比例的失衡可能刺激TSAb的產(chǎn)生并導(dǎo)致Graves病的發(fā)生，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)他巴唑治療后Th17/Treg細(xì)胞比例下降[11-13]。因此，探究Graves病發(fā)病的分子機(jī)制，可為尋找Graves病的早期生物標(biāo)志物提供幫助。

從基因組學(xué)的角度來(lái)看，編碼RNA僅占人體的2%，而大多數(shù)基因都屬于非編碼RNA[14]，因此，越來(lái)越多的研究人員致力于非編碼RNA的研究。作為非編碼RNA，circRNA在細(xì)胞內(nèi)、血清、血漿、外泌體中穩(wěn)定存在，具有廣泛性、保守性和穩(wěn)定性等特征，不易被核酸外切酶降解。circRNA在胰腺癌[15]及自身免疫性疾病中[16-18]已有相關(guān)報(bào)道。 Su等[19]研究發(fā)現(xiàn)circRNA-Cdr1as可以作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA通過(guò)過(guò)表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。Liu等[20]在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究中發(fā)現(xiàn)，在聚肌苷酸胞苷酸刺激或病毒感染時(shí)，PBMCs或者T細(xì)胞中含雙鏈RNA的circRNA過(guò)表達(dá)可以緩解異常的蛋白激酶激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)。組織、血液和外泌體中的circRNA表達(dá)失調(diào)對(duì)疾病的早期診斷、治療效果評(píng)估和預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面具備較好的研究?jī)r(jià)值[21]。但是，circRNA與Graves病相關(guān)報(bào)道較少，仍有待深入研究。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)Graves病患者PBMC中circRNA表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序并分析。共檢出36 910個(gè)差異表達(dá)的circRNA，絕大部分來(lái)源于外顯子，其中有360個(gè)上調(diào)和309個(gè)下調(diào)circRNA表達(dá)具有顯著差異性。另外，在所有檢測(cè)出的circRNA中，有18 519個(gè)circRNA是新發(fā)現(xiàn)的，說(shuō)明circRNA在Graves病中有更大的研究空間。因?yàn)楦咄繙y(cè)序可能存在假陽(yáng)性結(jié)果，本研究選擇其中6個(gè)circRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明Graves病患者中hsa_circ_0114427、hsa_circ_0007470、hsa_circ_0048232表達(dá)明顯升高，hsa_circ_0002672表達(dá)明顯降低，該結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致，而兩組間的hsa_circ_0039161和hsa_circ_0002600表達(dá)無(wú)明顯差異。circRNA-miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果中， miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-29c-3p有可能通過(guò)調(diào)控可誘導(dǎo)共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)影響濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell， Tfh)的變化，miR-125a-5p、miR-125b-5p有可能通過(guò)調(diào)控靶基因CXCR5影響Tfh細(xì)胞的變化，Tfh細(xì)胞可能參與Graves病的發(fā)病過(guò)程[22]。GO分析和KEGG分析顯示，差異表達(dá)的circRNA可能涉及甲狀腺激素信號(hào)、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、非小細(xì)胞肺癌等相關(guān)信號(hào)通路，其中甲狀腺激素信號(hào)通路中PI3K/AKT通路已被證實(shí)參與Graves病的發(fā)病過(guò)程[23]。ROC曲線(xiàn)分析顯示，hsa_circ_0114427具有較大曲線(xiàn)下面積，表明其具有作為Graves病生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

綜上所述，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)探究了Graves病患者PBMCs中circRNA的表達(dá)譜，并擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證了差異表達(dá)的circRNA；對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行GO分析和KEGG分析結(jié)果表明，Graves中差異表達(dá)的circRNA可能參與甲狀腺信號(hào)通路；has_circ_0114427可能與Graves病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但是，本研究納入的樣本量較少，結(jié)果可能存在偶然性，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。