徐丹 曹鵬 周玉珍 許豪勤 王大為

遺傳代謝病是因維持機(jī)體正常代謝所必需的某些由多肽和/或蛋白組成的酶、受體、載體及膜泵生物合成發(fā)生遺傳缺陷，即編碼這類多肽（蛋白）的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的疾病，又稱遺傳代謝異常或先天代謝缺陷。遺傳代謝病就是有代謝功能缺陷的一類遺傳病，多為單基因遺傳病，包括代謝大分子類疾?。喊ㄈ苊阁w貯積癥（30余種?。?、線粒體病等；代謝小分子類疾病：氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸等。對(duì)新生兒特別是高危新生兒進(jìn)行遺傳性代謝病篩查,能夠起到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的作用,從而有效降低本地區(qū)出生人口缺陷,為提高人口素質(zhì)建立保障,是一種能夠有效預(yù)防遺傳代謝病的途徑[1]。該病呈進(jìn)行性加重，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)異常等不可逆性損傷，因此對(duì)新生兒進(jìn)行IMD篩査可對(duì)患兒進(jìn)行早期干預(yù)及治療，從而最大程度地降低該病的危害。新生兒疾病篩查是指醫(yī)療機(jī)構(gòu)在新生兒中采用快速、簡(jiǎn)便、敏感的檢驗(yàn)方法，對(duì)危及兒童生命、危害兒童生長(zhǎng)發(fā)育、導(dǎo)致兒童殘疾的先天性或遺傳性疾病進(jìn)行篩查，旨在早期發(fā)現(xiàn)疾病、早期治療，減少兒童殘疾甚至死亡。傳統(tǒng)篩查方法（如Guthrie細(xì)菌抑制法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等）屬于“一種方法檢測(cè)一種代謝疾病”，不僅費(fèi)用高周期長(zhǎng)，而且不適用于多種代謝疾病的群體篩查，難以滿足大規(guī)模IMD篩查的要求。近年發(fā)展的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（tandem mass spectrometry，MS/MS），能夠一種方法檢測(cè)多種代謝疾病，則有可能成為篩查遺傳性代謝病的常規(guī)方法[2]。該方法能在2～3 min對(duì)1個(gè)標(biāo)本進(jìn)行多種產(chǎn)物分析，可同時(shí)進(jìn)行多種IMD的篩查和診斷。本研究對(duì)419例新生兒（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院146例及蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院273例）應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行遺傳代謝性疾病的篩查，提高遺傳代謝性疾病的篩查的認(rèn)識(shí)和診療水平。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

甲醇（美國(guó)Tedia），水為超純水；Perkin Elmer非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒（含氨基酸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品、?；鈮A內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品及干血斑質(zhì)控品等）。

1.2 儀器

液質(zhì)聯(lián)用儀為Waters 2695-Quattro micro，工作站為Waters Masslynx及Waters Neolynx，微孔板恒溫振蕩器JN400-3（蘇州吉米諾），Vortex-Genie振蕩器，超純水器（Millipore Inc.USA）。

2 資料與方法

2.1 一般資料

選取2014年3月—2015年11月江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院及蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的419例新生兒（出生時(shí)間為72 h～7 d）作為研究對(duì)象，其中男嬰251例，女嬰168例。正常出生體質(zhì)量389例，低體質(zhì)量?jī)?例，巨大兒26例；足月兒243例，早產(chǎn)兒2例，過(guò)期兒174例。

2.2 研究方法

2.2.1 標(biāo)本采集 所有新生兒在出生72 h內(nèi)充分哺乳（哺乳至少6～8次）后進(jìn)行采血。采血前先以75%乙醇給予充分消毒，選擇嬰兒足跟內(nèi)側(cè)或外側(cè)，其方法是按摩或熱敷嬰兒足跟使其充血，酒精消毒后用一次性采血針穿刺，深約2～4 mm，棄用第一滴血后將其擠出，血液滴在特定的濾紙上，使其充分滲透至濾紙對(duì)面。每張濾紙片上留存2～3個(gè)直徑為8 mm以上的血斑。血斑應(yīng)充分滲透，濃度均勻一致。標(biāo)本晾干后，統(tǒng)一收集標(biāo)本，密封存放在2～10℃冰箱里保存待檢，檢查陽(yáng)性者需復(fù)查以及基因診斷。

2.2.2 樣品處理與測(cè)定 新生兒篩查中串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)包括衍生化法和非衍生化法。本實(shí)驗(yàn)采用非衍生化法，采用Perkin Elmer非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒。用打孔器打下濾紙血點(diǎn)后置于96孔板中，加入內(nèi)標(biāo)液100 μL（含氨基酸和?；鈮A同位素內(nèi)標(biāo)的無(wú)水甲醇），用熱封膜將96孔板封好后放入微孔板恒溫振蕩器，在45 ℃，700 r/min條件下振蕩45 min，冷卻并靜置后吸取上清液75～85 μL于進(jìn)樣瓶，待反應(yīng)2 h后進(jìn)樣，進(jìn)行MS/MS分析。

2.2.3 色譜條件 色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-水相（80 : 20）；梯度洗脫，流速梯度變化見表1；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫流速時(shí)間表

質(zhì)譜條件：新生兒疾病篩查的串聯(lián)質(zhì)譜分析，主要同步執(zhí)行3個(gè)掃描模式：母離子掃描（PS）、中性丟失掃描（NL）和多反應(yīng)檢測(cè)掃描（MRM）。

母離子掃描（PS）：由于肉毒堿碰撞裂解產(chǎn)生m/z 85，分別可能為-C4H8、-N（CH3）3、-RCOOH的碎片，若采用母離子掃描模式，可獲得所有?；舛緣A的信息。中性丟失掃描（NL）：由于氨基酸碰撞裂解大多會(huì)產(chǎn)生中性丟失質(zhì)量m/z46的碎片，采用中性丟失掃描模式，可得多種氨基酸信息。多反應(yīng)檢測(cè)掃描（MRM）：可得部分堿性氨基酸，如鳥氨酸、瓜氨酸（m/zl19）、精氨酸（m/z161）、甘氨酸（m/z56）的信息。

分析物濃度的計(jì)算采用內(nèi)標(biāo)法：mi=f×Ai/（As/ms）

Ai和As：分析物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積或峰高；ms：內(nèi)標(biāo)物的量；f：校正因子。

校正因子f的計(jì)算：f=（As/ms）/（Ar/mr）

As和Ar：內(nèi)標(biāo)物和對(duì)照品的峰面積或峰高；ms和mr：加入內(nèi)標(biāo)物和對(duì)照品的量。

通過(guò)軟件Waters Neolynx計(jì)算分析物的濃度。

2.2.4 病種及截?cái)嘀捣治?本次串聯(lián)質(zhì)譜法篩查新生兒遺傳代謝疾病共23個(gè)，參考浙江地區(qū)截?cái)嘀?，如?所示。

表2 串聯(lián)質(zhì)譜篩查新生兒遺傳代謝疾病病種及截?cái)嘀?/p>

2.2.5 確診和隨訪 將樣本檢測(cè)所得數(shù)據(jù)與浙江地區(qū)的新生兒篩查數(shù)據(jù)相比較，對(duì)于篩查陽(yáng)性的樣本進(jìn)行原血片復(fù)查，若再次檢測(cè)為陽(yáng)性，則通知新生兒家屬并發(fā)放串聯(lián)質(zhì)譜分析報(bào)告單，督促其到具備診斷條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行診斷并治療，同時(shí)對(duì)其電話隨訪。篩查流程見圖1。

圖1 篩查工作流程

3 結(jié)果

3.1 總體篩查情況

在篩查的419例樣本中，原血片復(fù)查15例，此15例中3例為可疑陽(yáng)性病例，分別是2例原發(fā)性肉堿缺乏癥和1例中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥。我們及時(shí)告知這3例新生兒家屬并發(fā)放報(bào)告單督促其盡快復(fù)查診斷。在隨后對(duì)其的電話隨訪中，我們得知這3例的診斷結(jié)果均為正常。

3.2 質(zhì)量控制

本次檢測(cè)含質(zhì)控樣品4%，含低質(zhì)控及高質(zhì)控，檢測(cè)誤差都在20%之內(nèi)，符合質(zhì)控要求。

3.3 檢測(cè)圖譜

檢測(cè)的3個(gè)離子通道色譜圖如圖2所示，分別為母離子掃描、中性丟失掃描和多反應(yīng)檢測(cè)掃描模式下的色譜圖信息。

圖2 離子通道色譜圖

4 討論

本實(shí)驗(yàn)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)使用多種參數(shù)指示篩查結(jié)果，能夠一次檢測(cè)多種疾病，提高診斷效率，并且兼顧敏感性和特異性。雖然其已為近年來(lái)新生兒遺傳代謝病篩查的發(fā)展趨勢(shì)，但由于其儀器成本及對(duì)儀器使用者的要求都較高，同時(shí)也需要配備具有遺傳代謝疾病領(lǐng)域臨床經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生，因此，也一定程度限制了其應(yīng)用。使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒遺傳代謝病篩查的過(guò)程中，存在著一些影響篩查質(zhì)量的因素，列舉如下。

4.1 血樣采集及實(shí)驗(yàn)室因素

血樣采集是新生兒疾病篩查中比較重要的技術(shù)環(huán)節(jié)，包括標(biāo)本的采集、貯藏和遞送，其質(zhì)量會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采血過(guò)程中可能出現(xiàn)血斑太小、血液凝固、溶血、正反面滴血、血斑滲透不全、血斑污染、出現(xiàn)滲血環(huán)等問(wèn)題；貯存條件不符合要求，由于受潮、日照或烘烤等因素，導(dǎo)致血樣保存不當(dāng)[3]。標(biāo)本也有可能被甲醇、甲醛、甲苯、消毒劑、清潔劑等試劑污染或者由于夏季太陽(yáng)暴曬、冬季暖氣和火爐旁烘烤而變質(zhì)；如不按要求冷鏈遞送，標(biāo)本同樣可能出現(xiàn)問(wèn)題從而影響篩查結(jié)果?；蛞蛴跊]有定期清洗消毒洗板機(jī)或試劑混合不均勻等人為因素而導(dǎo)致樣本失控[4]。因此，篩查質(zhì)控尤為重要，應(yīng)盡量降低血片不合格率、不合格血片補(bǔ)采率以及血片遲遞率[5]。

實(shí)驗(yàn)室的影響因素主要包括：實(shí)驗(yàn)儀器不符合標(biāo)準(zhǔn)；實(shí)驗(yàn)人員未曾接受新生兒疾病篩查相關(guān)實(shí)驗(yàn)室知識(shí)和技能培訓(xùn)或沒有嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作；生物參考區(qū)間選擇不科學(xué)；檢測(cè)方法本身的問(wèn)題等。

4.2 新生兒因素

由于新生兒出生后2～3個(gè)月酪氨酸會(huì)出現(xiàn)良性暫時(shí)性增高，串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)于酪氨酸血癥、高胱氨酸尿癥、甲基丙二酸尿癥以及維生素B紊亂等疾病的檢測(cè)假陽(yáng)性率達(dá)0.2。另外，低出生體質(zhì)量?jī)撼霈F(xiàn)假陽(yáng)性率明顯高于正常出生體質(zhì)量?jī)海@是因?yàn)樵绠a(chǎn)、低體質(zhì)量?jī)撼４嬖谀c道外營(yíng)養(yǎng)，影響氨基酸及酰基肉堿濃度變化[6]。

4.3 切值

切值是指新生兒代謝物在健康人中的上限及下限值。遺傳代謝病篩查指標(biāo)切值設(shè)置尤為重要。切值若設(shè)置偏高則導(dǎo)致假陰性，若設(shè)置偏低則導(dǎo)致假陽(yáng)性。新生兒篩查切值的確定需要建立在一定 數(shù)量足月健康新生兒、結(jié)合檢測(cè)日期的質(zhì)控值、疾病的患病率的基礎(chǔ)上，取合適的百分位數(shù)作為切值的上下限[7-9]。由于新生兒篩查受影響因素較多，建議不同的新篩實(shí)驗(yàn)室在開始時(shí)選用試劑盒推薦切值或者其他實(shí)驗(yàn)室切值，等實(shí)驗(yàn)室樣本量足夠之后，建立自己的實(shí)驗(yàn)室切值范圍并定期校正，從而不斷優(yōu)化截?cái)嘀担岣哧?yáng)性預(yù)測(cè)值，降低假陽(yáng)性率[10]。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于新生兒遺傳性代謝病篩查具有較高靈敏度及特異度，使用血量少，檢測(cè)病種多，能夠使患兒在機(jī)體損傷之前得到及時(shí)的診斷和治療，可以顯著提高新生兒生命質(zhì)量，值得進(jìn)行全面的推廣和采用[11-12]，除此之外，遺傳代謝病的早期診斷對(duì)指導(dǎo)家庭再生育、改善醫(yī)患矛盾也是十分必要的。本文借助本院新生兒419例樣本采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了方法，同時(shí)討論了影響新生兒篩查質(zhì)量的幾點(diǎn)因素，具有一定參考意義。串聯(lián)質(zhì)譜法作為新生兒疾病篩查的一項(xiàng)有力手段，使得使新生兒篩查的內(nèi)容和質(zhì)量上升到一個(gè)新的水平。隨著人們對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜法機(jī)理認(rèn)識(shí)的重視以及其技術(shù)的日益成熟，將會(huì)大幅提升篩查率及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，會(huì)有更多的疾病可以得到早期診斷和治療[13]。