吳莉萍 高玲亮 楊江濤,2 付有晴 劉彥慧 顧茂勝 何紅琴 楊艷玲

1.深圳愛灣醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室 (廣東 深圳 518000)

2.深圳罕見病代謝組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)工程研究中心 (廣東 深圳 518000)

3.東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心 (廣東 東莞 523000)

4.徐州市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心 (江蘇 徐州 221000)

5.運(yùn)城市婦幼保健院遺傳科 (山西 運(yùn)城 044000)

6.北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科 (北京 100034)

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是一種嚴(yán)重的退行性神經(jīng)肌肉病，由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(SMN1)的缺失或變異導(dǎo)致脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性和丟失，以肌無力和肌萎縮為主要臨床特征。SMA為常染色體隱性遺傳病，發(fā)病率為1/10000～1/6000，一般人群中SMN1的致病變異攜帶率為1/50～1/40[1-3]。

已知約95%的SMA患者為SMN1外顯子7純合缺失所致，約5%為SMN1復(fù)合雜合變異所致[2-5]。對于SMA基因篩查，目前已有商業(yè)化試劑盒，采用多重PCR結(jié)合熒光探針技術(shù)，針對SMN1基因外顯子7兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性的引物序列，擴(kuò)增SMN1基因片段(以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參)。針對每個(gè)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)特異的熒光探針，通過收集和分析特定熒光信號的CT值，根據(jù)比較Ct法進(jìn)行SMN1基因外顯子7拷貝數(shù)的分析，從而實(shí)現(xiàn)純合缺失、雜合缺失以及正常型三種基因型的自動(dòng)判別。

現(xiàn)階段SMA篩查的主要目標(biāo)為孕前/產(chǎn)前攜帶者，通過靜脈穿刺采集全血樣本提取基因組DNA，檢測SMN1[6]。但是，目前孕前/產(chǎn)前攜帶者篩查率不高，既往由于缺乏基因修正治療藥物，使得國內(nèi)SMA新生兒篩查落后于美國、德國等發(fā)達(dá)國家，大量的SMA患兒被延誤診斷，未能得到有效治療，導(dǎo)致癱瘓，兒童期死亡率很高[7-8]。2022年1月1日，諾西那生鈉正式納入我國醫(yī)保，SMA新生兒篩查勢在必行[9]。我國臺灣和浙江分別于2014年和2018年開始SMA新生兒篩查研究，目前已積累了一定的經(jīng)驗(yàn)[10-11]。

能否采用干血斑標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA提取并應(yīng)用于SMN1基因檢測，是能否順利開展新生兒SMA基因篩查的必要前提，也是孕前/產(chǎn)前攜帶者篩查及轉(zhuǎn)診網(wǎng)絡(luò)建設(shè)的重要環(huán)節(jié)。使用特殊濾紙采集血樣制成干血斑，是一種便捷的臨床血液樣本采集技術(shù)，既保證了待檢測樣品的生物穩(wěn)定性又便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，是遺傳病基因篩查和診斷的有效工具[12-13]。干血斑是血液樣本穩(wěn)定的載體，但是需要與相應(yīng)的提取與檢測技術(shù)相結(jié)合才能夠保證其檢測準(zhǔn)確性。本研究旨在建立一種干血斑基因組DNA自動(dòng)化提取方法，考察可滿足SMA基因篩查的干血斑最低起始用量，并進(jìn)行檢測穩(wěn)定性測試，以適用于臨床大規(guī)模人群的SMA基因篩查，尤其是新生兒篩查。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與試劑Whatman 903號濾紙，干血斑基因組DNA提取試劑盒(深圳會(huì)眾生物科技有限公司)，人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(SMN1)檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)(深圳會(huì)眾生物科技有限公司)。

全自動(dòng)核酸提取儀(深圳會(huì)眾生物科技有限公司)，超微量分光光度計(jì)(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)，恒溫混勻儀(加熱型)-TS100(杭州瑞誠儀器有限公司)，全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(上海宏石醫(yī)療科技有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有標(biāo)本的采集均需受檢者或其監(jiān)護(hù)人簽訂知情同意書。(1)新生兒干血斑標(biāo)本：共40份，來自中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院；(2)不同保存時(shí)長的新生兒干血斑標(biāo)本：共103份，其中102份來自中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院，1份來自運(yùn)城市婦幼保健院；(3)新鮮采集的EDTA抗凝血：共5份，來自深圳罕見病代謝組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)工程研究中心，使用EDTA抗凝管采集外周靜脈血2mL；(4)新鮮采集并經(jīng)冷鏈運(yùn)輸48～72h的EDTA抗凝血：共10份，來自深圳罕見病代謝組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)工程研究中心，使用EDTA抗凝管采集外周靜脈血2mL，冷鏈運(yùn)輸48～72h；(5)-80℃超低溫冷凍保存1～2年的EDTA抗凝血：共7份，其中5份來自徐州市婦幼保健院，2份來自東莞市婦幼保健院。

1.2.2 干血斑標(biāo)本的制備與保存 用移液槍取45μL左右的血液標(biāo)本自然滴落于濾紙片采樣圈中，每個(gè)血斑直徑不小于8mm，確保濾紙正反兩面均勻、充分滲透，室溫干燥4小時(shí)后即制備成濾紙干血片標(biāo)本。每單張干血片置于自封袋中，獨(dú)立密閉保存。

1.2.3 干血斑最低起始用量測試 新生兒干血斑標(biāo)本40份和新鮮采集的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本5份，用于SMN1基因檢測干血斑最低起始用量測試。第一步，隨機(jī)選取新生兒干血斑標(biāo)本20份[其中1份為陽性樣本(SMN1基因外顯子7雜合缺失型)]和新鮮采集的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本5份，每份標(biāo)本使用打孔鉗從干血斑標(biāo)本采樣圈中打取直徑為3mm的干血斑各1片、2片和3片，分別提取基因組DNA，測試SMN1基因檢測穩(wěn)定性。第二步，使用剩余新生兒干血斑標(biāo)本20[其中1份為陽性樣本(SMN1基因外顯子7雜合缺失型)]，根據(jù)第一步測試結(jié)果調(diào)整干血斑使用面積，考察最低起始干血斑用量。

基因組DNA提取，使用打孔鉗從干血斑標(biāo)本采樣圈中打取不同面積的血片，收集在1.5mL離心管中。每份標(biāo)本打孔后，均使用75%酒精對打孔鉗頭部進(jìn)行擦拭消毒，避免交叉污染。

提取步驟：基因組DNA提取采用會(huì)眾生物干血斑基因組DNA提取試劑盒，提取操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每個(gè)樣本依次加入200μL裂解液和20μL蛋白酶K，用恒溫混勻儀56℃ 1800rpm恒溫振蕩孵育30min后，99℃ 500rpm恒溫振蕩孵育10min，取出離心管瞬時(shí)離心，將液體全部轉(zhuǎn)移到V-F型板A列，將V-F型板放置在會(huì)眾生物全自動(dòng)核酸提取儀的提取槽上，套好磁棒套，運(yùn)行干血斑標(biāo)本提取程序，儀器自動(dòng)完成提取，洗脫的DNA在V-F型板的H列。

DNA濃度與純度測定，完成所有干血斑標(biāo)本的基因組DNA提取后，使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行吸光值檢測，計(jì)算DNA濃度和純度。

SMN1基因檢測，采用會(huì)眾生物人運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(SMN1)檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，通過多重PCR結(jié)合熒光探針技術(shù)，對SMN1外顯子7拷貝數(shù)進(jìn)行檢測分析。操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

當(dāng)SMN1基因存在0個(gè)拷貝(即SMA純合缺失型)其RQ值參考區(qū)間＜0.25或無RQ值，當(dāng)SMN1基因存在1個(gè)拷貝(即SMA雜合缺失型)其RQ值參考區(qū)間為0.25～0.75，當(dāng)SMN1基因存在2個(gè)拷貝(即正常型)其RQ值參考區(qū)間為0.75～1.25。

1.2.4 新生兒干血斑標(biāo)本保存穩(wěn)定性測試 選取4℃避光保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月和24個(gè)月的新生兒干血斑標(biāo)本各20份，其中保存時(shí)長為1個(gè)月的組別中增加2份陽性標(biāo)本(SMN1基因外顯子7雜合缺失型)，保存時(shí)長為6個(gè)月的組別中增加1份陽性標(biāo)本(SMN1基因外顯子7雜合缺失型)。每份標(biāo)本分別使用打孔鉗打取最低起始用量的干血斑，提取基因組DNA，檢測SMN1，評價(jià)用于SMA基因檢測時(shí)新生兒干血斑標(biāo)本冷藏保存的穩(wěn)定性。

1.2.5 EDTA抗凝血運(yùn)輸與保存條件測試 選取10份新鮮采集并經(jīng)冷鏈運(yùn)輸48～72h的EDTA抗凝血(其中陽性樣本5份，包括3份SMN1基因外顯子7雜合缺失型和2份純合缺失型標(biāo)本)及7份-80℃超低溫冷凍保存1～2年的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本(其中陽性樣本2份，為SMN1基因外顯子7純合缺失型)。每份標(biāo)本分別使用打孔鉗打取最低起始用量的干血斑，提取基因組DNA，檢測SMN1，評價(jià)用于制備干血斑標(biāo)本并進(jìn)行SMA基因檢測時(shí)EDTA抗凝血的運(yùn)輸與保存條件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R包對檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

新生兒干血斑標(biāo)本20份(其中1份為陽性樣本為SMN1外顯子7雜合缺失型)和新鮮采集的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本5份，使用2～3片直徑為3mm的干血斑均可穩(wěn)定檢出SMN1基因型，見圖1、表1。與2片直徑為3 mm的干血斑相比，僅使用1片直徑為4 mm的干血斑也可穩(wěn)定檢出SMN1基因型，見圖2。

圖1 1～3片直徑為3mm的新生兒DBS標(biāo)本SMN1基因檢測結(jié)果。圖2 干血斑SMN1檢測結(jié)果(1片直徑4mm vs 2片直徑3mm)。圖3 1～3片直徑3mm的新生兒干血斑所提取的基因組DNA濃度與純度。圖4 干血斑基因組DNA濃度與純度(1片直徑4mm vs 2片直徑3mm)。圖5 新生兒干血斑標(biāo)本4℃不同保存時(shí)長下的SMN1檢測結(jié)果。圖6 新生兒干血斑標(biāo)本4℃保存不同時(shí)長下的基因組DNA濃度與純度。圖7 不同運(yùn)輸或保存條件下EDTA抗凝血所制干血斑標(biāo)本SMN1檢測結(jié)果。圖8不同運(yùn)輸或保存條件下EDTA抗凝血所制干血斑標(biāo)本基因組DNA濃度與純度。

表1 新鮮采集EDTA抗凝血所制1～3片直徑為3mm的血斑標(biāo)本SMN1檢測結(jié)果

表1 新鮮采集EDTA抗凝血所制1～3片直徑為3mm的血斑標(biāo)本SMN1檢測結(jié)果

樣本序號 1片 2片 3片RQ值 SMN1 RQ值 SMN1 RQ值 SMN1 1 1.17 正常型 1.13 正常型 1.10 正常型2 1.25 正常型 1.21 正常型 1.19 正常型3 1.18 正常型 1.15 正常型 1.19 正常型4 1.10 正常型 1.09 正常型 1.12 正常型5 1.03 正常型 0.99 正常型 1.06 正常型

2.2.1 DNA濃度 新生兒干血斑標(biāo)本20份、新鮮采集的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本5份，使用2～3片直徑3mm的干血斑所提取的基因組DNA濃度為3.11～13.71ng/μL(圖3，表2)，滿足SMN1檢測要求(2～180ng/μL，下文同)。

與2片直徑3 mm的干血斑相比，僅使用1片直徑4mm的干血斑所提取的基因組DNA濃度為2.54～5.71ng/μL(圖4)，也可滿足SMN1檢測要求。

2.2.2 DNA純度 新生兒干血斑標(biāo)本20份、新鮮采集的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本5份，使用2～3片直徑3mm的干血斑所提取的基因組DNA純度(A260/A280)為1.617～1.968(圖3，表2)，滿足SMN1基因檢測要求(A260/A280介于1.6～2.0，下文同)。

表2 新鮮采集DTA抗凝血所制1～3片直徑3mm的血斑基因組DNA濃度與純度

表2 新鮮采集DTA抗凝血所制1～3片直徑3mm的血斑基因組DNA濃度與純度

樣本序號 DNA濃度(ng/μL) DNA純度(A260/A280)1片 2片 3片 1片 2片 3片1 5.45 6.95 7.44 1.938 1.862 1.944 2 7.25 6.99 6.77 1.885 1.856 1.862 3 2.88 3.71 6.79 1.604 1.829 1.641 4 3.37 4.98 5.71 1.849 1.847 1.875 5 3.08 4.79 5.52 1.682 1.678 1.629

與2片直徑3 mm的干血斑相比，僅使用1片直徑4mm的干血斑所提取的基因組DNA純度(A260/A280)為1.676～1.984(圖4)，也可滿足SMN1檢測要求。

2.3 新生兒干血斑標(biāo)本保存穩(wěn)定性測試新生兒干血斑標(biāo)本在4℃避光保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月和24個(gè)月后，打取1片直徑4 mm的干血斑，所提取的基因組DNA濃度與純度均滿足SMN1檢測要求，可穩(wěn)定檢出SMA基因型，見圖5～圖6。

新鮮采集并經(jīng)冷鏈運(yùn)輸48～72h的EDTA抗凝血及-80℃超低溫冷凍保存1～2年的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本，打取1片直徑4mm的干血斑所提取的基因組DNA濃度與純度均滿足SMN1檢測要求，可穩(wěn)定檢出SMA基因型，見圖7～圖8。

3 討 論

SMA是導(dǎo)致嬰幼兒殘障的主要遺傳病之一，發(fā)病年齡早，進(jìn)展快，死亡率高。隨著諾西那生鈉被正式納入醫(yī)保，大大推動(dòng)了我國SMA新生兒篩查的開展[9]。根據(jù)中國新生兒篩查專家共識《高通量測序在單基因病篩查中的應(yīng)用》，SMA完全符合新生兒單基因病基因篩查的病種和基因選擇原則[14]。為了減輕患者及其家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和生理心理創(chuàng)傷，提升我國出生人口素質(zhì)，在大力推廣孕前/產(chǎn)前攜帶者篩查的同時(shí)，我國也亟待開展大規(guī)模新生兒人群SMA篩查。

本研究建立了一種干血斑基因組DNA自動(dòng)化提取方法，并根據(jù)臨床基因檢測項(xiàng)目的實(shí)際情況，模擬設(shè)計(jì)了各種檢測條件，包括干血斑最低起始用量、新生兒干血斑標(biāo)本不同保存時(shí)長、EDTA抗凝血的不同運(yùn)輸與保存條件等，提取各類干血斑樣本基因組DNA，并驗(yàn)證SMN1檢測的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，無論采用新生兒足跟血干血斑或是EDTA抗凝血制備的干血斑，最少使用1片直徑為4mm的干血斑即可進(jìn)行基因組DNA自動(dòng)化提取和SMN1檢測；4℃避光保存長達(dá)24個(gè)月的新生兒干血斑標(biāo)本，經(jīng)冷鏈運(yùn)輸48～72h或-80℃超低溫冷凍保存1～2年的EDTA抗凝血所制備的干血斑標(biāo)本，均能夠穩(wěn)定進(jìn)行SMN1檢測，證明干血斑可作為SMA篩查的首選樣本類型之一。

本研究把SMN1檢測所需干血斑面積降至最低，以最大程度地減少所需新生兒的血量；另外，干血斑便于運(yùn)輸與保存，可為SMA孕前/產(chǎn)前基因篩查及轉(zhuǎn)診網(wǎng)絡(luò)建設(shè)發(fā)揮重要作用。

目前臨床基因檢測最常使用的樣本為外周靜脈血，需要專業(yè)醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行靜脈穿刺，且采集好的血液需要通過冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室待檢。另外，血液樣本在檢驗(yàn)前后均需保存在-80℃超低溫冰箱，以最大程度地避免基因組DNA降解。

相較于靜脈血，干血斑樣本的采集、運(yùn)輸及保存都更為簡便、快捷和安全。新生兒可采取少量足跟血，滴于專用濾紙上，自然晾干，制成干血斑樣本，采樣過程疼痛感低，病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)也較靜脈采血低。相比于靜脈血樣的冷鏈運(yùn)輸，干血斑樣本的寄送僅需普通快遞即可。另外，干血斑樣本的儲(chǔ)存條件也相對較低，可在4℃環(huán)境下穩(wěn)定保存，占用空間也小得多[15]。血斑干燥后，生物危害性也降低。因此，干血斑標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和保存具有簡便、安全且低成本的優(yōu)勢。

3.2 改良的基因組DNA自動(dòng)化提取方法SMN1檢測對DNA濃度要求較低，但對純度要求較高。由于制備干血斑的濾紙片中含有大量纖維素，干血斑在裂解、洗脫過程中會(huì)有大量的濾紙纖維脫落在洗脫液中，影響后續(xù)磁珠吸附DNA的過程，嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。本研究嘗試采用了不同提取試劑盒，所提取的DNA純度差別較大。經(jīng)嚴(yán)格挑選，本研究中所使用的干血斑基因組DNA提取試劑盒，能夠很好的去除雜質(zhì)干擾，提高DNA提取效率和質(zhì)量。而且提取過程操作簡便，通量大，可同時(shí)提取96個(gè)樣本，尤其適用于大樣本批量提取和檢測。

3.3 用于SMN1檢測的血斑最低起始用量通過不同面積干血斑測試，結(jié)果提示直徑為3mm的干血斑2片或3片均可滿足SMN1檢測要求。如果使用2～3片直徑為3mm的干血斑，打孔操作復(fù)雜，干血斑使用面積較大，為了提高操作簡便性，減少樣本使用量，通過計(jì)算血斑面積，得出1片直徑為4mm的干血斑面積(12.56mm2)基本接近2片3mm的干血斑面積之和(14.13mm2)。因此，本研究選取1片直徑為4mm的新生兒干血斑和新鮮采集的EDTA抗凝血所制備的干血斑，分別提取基因組DNA，測試SMN1檢測穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，1片直徑為4mm的干血斑即可滿足SMN1檢測要求。

無論對于受檢者或是臨床醫(yī)生，僅使用1片直徑為4mm的干血斑都具有明顯的優(yōu)勢，樣本使用量少，采血量少，打孔操作簡便，大大提升了大規(guī)模人群SMA篩查的可行性和便利性。尤其在現(xiàn)有新生兒篩查體系下，僅使用少量干血斑標(biāo)本，無需額外采樣即可滿足SMN1檢測需求，使得在常規(guī)新生兒篩查病種的基礎(chǔ)上增加SMA篩查具備了可操作性。

本研究對4℃避光條件下不同保存時(shí)長的新生兒干血斑標(biāo)本分別進(jìn)行了基因組DNA提取和SMN1檢測，結(jié)果顯示4℃避光保存了1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月和24個(gè)月的干血斑標(biāo)本，所提取的DNA質(zhì)量良好，與新鮮制備的干血斑標(biāo)本無顯著差異，且可以穩(wěn)定進(jìn)行SMN1檢測。這可能與干血斑標(biāo)本中的血斑已經(jīng)完全干燥，且獨(dú)立密閉保存，受外界環(huán)境因素影響小有關(guān)。采用干血斑標(biāo)本克服了靜脈血樣儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件相對較高的問題，為大規(guī)模人群篩查提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，也為僅進(jìn)行了常規(guī)新生兒篩查的嬰幼兒提供了延遲檢測SMA基因型的機(jī)會(huì)。另外，由于遺傳檢測本身存在不可避免的技術(shù)局限性和一定的適用范圍，可能會(huì)出現(xiàn)篩查范圍外變異類型所致的SMA，可通過長期保存的干血斑標(biāo)本復(fù)檢驗(yàn)證，提高診斷率。

孕前/產(chǎn)前攜帶者篩查可使用EDTA抗凝血樣本，但血液樣本不易存儲(chǔ)和運(yùn)輸，將其制備成干血斑標(biāo)本后，可大大提高檢測便利性。本研究將新鮮采集的EDTA抗凝血、新鮮采集并經(jīng)冷鏈運(yùn)輸48～72h的EDTA抗凝血及-80℃超低溫冷凍保存1～2年的EDTA抗凝血分別制成干血斑，提取基因組DNA，檢測SMA基因，對照結(jié)果，均能穩(wěn)定檢出SMA基因型。這對于地域偏遠(yuǎn)、醫(yī)療條件相對落后的區(qū)域提供了轉(zhuǎn)診可能性，有利于擴(kuò)大SMA篩查覆蓋度。

綜上所述，干血斑標(biāo)本由于其樣本采集、制備、運(yùn)輸和保存方便，是SMA大規(guī)模人群篩查最為有利的采樣方式，尤其適用于新生兒篩查。建立干血斑基因組DNA自動(dòng)化提取和基因檢測方法和流程，有利于推廣大范圍SMA防控工作。