韓姍姍，李忠玲，張 強，2，岳淑寧，2

（1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 臨潼 710600）

發(fā)酵床是將墊料和牲畜糞便（或泥土）混合讓其發(fā)揮協(xié)同發(fā)酵作用，快速轉(zhuǎn)化生糞、尿等養(yǎng)殖廢棄物，去除養(yǎng)殖臭味，改善奶牛生長環(huán)境，實現(xiàn)無污染和低排放［1-2］。發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)包含異位的提前發(fā)酵技術(shù)和原位的干撒式發(fā)酵技術(shù)。發(fā)酵床的正常運行對養(yǎng)殖場至關(guān)重要，影響發(fā)酵床正常運行的主要因素包括墊料含水量、翻倒頻率、墊料厚度［3］。發(fā)酵床內(nèi)部是一個多菌種參與的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，不同的動物養(yǎng)殖場有不同的內(nèi)生菌種，發(fā)酵床墊料厚度不同［4］。發(fā)酵床的維護和適宜厚度既能提高發(fā)酵效果，又能促進動物健康生長。該研究將發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)對應(yīng)的奶牛健康狀況、生鮮乳品質(zhì)及發(fā)酵床不同深度的菌群組成結(jié)構(gòu)進行對比，為促進發(fā)酵床在奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 奶牛養(yǎng)殖場基本情況

試驗樣本均采集于陜西省西安市閻良區(qū)海文畜牧養(yǎng)殖專業(yè)合作社，2018年2月開始運行，飼養(yǎng)密度15 m2/頭，奶牛共500頭，發(fā)酵床養(yǎng)殖300頭，無發(fā)酵床養(yǎng)殖200頭。奶牛養(yǎng)殖場采用生物墊料發(fā)酵床養(yǎng)殖模式，發(fā)酵床已成功運營2年，處于穩(wěn)定期。

1.2 發(fā)酵床的制作

發(fā)酵床墊料厚度約為60 cm。墊料的補充料為3種，即稻殼和干牛糞渣（F1），鋸末屑（F2），稻殼粉（F3）。

1.3 發(fā)酵床的日常管理

每天3次飼喂時間為6:00、12:30和19:00，自由飲水，發(fā)酵床濕度控制在50%左右，墊料不定期翻動，保證發(fā)酵床墊料的透氣性，并根據(jù)發(fā)酵床含水量適時調(diào)整牛群密度和補充新墊料。

1.4 發(fā)酵床不同深度樣本采集信息

取樣用所有工具和容器經(jīng)過滅菌消毒預(yù)處理。以五點取樣法［5］，采集深度為表層5 cm（樣品編號為A）、中層25 cm（樣品編號為B）、深層45～50 cm（樣品編號為C）的發(fā)酵床樣本。以墊料補充料為對照，編號為K。樣品采集時間為2020年6月18日、6月25日和7月2日。每層樣品3個重復(fù)，取樣量為10 g，保存于無菌離心管中，置于含干冰的泡沫箱中送至檢測實驗室。試驗期間每日擠奶2次（7:30和14:30），無菌生鮮乳樣品（250 mL/每份）采集后置于冰盒，運至實驗室后，根據(jù)《中國荷斯坦牛生產(chǎn)性能測定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 1450—2007）添加重鉻酸鉀作為防腐劑，4℃保存。

1.5 理化指標(biāo)測定方法

樣品溫濕度測定采用土壤溫濕度儀（型號：TR-6，順科達），氨氣濃度和硫化氫濃度測定采用便攜式氣體檢測儀（型號：BH-90，3.7VDC，保時安）。含水量測定參照《土壤水分測定法》（GB 7172—87）。

1.6 細菌計數(shù)用培養(yǎng)基

生鮮乳體細胞計數(shù)采用體細胞計數(shù)儀（Somacount 150）進行。生鮮乳中的菌落總數(shù)測定采用稀釋樣本無菌接種于不同培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2 d后，檢查生長菌落的數(shù)量。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（Mac Conkey，MAC），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）用于大腸埃希菌的計數(shù)。麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基（MacConkey-inositol-carbenicillin agar）用于培養(yǎng)克雷伯菌。COBA培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司）用于牛乳腺炎鏈球菌的選擇性分離培養(yǎng)。

1.7 細菌和真菌測序

采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。使用帶Barcode的特異引物515F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）測定細菌16S rDNA V4區(qū)基因，測定真菌ITS1區(qū)的特異引物為ITS5-1F-F（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS1-1F-R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）。測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司的Illumina Nova測序平臺完成。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗所得理化指標(biāo)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式記錄，數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism8.0軟件，不同測定指標(biāo)與不同深度樣品的組間差異性采用單因素方差分析，鄧肯法進行多重比較，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。微生物群落結(jié)構(gòu)即Alpha多樣性分析使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算，組間差異分析采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗。采用生物信息軟件包PICRUSt（適用于細菌16S）和FunGuild平臺（適用于真菌ITS）進行微生物基因預(yù)測，并在對應(yīng)的生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫中進行比對注釋?；谧⑨尳Y(jié)果，對預(yù)測的功能同時做t檢驗差異分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 致病菌的分離培養(yǎng)

存在于墊料、草料和臥床等環(huán)境中的細菌病原體，包括大腸埃希菌（Escherichia coli）、克雷伯菌（Klebsiella spp.）和乳房鏈球菌（Streptococcus uberis），是引起奶牛臨床乳腺炎的常見原因［6］，因此，發(fā)酵床管理是奶牛養(yǎng)殖中特別重要的一個環(huán)節(jié)。通過對比兩組養(yǎng)殖模式下奶牛墊料的環(huán)境性乳腺炎致病菌菌落數(shù)，采用發(fā)酵床的養(yǎng)殖管理方法，3種致病菌的菌落數(shù)均低于未使用發(fā)酵床的樣本。奶牛養(yǎng)殖場有無發(fā)酵床養(yǎng)殖的樣本致病細菌數(shù)對比，見表1。

表1 不同養(yǎng)殖模式的環(huán)境性乳腺炎致病菌數(shù)量 單位：CFU/mL

2.2 應(yīng)用發(fā)酵床的奶牛健康狀況和產(chǎn)奶質(zhì)量檢測

肢蹄病是養(yǎng)殖場的一種常見病。兩年期間，未使用發(fā)酵床的樣本肢蹄病統(tǒng)計發(fā)病率為25%，使用發(fā)酵床的樣本統(tǒng)計發(fā)病率為3%。乳汁中的體細胞數(shù)（SCC）間接反映了牛奶品質(zhì)及奶牛的健康狀況，當(dāng)SCC大于500 000 cells/mL時為隱形乳房炎［7］。在監(jiān)測期間，應(yīng)用發(fā)酵床養(yǎng)殖的奶牛平均產(chǎn)奶量為（32.5±0.2）kg/d，未使用發(fā)酵床樣本產(chǎn)奶量（24.7±0.1）kg/d，兩者差異顯著（P＜0.05）。而發(fā)酵床養(yǎng)殖的奶牛生鮮乳SCC平均值為216 000 cells/mL，低于未使用發(fā)酵床的奶牛SCC平均值（269 000 cells/mL）。由此可見，應(yīng)用發(fā)酵床管理降低了奶牛乳房炎和肢蹄病的發(fā)病概率。生鮮乳的微生物含量是評價其質(zhì)量的一個重要指標(biāo)?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 生乳》（GB 19301—2010）規(guī)定了生鮮乳中的細菌總數(shù)不得超過2×106CFU/mL。通過對比40份生鮮乳樣本發(fā)現(xiàn)，使用稻殼和干牛糞渣為墊料，生鮮乳中細菌的菌落總數(shù)最少，其次是稻殼粉墊料和鋸末。不同類型墊料對應(yīng)的生鮮乳細菌數(shù)，見表2。后期試驗圍繞以稻殼和干牛糞渣為墊料的發(fā)酵床開展。

表2 不同類型墊料對應(yīng)的生鮮乳細菌數(shù)（n=40）單位：×102 CFU/mL

2.3 兩年期發(fā)酵床基本理化指標(biāo)測定

奶牛養(yǎng)殖中發(fā)酵床的適宜濕度為55%～80%［8］。以稻殼和干牛糞渣為墊料的發(fā)酵床在使用2年后，發(fā)酵床含水量仍適宜，有利于微生物發(fā)酵分解牛糞，減少有害氣體（H2S、NH3）產(chǎn)生。微生物代謝能是發(fā)酵床溫度的主要來源［9］。微生物活動的核心層是發(fā)酵床中層，對應(yīng)的溫度高于對照組，差異顯著。在經(jīng)過2年使用后，處于穩(wěn)定期的發(fā)酵床墊料pH值均在7.6左右，仍適宜微生物生長繁殖。表層墊料pH值略高于中層和深層，這與不同深度的微生物構(gòu)成及其代謝產(chǎn)物有關(guān)，但未出現(xiàn)顯著差異。墊料的pH值關(guān)系到墊料補充時機、翻動頻率等日常管理和廢棄墊料利用［10］。夏季是奶牛場有害氣體濃度最高的季節(jié)，關(guān)系到牛場的空氣質(zhì)量，進而影響奶牛的生長及奶產(chǎn)品質(zhì)量。試驗組發(fā)酵床各層的氨氣濃度顯著（P＜0.05）高于對照組。在采用發(fā)酵床的牛場樣本中未檢出硫化氫。兩年期發(fā)酵床不同深度樣本的基本理化數(shù)據(jù)，見表3。

表3 兩年期發(fā)酵床不同深度樣本的基本理化數(shù)據(jù)

2.4 不同厚度發(fā)酵床的細菌分布規(guī)律

微生物發(fā)酵床厚度一般為60～100 cm，不同厚度和不同使用年限對發(fā)酵床內(nèi)的微生物種類和數(shù)量均有影響［5］。該試驗中，發(fā)酵床中層墊料的微生物菌落總數(shù)最高，數(shù)量級可達107～108，深層墊料中微生物存在量最?。≒＜0.05），數(shù)量級維持在105～106。發(fā)酵床的菌群結(jié)構(gòu)是基于Illumina Nova測序平臺測序完成的。通過對Reads拼接，平均每個樣品測得81 944條tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到78 396條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達51 905，質(zhì)控有效率達63.30%。以97%的一致性將序列聚類成 為OTUs（operational taxonomic units），共 得 到2 315個OTUs，有效堿基數(shù)為21 661 78 bp，序列平均長度為417.33 bp。如圖1（a）所示，測得的物種數(shù)在A-K、B-K組間具有顯著（P＜0.05）差異，顯著性P值為0.024 2、0.024 2。 測得的物種數(shù)在C-K、A-C、B-C等組間不具有顯著差異（P＞0.05），P值為0.118 2、0.337 1、0.337 1等。圖1（b）中，Alpha多樣性指數(shù)（Shannon）分別為A組6.69±0.521，B組6.997±0.101，C組6.445±0.290，K組5.747±0.445。多樣性數(shù)據(jù)通過wilcox秩和檢驗在B-K、A-K組間具有顯著（P＜0.05）差異，顯著性P值為0.009 4、0.049 3，即5 cm和25 cm厚的發(fā)酵床細菌多樣性最高，表層和中層的細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。多樣性指數(shù)在B-C、C-K、A-B等組間不具有顯著差異（P＞0.05）。由于墊料表層易受奶牛糞便、環(huán)境等影響，墊料中層更能反映發(fā)酵床微生態(tài)結(jié)構(gòu)。據(jù)報道，發(fā)酵墊料15～30 cm處為發(fā)酵核心區(qū)域，細菌代謝旺盛［11-12］，但墊料的微生物多樣性會隨著發(fā)酵床使用年限增加而降低［13］。在該研究中，兩年期的發(fā)酵床微生物群落多樣性仍略高于未發(fā)酵墊料。在細菌門水平上差異豐度比較分析顯示（見圖2），未發(fā)酵的墊料樣本中放線菌門最多，占整個體系的42.6%，其次為變形菌門（23.3%）和厚壁菌門（23%）。隨著發(fā)酵床厚度增加，變形菌門含量從49%降至32%，這與表層和中層墊料中有大量的動物糞便相關(guān)，該類細菌主要參與氮、硫等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。放線菌門主要活躍在表層（19.5%）和中層（21%），深層含量最少（6.4%）。墊料經(jīng)過發(fā)酵可以有效減少放線菌門豐度，這與陳倩倩等［14］的研究結(jié)果一致。擬桿菌門在未發(fā)酵墊料中很少（1%），但隨發(fā)酵床厚度增加呈現(xiàn)增多趨勢，在表層占9.6%，中層14.5%，深層28.3%，該類細菌主要參與碳循環(huán)。厚壁菌門在各層發(fā)酵床的比例為表層12.2%，中層16%，深層19%。據(jù)報道，厚壁菌門中的芽孢桿菌屬細菌和梭菌屬細菌對墊料中有機質(zhì)的降解具有重要作用［15］。筆者發(fā)現(xiàn)在屬水平上有大量的細菌菌屬（＞70%）還有待鑒定。

圖1 發(fā)酵床不同深度樣本的細菌差異分析圖

圖2 發(fā)酵墊料的門水平上的細菌構(gòu)成

2.5 不同厚度發(fā)酵床的真菌分布規(guī)律

在真菌菌群結(jié)構(gòu)分析中，平均每樣品測得89 870條，經(jīng)過質(zhì)控平均得到81 613條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達63 932，質(zhì)控有效率達71.69%。以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs，共得到2 208個OTUs。通過對樣品的復(fù)雜度分析，發(fā)現(xiàn)測得的真菌物種數(shù)隨著發(fā)酵床深度增加有增多趨勢。纖維素分解依賴于分解能力很強的真菌［12］，這也為參與碳循環(huán)的細菌生長提供了碳源。如圖3所示，在C-K組間具有顯著（P＜0.05）差異，顯著性P值為0.016 3。測得的物種數(shù)在B-K、AC、A-K等組間不具有顯著差異（P＞0.05），P值分別為0.062 3、0.151 0、0.186 9。反映Alpha多樣性的Shannon指數(shù)在C-K、A-K、B-K組間具有顯著（P＜0.05）差異，顯著性P值分別為0.012 6、0.032 0、0.040 6，說明微生物的轉(zhuǎn)化作用是發(fā)酵床的真菌多樣性增加的原因之一。Shannon指數(shù)在B-C、AC、A-B組間不具有顯著差異（P＞0.05），說明發(fā)酵床不同深度樣品具有相似的真菌群落組成。結(jié)合物種數(shù)量和多樣性指數(shù)值，發(fā)酵床的厚度對真菌結(jié)構(gòu)影響不大（P＞0.05）。發(fā)酵后，真菌多分布在深層（P＜0.05）。經(jīng)過LEFSe分析組間差異物種，將差異貢獻值LDA大于4的物種選擇為具有統(tǒng)計學(xué)差異的biomarker。筆者發(fā)現(xiàn)樣品B組和K組間的差異特異物種共11個，結(jié)合它們的豐度信息和進化關(guān)系，有6個重要類別分別隸屬毛殼菌科（Chaetomiaceae）、糞 殼 菌 綱（Sordariomycetes）、糞殼菌目（Sordariales）、曲霉菌科（Aspergillaceae）、散囊菌目（Eurotiales）和散囊菌綱（Eurotiomycetes）。在B、C組和K組間的差異物種共3個，分別隸屬曲霉屬（Aspergillus）、桃色頂孢霉（Acremonium persicinum）和馬爾尼菲藍狀菌（Talaromyces marneffei）。

圖3 發(fā)酵床不同深度樣本的真菌差異分析圖

2.6 發(fā)酵床微生物菌群代謝功能預(yù)測

根據(jù)細菌和真菌測序數(shù)據(jù)進行基于KEGG數(shù)據(jù)庫和已有真菌環(huán)境功能數(shù)據(jù)庫的功能預(yù)測，如圖4所示，各組樣本中相對豐度較高的細菌菌群功能相似，菌群代謝相關(guān)的通路約占50%，是有機質(zhì)發(fā)酵降解的主力軍，代謝旺盛。具有分解作用的腐生真菌多集中在發(fā)酵床深層，在C組中大約占8.2%，但大部分功能還有待注釋。

圖4 發(fā)酵床細菌Level1層級（a）和真菌（b）功能注釋相對豐度柱形圖

3 結(jié)論

發(fā)酵床是當(dāng)今流行的一種環(huán)保型養(yǎng)殖模式，核心在于利用有益微生物的強大轉(zhuǎn)化能力，實現(xiàn)養(yǎng)殖動物糞尿中的有機物完全降解，達到零排放的目的。一般發(fā)酵床主要由有機墊料組成，厚度根據(jù)養(yǎng)殖動物不同進行調(diào)整。在持續(xù)穩(wěn)定運行兩年后，以稻殼和干牛糞為墊料的發(fā)酵床的基礎(chǔ)參數(shù)（溫度、含水量、pH值、硫化氫等指標(biāo)）仍能滿足生產(chǎn)需要，細菌群落對整個發(fā)酵床的微生態(tài)系統(tǒng)影響很大。應(yīng)用該發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)，生鮮乳品質(zhì)和奶牛健康狀況有所改善。