杜珍武，艾冬晴，李智慧，李 楠，馬錦浩，張楚群，張桂珍,

(1.長(zhǎng)春腫瘤醫(yī)院 基因檢測(cè)中心，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué) 第二醫(yī)院骨科研究所，長(zhǎng)春 130041)

0 引言

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)屬于乳頭瘤空泡病毒科，含有雙鏈DNA基因組，遺傳物質(zhì)被一個(gè)二十面體衣殼包圍，病毒具有高度的組織特異性，可感染皮膚和粘膜上皮。根據(jù)編碼主要衣殼蛋白的基因組序列，已經(jīng)鑒定了200多種HPV類型[1]，其中至少有14種可能導(dǎo)致癌癥的高危類型[2]。兩種高危HPV類型(16和18)導(dǎo)致與HPV相關(guān)的癌癥最多，約70%的宮頸癌和癌前宮頸病變與這兩種類型感染相關(guān)[3]。其他與宮頸癌密切相關(guān)的高危HPV類型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68[4]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2018年在全世界范圍內(nèi)，高風(fēng)險(xiǎn)HPV導(dǎo)致約5%的癌癥病例，估計(jì)每年女性感染人數(shù)為570 000，約有311 000名婦女死于宮頸癌，我國(guó)患者占總數(shù)的1/15[5]。實(shí)施宮頸癌早期篩查，提供及時(shí)的防治手段是有效降低宮頸癌死亡率的重要策略，其中通過(guò)HPV病毒感染的定期監(jiān)測(cè)是宮頸癌早期防治的重要手段[6]。然而，由于人口、地理和種族因素的差異，HPV感染率和基因型分布具有國(guó)家和地區(qū)差異[7-10]，導(dǎo)致HPV感染誘導(dǎo)的宮頸癌前病變及不同癌亞型的分布差異，從而對(duì)宮頸癌防治方案制定產(chǎn)生影響[11-12]。因此，充分調(diào)查各地區(qū)HPV的感染和基因型分布情況，對(duì)于制定適當(dāng)?shù)膶m頸癌監(jiān)測(cè)、預(yù)防和控制策略，是非常重要的。

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)報(bào)道了HPV感染流行病學(xué)調(diào)查分析，而長(zhǎng)春地區(qū)HPV的感染流行病學(xué)調(diào)查分析報(bào)道較少，并且數(shù)據(jù)來(lái)源于3年前，不能有效地反應(yīng)當(dāng)前本地區(qū)HPV的感染情況[13-15]。因此，本研究擬對(duì)2020年至2021年吉林省長(zhǎng)春地區(qū)女性檢測(cè)HPV感染的資料進(jìn)行了分析，對(duì)感染的HPV基因類型及感染人群特征進(jìn)行評(píng)估，為該地區(qū)HPV疫苗的接種與HPV篩查以及全國(guó)HPV感染情況流行性調(diào)查提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本一般資料

2051例女性標(biāo)本來(lái)源于 2020年10月至2021年11月在長(zhǎng)春腫瘤醫(yī)院基因檢測(cè)中心檢查的健康體檢人群、門診及住院患者。檢測(cè)人群全部來(lái)自吉林省長(zhǎng)春地區(qū)，年齡 15～79 歲，平均(42±11) 歲。按照年齡段共分為5組：15～30歲、30～40歲、40～50歲、50～60歲及60歲以上。所有患者均為初次HPV檢測(cè)，排除第2次復(fù)檢數(shù)據(jù)。

1.2 儀器與試劑

基因擴(kuò)增儀為ABI 2720 PCR儀(美國(guó)THERMO公司)；分子雜交儀為凱普HHM-3型分子雜交儀(潮州凱普公司)；人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測(cè)試劑盒(PCR-膜雜交法) 購(gòu)自潮州凱普生物化學(xué)有限公司。

1.3 宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本采集

由醫(yī)生以擴(kuò)陰器暴露宮頸口，用棉拭子將宮頸口過(guò)多的分泌物擦去。將宮頸刷伸入宮頸口處，輕輕搓動(dòng)宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈，慢慢取出宮頸刷，將其放入裝有細(xì)胞保存液的樣本管中。在管口處將多余的刷柄折斷，將刷頭留在樣本管中,旋緊管蓋，并注明編號(hào)和日期。樣本保存后，如不能馬上檢測(cè)，將樣本置于冰箱在4℃存放，并在兩周時(shí)間內(nèi)檢測(cè),避免反復(fù)凍融。

1.4 HPV分型檢測(cè)方法

按照人乳頭瘤病毒(HPV)分型檢測(cè)試劑盒(PCR-膜雜交法) 操作過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，主要過(guò)程如下：①應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒提取采集的宮頸脫落細(xì)胞DNA，以此DNA為模板擴(kuò)增出21種HPV基因型的目的片段；②將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜條上的包括15種高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型)和6種低危型(6、11、42、43、44、81型)在內(nèi)的分型探針以及內(nèi)控探針進(jìn)行雜交。雜交膜用肉眼觀察，膜上所在圓圈見紫藍(lán)色圓點(diǎn)判斷為陽(yáng)性，反之則為陰性。根據(jù)膜條上不同HPV分型分布圖判斷HPV分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用IBM SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV基因總體檢測(cè)結(jié)果

2051例樣本共檢出329例陽(yáng)性標(biāo)本，總陽(yáng)性率為16.05%。其中單獨(dú)感染低危HPV的樣本為19例(占0.93%)，單獨(dú)感染高危HPV樣本為298例(占14.53%)，高低危HPV混合感染樣本為12例(占0.59%)。在310例高危HPV感染的樣本中，存在單一HPV基因分型及多個(gè)HPV基因分型同步感染的樣本，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。其中單一HPV分型感染樣本為256例(占12.48%)，2個(gè)HPV基因分型感染樣本為43例(占2.09%)，3個(gè)HPV基因分型感染樣本為9例(占0.44%)，4個(gè)HPV基因分型感染樣本為1例(占0.05%)，5個(gè)HPV基因分型感染樣本為1例(占0.05%)。2個(gè)以上HPV基因分型感染率具體情況如表1所示。本部分結(jié)果括號(hào)中的百分比均為樣本例數(shù)除以總樣本數(shù)。

圖1 PCR-膜雜交法進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)結(jié)果圖(除內(nèi)控外，膜上出現(xiàn)紫藍(lán)色的每一個(gè)圓點(diǎn)代表一個(gè)HPV基因分型)

表1 高危HPV多個(gè)分型多重感染分布特征

2.2 HPV基因分型分布

在測(cè)序的21 種 HPV 基因亞型中，只有HPV42型未在樣本中檢出，其他亞型具有不同程度的檢出。高危型感染前5 位的亞型分別是:HPV16(3.61%)、HPV52(2.93%)、HPV58(2.10%)、HPV53(1.76%)和HPV31(1.22%)。具體HPV基因分型分布情況如圖2所示。本結(jié)果統(tǒng)計(jì)各個(gè)高危亞型陽(yáng)型數(shù)量為單純感染與多重感染陽(yáng)性樣本之和。

圖2 長(zhǎng)春地區(qū)女性感染 HPV 基因亞型分布情況本圖感染率(%)=(各HPV基因分型陽(yáng)性數(shù)目)/ 2051(總?cè)藬?shù))×100%

2.3 不同年齡段HPV檢出情況

通過(guò)對(duì)不同年齡段的HPV感染分析結(jié)果顯示，高危HPV陽(yáng)性率最高是60歲以上人群(占21.54%)，其次為15～30年齡段人群(占19.33%)。如表2所示，60歲以上人群高危HPV感染率與15～30年齡段人群感染率無(wú)差異，但與其他年齡段感染率相比具有顯著差異，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。15～30年齡段人群高危HPV感染率與31～40年齡段人群及51～60年齡段人群感染率相比具有顯著差異，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。

表2 不同年齡段的高危HPV感染率

2.4 高感染率的高危HPV分型在不同年齡段感染情況

分析前3個(gè)高感染率的HPV16、52及53型在不同年齡段感染率，結(jié)果顯示HPV16型的高感染率年齡階段在41～50歲，而HPV52主要在15～30及60歲以上的年齡階段，HPV53的高感染率年齡階段在41歲以后。具體結(jié)果如圖3所示。

圖3 HPV16、52及53分析在不同年齡階段感染情況

2.5 15～30年齡段感染高危HPV基因型分布

通過(guò)上述分析發(fā)現(xiàn)15～30年齡段屬于高危HPV感染的高年齡段，進(jìn)一步分析其感染的HPV基因型發(fā)現(xiàn)這一年齡段高危型感染前4 位的亞型分別是：HPV52(4.20%)、HPV16(3.72%)、HPV58(3.78%)和HPV31(2.94%)。具體HPV基因分型分布情況如圖4所示。

圖4 15～30年齡段感染高危HPV基因型分布圖注：計(jì)算感染率=(各HPV基因分型陽(yáng)性數(shù)目)/ 238(本年齡段人數(shù))

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)2051例長(zhǎng)春地區(qū)健康女性宮頸上皮細(xì)胞樣本HPV基因檢測(cè)結(jié)果分析，評(píng)估了HPV在人群中感染情況及相關(guān)基因型分布，對(duì)HPV在本地區(qū)的流行特點(diǎn)提供相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究數(shù)據(jù)顯示，HPV在本地區(qū)人群中的總體陽(yáng)性率為16.05%，其中以高危HPV感染為主(占總感染樣本的91%)。本研究的HPV感染率與高超等報(bào)道的2018年長(zhǎng)春地區(qū)505例女性體檢人群HPV毒感染率(13.7%)一致[14]，低于朱科靜等報(bào)道的2018年長(zhǎng)春地區(qū)946例HPV總感染率(30.23%)[15]，說(shuō)明在同一地區(qū)由于檢測(cè)人群及檢測(cè)方法不同，造成檢測(cè)感染率不同。因此，對(duì)于本地區(qū)HPV毒感染率需要綜合多個(gè)報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行分析。本研究獲得感染率與YU HAO等總結(jié)的我國(guó)多個(gè)省市HPV感染率(12.09%～30.21%)相比屬于低水平感染地區(qū)[10]，這說(shuō)明了HPV感染存在地區(qū)差異。

本研究檢出的310例高危HPV感染的樣本中包括單一HPV基因型與多個(gè)HPV基因型感染，其中以單一HPV基因分型為主(256例，82.56%)，HPV基因型混合檢出中(54例，17.44%)以雙HPV分型檢出為主(43例，79.63%)，本研究最多檢測(cè)到5種HPV基因型混合感染。通過(guò)分析這些混合感染發(fā)現(xiàn)以HPV16型及52型混合感染為主。在本研究中高危HPV檢出率最高的前五位是：HPV16(3.61%)、HPV52(2.93%)、HPV58(2.10%)、HPV53(1.76%)和HPV31(1.22%)。最近國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道的高危HPV檢出率最高的HPV基因型基本為這五個(gè)型，只是不同地區(qū)的感染率略有不同[16-20]。當(dāng)前針對(duì)HPV疫苗包括二價(jià)疫苗(針對(duì)HPV16、18型)、四價(jià)疫苗(針對(duì)HPV6、11、16、18型)和九價(jià)疫苗(針對(duì)HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58型)。通過(guò)上述HPV感染基因型分析結(jié)果提示，接種九價(jià)疫苗可能產(chǎn)生對(duì)人群更好的HPV感染防護(hù)。因此，及時(shí)了解本地區(qū)的HPV不同基因型感染流行特點(diǎn)，對(duì)其防治有重要指導(dǎo)作用。

關(guān)于不同年齡段HPV感染率，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了感染率隨年齡呈“雙峰”分布,感染高峰在30歲之前及60歲之后[21-22]，本研究的不同年齡段HPV感染率也符合這個(gè)規(guī)律。在30歲之前的HPV高感染可能與性生活混亂以及免疫功能不健全相關(guān)，但隨著免疫功能逐漸完善，感染的HPV病毒被清除[23]。60歲后感染增多與免疫功能低下，以往隱藏的病毒重新激活，這種感染容易發(fā)生長(zhǎng)期慢性感染，并造成宮頸癌[24].由于最近幾年宮頸癌發(fā)生的年輕化，對(duì)于青年女性的HPV檢測(cè)受到重視，特別是HPV感染的流行性調(diào)查發(fā)現(xiàn)30歲之前感染率高。朱科靜等對(duì)2017—2018年吉林省15～35歲的性活躍人群人乳頭瘤病毒感染情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其感染率為35.02%，而本研究該階段的感染率為19.33%，說(shuō)明隨著人們對(duì)于HPV感染重視，其感染率有所下降。因此，了解這部分人群HPV分型對(duì)于這部分人群HPV防治有一定指導(dǎo)作用。本研究分析發(fā)現(xiàn)在這個(gè)階段感染HPV的基因型主要為：HPV52(4.20%)、HPV16(3.72%)、HPV58(3.78%)和HPV31(2.94%)，這四種HPV分型分布與許珈豪等研究相一致[25]。

總之，通過(guò)本研究對(duì)吉林長(zhǎng)春地區(qū)女性檢測(cè)的HPV感染的資料進(jìn)行了分析，對(duì)感染的HPV基因類型及感染人群特征進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估長(zhǎng)春地區(qū)最新的HPV感染率低于國(guó)內(nèi)平均感染率，HPV感染以單一型別感染為主，其中高危型HPV16、52、58亞型為主要感染型別；感染年齡段以60歲以上人群及年輕人(小于30歲)為主，為本地區(qū)HPV疫苗的接種與HPV篩查以及為全國(guó)HPV感染情況流行性調(diào)查提供科學(xué)依據(jù)。