王蘭蘭,張 婷,周 英,關(guān) 軍,程 平,鄒 亮

(武漢市第一醫(yī)院血液內(nèi)科,武漢 430022;*通訊作者,E-mail:zouliang0127@163.com)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種以骨痛與病理性骨折、貧血、復(fù)發(fā)性感染、高鈣血癥、腎衰竭和異常出血為常見臨床表現(xiàn)的惡性腫瘤[1],其特征是單克隆漿細(xì)胞在骨髓中不受控制地增殖[2]。凋亡是一種程序化細(xì)胞死亡,許多針對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤凋亡的藥物顯示出較好的治療效果[3]。因此,抑制骨髓瘤細(xì)胞過度增殖,促進(jìn)凋亡是一個(gè)重要方向。DIS3基因突變被認(rèn)為是MM發(fā)病原因之一[4],但其具體作用機(jī)制目前還不清楚。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)各種生物過程,在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用,阻斷PI3K/AKT/mTOR通路已成為多種癌細(xì)胞治療新的靶點(diǎn)[5]。研究顯示,PI3K/AKT/mTOR與MM之間關(guān)系密切[6,7],因此,我們推測(cè)DIS3可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來發(fā)揮其作用。在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過過表達(dá)及干擾骨髓瘤細(xì)胞中DIS3基因,研究由此所致的細(xì)胞凋亡及其潛在作用機(jī)制,為臨床治療MM提供些許思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人骨髓瘤細(xì)胞株NCI-H929、RPMI 8226和U266購自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清及Lipofectamine 2000購于美國(guó)Invitrogen公司;真核表達(dá)載體PEGFP-N1購自美國(guó)Addgen公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)BD Biosciences公司;Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、AKT、mTOR、GAPDH以及山羊抗兔二抗IgG購自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將人骨髓瘤細(xì)胞株NCI-H929、RPMI 8226和U266分別培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10% FBS,1%青鏈霉素溶液),置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(5% CO2)進(jìn)行培養(yǎng)。將PEGFP-N1-DIS3及DIS3-siRNA根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書對(duì)NCI-H929、RPMI 8226和U266細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染8 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將3種細(xì)胞均按照以下模式分成5組:對(duì)照組(control)、DIS3-siRNA陰性對(duì)照(negative control, NC)組、DIS3空載組、DIS3過表達(dá)組、DIS3-siRNA組。將轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞按104個(gè)/孔的濃度進(jìn)行接種,每孔加100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液,置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集各組細(xì)胞,消化重懸后,4 ℃下1 000g,離心5 min,棄上清;加入1 ml預(yù)冷PBS后,1 000g,4 ℃離心5 min,然后分別加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各10 μl,輕輕混勻,室溫下避光孵育30 min后加入300 μl binding buffer,上機(jī)檢測(cè);使用CYEXPERT分析軟件對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和Caspase-3及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平

48 h后收集各組細(xì)胞,分別提取各組細(xì)胞樣本RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用20 μl PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增:上、下游引物各0.5 μl,SYBR Green Mix 10 μl,cDNA模板1 μl,ddH2O 8 μl。引物序列見表1。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 25 s,39個(gè)循環(huán);65 ℃ 5 s、95 ℃ 50 s。以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 凋亡相關(guān)基因和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences of apoptosis-related genes and PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related genes

1.5 Western bolt檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量

轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞,室溫下充分裂解細(xì)胞,離心后取上清,用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行測(cè)定。每孔上樣20 μg蛋白,經(jīng)12% SDS-PAGE電泳、分離、轉(zhuǎn)移、封閉后,分別加入兔抗人Bax抗體(1 ∶800),兔抗人Bcl-2抗體(1 ∶1 000),兔抗人Caspase-3抗體(1 ∶500),兔抗人PI3K抗體(1 ∶500),兔抗人AKT抗體(1 ∶500),兔抗人mTOR抗體(1 ∶800)及兔抗人GAPDH抗體(1 ∶1 000)。4 ℃孵育過夜后,加入羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,用PBST洗滌3次,每次5 min后,加入ECL化學(xué)發(fā)光劑,然后將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與DIS3空載組比較,DIS3過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05或P<0.01,見圖1)。

與DIS3空載組比較,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.05,##P<0.01圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NCI-H929、RPMI 8226和U266細(xì)胞凋亡水平Figure 1 Apoptosis of NCI-H929, RPMI 8226 and U266 cells detected by flow cytometry

與DIS3空載組比較,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.05,##P<0.01圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NCI-H929、RPMI 8226和U266細(xì)胞凋亡水平Figure 1 Apoptosis of NCI-H929, RPMI 8226 and U266 cells detected by flow cytometry

2.2 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平的影響

與DIS3空載組相比,DIS3過表達(dá)組NCI-H929、RPMI 8226和U266細(xì)胞Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01),Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組3種細(xì)胞Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01),而Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01,見圖2)。

2.3 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響

與DIS3空載組比較,DIS3過表達(dá)組3種細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組細(xì)胞Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05,見圖3)。

與DIS3空載組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,##P<0.01圖2 細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平的表達(dá)變化Figure 2 The mRNA levels of apoptosis-related indicators Bax, Bcl-2 and Caspase-3

與DIS3空載組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.01圖3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)量變化Figure 3 Changes in the expression of apoptotic proteins Bax, Bcl-2 and Caspase-3

2.4 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)PI3K、AKT、mTOR基因表達(dá)水平的影響

與DIS3空載組比較,DIS3過表達(dá)組3種細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01,見圖4)。

與DIS3空載組比較,*P<0.05,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,##P<0.01圖4 各組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR基因mRNA水平表達(dá)Figure 4 The mRNA level expression of PI3K, AKT, mTOR in three kinds of cells in each group

2.5 DIS3過表達(dá)或干擾對(duì)PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)的影響

與DIS3空載組比較,DIS3過表達(dá)組3種細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05或P<0.01);與DIS3-siRNA NC組比較,DIS3-siRNA組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.01,見圖5)。

3 討論

本課題組前期研究結(jié)果顯示,DIS3過表達(dá)組及DIS3干擾組轉(zhuǎn)染效果良好,其中DIS3-siRNA2對(duì)DIS3的沉默效果最佳[8],因此選用DIS3-siRNA2用于后續(xù)DIS3-siRNA組。本課題組前期研究結(jié)果顯示[9],DIS3能使人骨髓瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期,且可降低腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)。但其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的惡性生物學(xué)特征的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。王欣等[10]研究結(jié)果顯示,MTH1抑制劑能明顯抑制MM細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,可有效治療MM。提示抑制MM細(xì)胞增殖及促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡對(duì)于治療MM具有重要意義。本研究結(jié)果顯示,DIS3過表達(dá)能顯著促進(jìn)3種人骨髓瘤細(xì)胞的凋亡水平,表現(xiàn)為顯著增加的細(xì)胞總凋亡率、促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)升高以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低;反之,通過siRNA技術(shù)抑制DIS3的表達(dá)則從一定程度上抑制了癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程,表現(xiàn)為細(xì)胞總凋亡率降低、促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)下降以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)升高;提示對(duì)DIS3進(jìn)行表達(dá)調(diào)控能顯著影響骨髓瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程,其中過表達(dá)DIS3能對(duì)骨髓瘤細(xì)胞起到顯著的促凋亡作用。

PI3K/AKT/mTOR是一種重要的信號(hào)通路,其可以精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖和生存[11],其過度活化能夠抑制細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)低氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的耐受能力[12,13]。因此,PI3K/AKT/mTOR也成為多種腫瘤藥物的潛在作用靶點(diǎn)。研究表明,研究表明,在MM細(xì)胞中,敲低類固醇5α-還原酶I型基因表達(dá)通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制了細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生,提示MM細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征的改變?cè)谝欢ǔ潭壬弦蕾囉赑I3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活化[14]。在本研究中,我們也檢測(cè)了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因在mRNA及蛋白水平上的表達(dá),結(jié)果顯示,DIS3過表達(dá)能顯著促進(jìn)PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白表達(dá)量,而干擾DIS3表達(dá)能顯著抑制PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白表達(dá)量,提示DIS3的表達(dá)調(diào)控對(duì)骨髓瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)程的影響可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

與DIS3空載組比較,**P<0.01;與DIS3-siRNA NC組比較,#P<0.05,##P<0.01圖5 各組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR蛋白水平表達(dá)變化Figure 5 Protein expression of PI3K, AKT, mTOR in each group

綜上所述,DIS3過表達(dá)能顯著促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達(dá)水平并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT/mTOR途徑的活性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步深入研究了DIS3對(duì)MM細(xì)胞凋亡的影響及其潛在的作用機(jī)制,這為靶向治療MM的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。