汪懌璇，周詩悅，閆昭卉，方子超，肖雨露，方亦舟，黃光榮

（中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018）

0 引言

目前，隨著環(huán)境氣體污染和大氣臭氧層破壞程度的加劇，人們逐漸意識到紫外線輻射會對人的皮膚產(chǎn)生嚴重的危害，因此人們使用防曬化妝品進行皮膚保護的意識也越來越強。天然防曬劑以無污染、安全性高成為防曬霜中的研究熱點之一。色素類是天然防曬成分中的重要組成部分，如蝦青素[1]、黑荊樹皮原花色素[2]、烏雞黑色素[3]、魷魚黑色素等，特別是黑色素因其對紫外線的強吸收能力強而更受關注[4]。目前，魷魚墨中的黑色素大多采用高速離心法和化學法來提取制備[5-6]，李興旺等人[7]以魷魚墨為原料，提取粗黑色素并精制，得率為3.7%。有研究表明，超聲輔助法比單純的氫氧化鈉提取法提取的黑色素具有更好的抗氧化活性[8]。目前，對魷魚墨中的黑色素研究大多集中在提取方法[9-10]、抗氧化能力[11-12]、抗腫瘤能力[13]等功能研究上，對魷魚墨黑色素應用于防曬霜中用來抵抗紫外線的研究不多。試驗采用響應面優(yōu)化手段對魷魚墨中黑色素的超聲輔助堿法提取工藝進行優(yōu)化，并將提取的黑色素以海藻酸鈣微球進行包埋，應用于防曬霜中，初步評價其抗紫外線能力，以期為魷魚墨黑色素應用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

魷魚墨囊來自新鮮魷魚冷凍備用；氫氧化鈉、鹽酸、液體石蠟、司盤-80、吐溫-80、氯化鈣、石油醚、異丙醇、氯化鈉、十六醇、硬脂酸、甘油、羊毛脂、鈦白粉等，均為分析純。

1.2 儀器設備

Allegra X-30 型高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品；Scientz-5T 型超聲波提取儀、Scientz-30F 型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；UV2600 型紫外可見分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；S220K 型pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 魷魚墨黑色素提取基本工藝

參照郭欣等人[11]的方法，以超聲輔助堿提取方法制備可溶性魷魚黑色素，超聲功率為100 W。

1.3.2 單因素試驗

分別考查提取劑NaOH 濃度、超聲時間、提取溫度對黑色素提取率的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，進行Box-behnken 設計，選擇NaOH 濃度（X1），提取溫度（X2），提取時間（X3） 3 個因素，以黑色素得率為響應值設計三因素三水平的響應面試驗。

1.3.4 海藻酸鈣微球包埋魷魚墨黑色素的制備

用粒子交聯(lián)法制備微球[14]，并通過正交試驗，考查海藻酸鈉溶液濃度、油/水相體積比、氯化鈣濃度等因素對海藻酸鈣微球品質(zhì)的影響，獲得海藻酸鈣微球制備的最佳條件，在制備時添加不同質(zhì)量的黑色素，計算包封率。

1.4 測定方法

1.4.1 黑色素提取率的測定

參考江凱等人[9]的方法，以冷凍干燥得到的黑色素質(zhì)量與原料魷魚墨質(zhì)量的比值來計算黑色素的提取率。

1.4.2 海藻酸鈣微球的形態(tài)

取少量微球于載玻片上，涂抹均勻，于光學顯微鏡下觀察[2]。

1.4.3 海藻酸鈣微球的包封率測定

分別以1.3.3 最優(yōu)條件下制備、冷凍干燥后的黑色素和空白微球為標準樣品，測定不同濃度下溶液于260 nm 和340 nm 處吸光度，分別得到黑色素和微球濃度- 吸光度值標準曲線方程。

準確稱取海藻酸鈣微球顆粒于研缽中，研碎后加入適量的0.68 mol/L NaOH 溶液，浸泡1 h，并超聲提取30 min，然后以NaOH 溶液定容至100 mL。取濾液分別在260 nm 和340 nm 處測定吸光度，并帶入微球標準曲線和黑色素標準曲線，解聯(lián)立方程組計算出黑色素微球溶液中黑色素和微球的濃度。根據(jù)公式計算微球的包封率[15]。

1.4.4 抗紫外線能力測定

根據(jù)防曬霜的基本配方[16]，分別稱取油相和水相加熱到80 ℃，混合乳化，加入不同比例的載魷魚墨黑色素微球，均質(zhì)乳化后攪拌均勻并冷卻至室溫，即得到不同含量載魷魚墨黑色素微球的防曬霜樣品。參照焦學峰等人[1]的方法，即將醫(yī)用透氣膠帶貼在比色皿上，稱取一定量的防曬霜涂在膠帶表面，再測定其吸光度，根據(jù)與空白樣品的吸光度比較來評價防曬霜樣品的抗紫外線能力。

2 結果與分析

2.1 單因素對魷魚墨黑色素提取率的影響

影響超聲波輔助堿法提取的因素，包括超聲時間、NaOH 濃度和提取溫度等。

超聲時間對魷魚墨黑色素提取率的影響見圖1，NaOH 濃度對魷魚墨黑色素提取率的影響見圖2，提取溫度對魷魚墨黑色素提取率的影響見圖3。

圖1 超聲時間對魷魚墨黑色素提取率的影響

圖3 提取溫度對魷魚墨黑色素提取率的影響

由圖1 可知，在超聲時間為60 min 時黑色素的提取率最高，且在60 min 前，隨著超聲時間的延長，黑色素提取率逐步提高；60 min 后，隨著超聲時間的延長，黑色素提取率反而減小。由圖2 可知，黑色素提取率隨著NaOH 濃度的升高而持續(xù)增加，但超過0.55 mol/L 時增加趨勢放緩。由圖3 可知，提取溫度對黑色素提取率的影響不大。最終選取NaOH濃度0.55 mol/L，提取溫度40 ℃，超聲時間60 min為中心點進行響應面優(yōu)化試驗。

2.2 響應面優(yōu)化魷魚墨黑色素提取工藝

根據(jù)Box-behnken 試驗設計原理，選擇超聲時間、NaOH 濃度、提取溫度3 個因素，設計三因素三水平的響應面分析試驗。

響應面試驗設計及結果見表1，方差分析結果見表2。

表1 響應面試驗設計及結果

由表2 可知，模型的p＜0.05，該模型顯著。X1，等因素影響顯著（p＜0.05），其他因素影響不顯著，同時可知，各影響因子對響應值的影響不是單純的線性關系。失擬項p＞0.05，不顯著，所以該方程對試驗擬合好，該模型適用于試驗的分析和預測試驗結果。

根據(jù)最終的響應面模型，通過Design Expert 軟件得出最佳提取工藝為NaOH 濃度0.68 mol/L，超聲時間58.3 min，提取溫度39.9 ℃，二次平方模型預測提取率為18.3%。同時，進行3 次驗證試驗，選擇NaOH 濃度為0.68 mol/L，超聲時間58 min，提取溫度40 ℃下，得到黑色素的平均提取率為18.2%，與預測值比較接近。

2.3 海藻酸鈣包埋黑色素的微球制備

在預試驗結果的基礎上，選擇4%海藻酸鈉、3%氯化鈣溶液、1∶2 的油水比作為制備微球的最佳條件，使用顯微鏡觀察所制備的海藻酸鈣微球。

海藻酸鈣微球的形態(tài)見圖4。

由圖4（a） 和圖4（b） 比較可知，明顯可以分析得到黑色素被海藻酸鈉微球負載。因此，制備是成功的。

黑色素微球溶液測定見表3。

表3 黑色素微球溶液測定

綜合3 種微球濃度下測定的黑色素含量，可得黑色素微球中黑色素平均含量為4.25 mg/L。由于樣品中共添加了0.05 g 黑色素，且樣品總質(zhì)量為0.931 6 g，經(jīng)過計算得黑色素包封率為85.0%。

2.4 含黑色素微球的防曬霜抗紫外線性能

添加不同比例的魷魚墨黑色素微球的自制防曬霜，對其抗紫外吸收效果進行測定。

含魷魚墨黑色素微球的防曬霜抗紫外性能見圖5。

由圖5 可知，添加了黑色素微球的防曬霜在300 nm 以下的區(qū)域吸光度會有明顯的增加，而在300 nm 以上的區(qū)域其吸光度幾乎無變化，而當黑色素微球添加量大于1.0%時，再增加黑色素微球的量時，吸光度的增加值變化不大，但防曬霜的顏色會加深，因此綜合判斷選擇含有1.0%～2.0%魷魚墨黑色素微球的防曬霜比較合適，具有明顯的抗紫外線性能。

圖5 含魷魚墨黑色素微球的防曬霜抗紫外性能

3 結論

利用響應面方法優(yōu)化了魷魚墨黑色素制備工藝，最終確定最佳的制備條件。利用超聲輔助堿提取工藝制備魷魚墨黑色素，使黑色素的溶解性發(fā)生改變，使其應用更加廣泛。在NaOH 濃度為0.68 mol/L，超聲時間為58 min，提取溫度為40 ℃的條件下，提取得率可達18.2%。以提取的黑色素為功能分子，用海藻酸鈣微球方式包埋制備得到功能性微球，應用于防曬霜中，具有較好的抗紫外線性能。研究結果為魷魚墨的高附加值加工和應用提供了有益選擇。