叢雯雯， 馮曄囡 ， 王帥星， 胡國民， 肖 晗， 司軍強 ，4△， 張幼怡△

（石河子大學醫(yī)學院 1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，2生理學教研室，新疆石河子832000；3北京大學第三醫(yī)院心內科，血管醫(yī)學研究所，國家衛(wèi)生健康委心血管分子生物學與調節(jié)肽重點實驗室，分子心血管學教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室，北京100191；4華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學教研室，湖北武漢430030）

心肌纖維化是冠心病、高血壓、心肌病等多種心血管疾病發(fā)生心力衰竭、惡性心律失常甚至心源性猝死等嚴重并發(fā)癥的重要病理改變。心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）是參與心肌纖維化的主要細胞類型。在心肌損傷等刺激時，CFs 遷移、增殖并轉化為肌成纖維細胞，分泌大量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）蛋白，最終導致室壁順應性降低，心臟舒張功能障礙［1-3］。因此，深入研究CFs 轉分化的機制及其干預靶點具有重要意義。本課題組前期研究已經證實轉錄因子配對盒因子6（paired box 6，PAX6）在纖維化心臟組織中表達下調，且抑制CFs 中 PAX6 的表達能夠引起 CFs 的轉分化［4］。這一結果提示，內源性PAX6 的表達對于維持CFs 的表型至關重要。然而，增加PAX6的表達是否能夠作為有效的干預方式抑制病理刺激下CFs轉分化仍不清楚。鑒于此，本研究擬通過腺病毒載體過表達PAX6的方式增加CFs 中PAX6 的表達，利用血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）誘導CFs的轉分化，觀察PAX6對Ang II誘導的CFs轉分化的作用并探究其機制。

材 料 和 方 法

1 動物

8 周齡雄性C57BL/6 小鼠購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心［許可證號為SCXK（京）2016-0010］，用于分離成年小鼠CFs。動物飼養(yǎng)和使用均完全遵照北京大學醫(yī)學部實驗相關倫理標準，批準號為LA2016-018。

2 材料

過表達PAX6的腺病毒（Ad-PAX6）和對照腺病毒（Ad-GFP）購自上海漢恒生物科技有限公司；Ang II購自Sigma-Aldrich；膠原酶II 和DMEM 培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清購自Ausbian；逆轉錄試劑盒購自Promega；TRIzol、Hoechst 33342 和 Alexa Fluor?568 偶聯的熒光II抗購自Invitrogen；抗PAX6抗體、抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、抗轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）抗體和抗纖連蛋白（fibronectin，FN）抗體購自Abcam；抗 I 型膠原（collagen type I，Col I）抗體購自MD Bioproducts；抗 GAPDH 抗體購自 Cell Signaling Technology；山羊抗兔IgG（H+L）II抗購自中杉金橋公司。

3 方法

3.1 成年小鼠CFs 的分離與培養(yǎng) 取8 周齡雄性C57BL/6小鼠，斷頸后用乙醇消毒，立即取出心臟，修剪心耳和主動脈。去除血塊后剪碎，加入酶液（0.1%膠原酶II）置于恒溫磁力攪拌器中，整個消化過程在37℃恒溫下進行。8 min 后吸取上清液，加入等體積含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，混合均勻。重復8～10 次，直至心臟消化完全。細胞懸液以室溫1 000 r/min 離心 5 min，用 DMEM 培養(yǎng)液再洗滌 1 次，繼而用DMEM 培養(yǎng)液將細胞重懸，種于10 cm 的細胞培養(yǎng)皿中（3～4 只心臟），于37℃、5%CO2培養(yǎng)。差速貼壁2 h 后，去除未貼壁細胞，剩余已貼壁的細胞主要為成纖維細胞。通過免疫熒光標染波形蛋白（vimentin）對分離培養(yǎng)的 CFs 進行鑒定，vimentin 陽性的細胞比率大于92%。24 h 后更換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，此時培養(yǎng)皿中貼壁的CFs 為P0。傳代至第2代（P2）時進行病毒感染。

3.2 實驗分組 實驗分為Ad-GFP+Ctrl組（感染Ad-GFP）、Ad-GFP+Ang II 組（感染Ad-GFP 24 h 后，加入10-6mol/L Ang II 繼續(xù)處理 24 h 或 48 h）、Ad-PAX6+Ctrl 組（感染 Ad-PAX6）和 Ad-PAX6+Ang II 組（感染Ad-PAX6 24 h 后，加入 10-6mol/L Ang II 繼續(xù)處理 24 h或48 h）。

3.3 病毒感染 待P2 的CFs 融合度達到50%～60%時，更換為無血清培養(yǎng)液，分別加入Ad-GFP 和Ad-PAX6，以感染復數（multiplicity of infection，MOI）為2 感染6～8 h，再更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至24 h和48 h。采用倒置熒光顯微鏡觀察細胞綠色熒光強度；采用qPCR和Western blot檢測PAX6表達情況。

3.4 Western blot 收集各組細胞，用BCA法檢測蛋白濃度，取等質量蛋白進行SDS-PAGE，轉移蛋白至PVDF 膜，用TBST 配制的5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入1∶2 000 稀釋的兔抗PAX6、Col I、FN、α-SMA 和TGFβ1 抗體，4℃搖床孵育過夜。次日TBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的II 抗，室溫孵育1 h，使用GeneSys 機器ECL 發(fā)光成像。用ImageJ 圖像分析軟件對每個條帶的灰度值進行定量分析。

3.5 固定細胞免疫熒光技術 用4%多聚甲醛室溫固定細胞 20 min，PBS 洗 3 次后，Triton X-100 室溫破膜20 min，再用PBS洗3次；加入1%牛血清白蛋白室溫封閉30 min；加入Ⅰ抗于4℃孵育過夜；次日PBS洗 3 次后，加入 Alexa Fluor?568 偶聯的熒光 II 抗 4℃孵育 1 h，PBS 洗 3 次；Hoechst 33342 染細胞核 6 min。之后利用高內涵顯微鏡觀察制備好的樣品。利用高內涵顯微鏡Array Scan 系統采集各通道熒光，根據細胞核計數并圈畫熒光統計面積。結果表示為平均熒光強度，即為單個細胞單位面積的熒光強度。

3.6 qPCR 用Trizol 試劑提取細胞樣品總RNA，逆轉錄后進行qPCR 檢測。以GAPDH 為內參照，通過2-ΔΔCt法比較目的基因的表達差異。引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成，序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 統計學處理

采用Prism 8.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準誤（mean±SEM）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或雙因素方差分析（two-way ANOVA），多重比較采用 Tukey 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Ad-PAX6感染CFs后PAX6過表達效果驗證

過表達小鼠PAX6 腺病毒的結構示意圖見圖1A。感染48 h 后，倒置熒光顯微鏡下觀察，在感染Ad-GFP 和Ad-PAX6 的大部分細胞內均可見綠色熒光，且兩組細胞的形態(tài)無明顯異常，見圖1B。qPCR和Western blot 檢測結果顯示，與未感染的對照組和感染對照病毒的Ad-GFP 組相比，感染過表達PAX6腺病毒的 Ad-PAX6 組 CFs 中 PAX6 的 mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），見圖1C、D。

2 過表達PAX6 抑制CFs 中Ang II 引起的肌成纖維細胞標志物α-SMA的表達

Western blot 結果顯示，在感染Ad-GFP 的CFs中，Ang II 處理能夠增加肌成纖維細胞標志物α-SMA的表達（P＜0.01）；而在感染Ad-PAX6的CFs中，Ang II 處理組與對照組相比，α-SMA 的表達無顯著變化（P＞0.05）；與 Ad-GFP+Ang II 組相比，Ad-PAX6+Ang II 組α-SMA 表達顯著降低（P＜0.01），見圖2A。細胞免疫熒光結果同樣顯示，對感染Ad-GFP的CFs 給予Ang II 刺激，α-SMA 的平均熒光強度顯著增加（P＜0.01）；而對感染 Ad-PAX6 的 CFs 給予Ang II刺激，α-SMA 的平均熒光強度無顯著變化（P＞0.05）；與 Ad-GFP+Ang II 組相比，Ad-PAX6+Ang II組α-SMA 的平均熒光強度顯著降低（P＜0.05），見圖2B。

3 過表達 PAX6 抑制 CFs 中 Ang II 引起的 ECM 蛋白的表達與分泌

Western blot 結果顯示，在感染對照病毒Ad-GFP的CFs 中，Ang II 處理能夠顯著增加ECM 蛋白Col I（P＜0.01）和 FN（P＜0.05）的表達；而在感染 Ad-PAX6 的CFs 中，Ang II 處理組與對照組相比，Col I和FN 的表達無顯著變化；Ad-PAX6+Ang II 組細胞中Col I（P＜0.01）和FN（P＜0.05）的表達較Ad-GFP+Ang II 組顯著降低，見圖3A、B。細胞免疫熒光結果同樣顯示，對感染Ad-GFP 的CFs 給予Ang II 刺激，Col I和FN的平均熒光強度均顯著增加（P＜0.01）；而對感染 Ad-PAX6 的 CFs 給予 Ang II 刺激，Col I 和 FN平均熒光強度無顯著變化（P＞0.05）；Ad-PAX6+Ang II組 Col I 和 FN 平均熒光強度較 Ad-GFP+Ang II 組顯著降低（P＜0.01），見圖3C、D。

Figure 1.Verification of PAX6 overexpression in CFs.A：the structure schematic of the adenovirus engineered to overexpress mouse PAX6；B：fluorescence observation for the adenovirus infection efficiency after 48 h（scale bar=200 μm）；C：the mRNA expression of PAX6 detected by qPCR；D：the protein expression of PAX6 detected by Western blot.Mean±SEM. n=5～6.**P＜0.01 vs control（Ctrl）group and Ad-GFP group.圖1 腺病毒Ad-PAX6轉染CFs后PAX6過表達效果驗證

Figure 2.Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced α-SMA expression in CFs.A：the protein level of α-SMA detected by Western blot；B：representative images of immunofluorescence staining（scale bar =150 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA.Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.圖2 過表達PAX6抑制CFs中Ang II誘導的α-SMA表達

4 過表達 PAX6 抑制 CFs 中 Ang II 引起的 TGFβ1表達

qPCR和Western blot結果顯示，在感染對照病毒Ad-GFP 后給予 Ang II 刺激，CFs 中 TGFβ1 的 mRNA（P＜0.01）及蛋白（P＜0.05）水平顯著升高；而在感染Ad-PAX6 后給予 Ang II 刺激，TGFβ1 的 mRNA 及蛋白水平無顯著變化（P＞0.05）；同時，Ad-PAX6+Ang II組TGFβ1 的mRNA（P＜0.01）及蛋白（P＜0.05）水平較Ad-GFP+Ang II組顯著降低，見圖4。

Figure 3 Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced collagen type I（Col I）and fibronectin（FN）synthesis in CFs.A，B：the protein expression of Col I and FN detected by Western blot；C，D：representative images of immunofluorescence staining（scale bar =150 μm）and average fluorescence intensity of Col I and FN.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.圖3 過表達PAX6抑制CFs中Ang II誘導的Ⅰ型膠原和纖連蛋白的合成

討 論

本研究結果表明，過表達PAX6 可以抑制Ang II誘導的CFs 轉分化及ECM 蛋白的表達與分泌，這一作用可能是通過抑制TGFβ1 表達而實現的（圖5）。因此本研究結果提示，增加PAX6表達可以發(fā)揮抗心肌纖維化的作用。

PAX6 是配對盒因子家族中的一員，在視網膜形成及其他眼組織發(fā)育與疾病中發(fā)揮關鍵的轉錄調節(jié)作用［5］。除此之外，PAX6 在腦神經系統、胰腺及多種腫瘤中均已有深入研究。PAX6 基因突變將導致前腦、鼻結構以及胰島的發(fā)育與形態(tài)異常［6-7］。PAX6啟動子區(qū)的甲基化與膀胱癌、非小細胞肺癌等癌癥的復發(fā)與低生存率正相關［8-9］。然而目前PAX6 在心臟疾病中的相關研究較少，有研究利用轉錄因子結合位點分析和蛋白質/DNA 陣列分析的方法，發(fā)現PAX6 的DNA 結合活性在病理性心肌肥厚中顯著高于生理性心肌肥厚［10］，提示PAX6可能參與調控病理性心肌肥厚過程。我們之前的研究表明抑制內源性PAX6的表達能夠促進CFs轉分化［4］。但是一些研究表明，過高或過低的PAX6表達水平均可產生病理效應。例如，視網膜母細胞瘤細胞中PAX6表達水平的增加和降低均抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞的增殖［11-12］。因此有必要進一步明確過表達PAX6對心臟CFs 轉分化的調控作用。在本研究中，我們利用腺病毒載體過表達PAX6以增加CFs中PAX6的表達，發(fā)現過表達PAX6 并不引起正常CFs 的轉分化，而是抑制病理刺激（Ang II）引起的CFs 轉分化。因此，我們的研究表明維持CFs 中PAX6 的高表達對抑制心肌纖維化具有重要意義。

Figure 4.Overexpression of PAX6 inhibited Ang II-induced TGFβ1 expression in CFs.A：the mRNA expression of TGFβ1 detected by qPCR；B：the protein expression of TGFβ1 detected by Western blot.Mean±SEM. n=5～6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-GFP+Ctrl group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-GFP+Ang II group.圖4 過表達PAX6抑制Ang II誘導的CFs中TGFβ1的表達

Figure 5.A schematic model describing how paired box 6（PAX6）inhibits angiotensin II（Ang II）-induced cardiac fibroblast（CF）transdifferentiation.Transforming growth factor β1（TGFβ1）induces CF transdifferentiation and extracellular matrix synthesis.Our study indicates that PAX6 inhibits Ang II-induced CF transdifferentiation by inhibiting TGFβ1 expression.圖5 PAX6抑制Ang II誘導CFs轉分化的模式圖

本研究利用Ang II 誘導CFs 轉分化，構建CFs 的轉分化模型，闡明了PAX6 對Ang II 誘導的CFs 轉分化發(fā)揮抑制作用。但值得注意的是，在肝星狀細胞中的一項最新研究表明，PAX6對肝臟纖維化起促進作用［11］。肝星狀細胞的激活是肝臟纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。該研究發(fā)現，PAX6 促進GLI1的轉錄表達，介導肝星狀細胞的激活與增殖［13］。對于PAX6 在心臟和肝臟中功能的差異，我們認為可能是由于PAX6對多種病理過程的調控具有組織特異性。例如，在間腦和大腦皮層中，轉錄因子PAX6以相反的方向轉錄調控細胞增殖與分化的平衡。而造成這一差異的原因是大腦皮層存在另一轉錄因子Foxg1，敲除大腦皮層中Foxg1的表達則可逆轉PAX6 對腦皮層細胞增殖與分化的調控作用［14］。另外，在不同的腫瘤組織中，PAX6也會發(fā)揮不同的促癌或抑癌作用［15-17］。由此我們推斷，由于心臟和肝臟中存在不同轉錄因子與PAX6 相互作用，共同影響纖維化的進程，因而導致PAX6在肝臟中發(fā)揮促纖維化作用，而在心臟中則表現為抗纖維化作用。

TGFβ1 是調控心肌纖維化的關鍵細胞因子。TGFβ1 促進CFs 轉分化為肌成纖維細胞，其下游信號分子Smad3 進入細胞核發(fā)揮轉錄調控作用，介導Col I、Col III、FN 等多種 ECM 蛋白的轉錄表達［18］。我們前期研究和其他研究表明，Ang II 可以通過轉錄因子 AP-1 與 HNF-4α 直接促進 TGFβ1 的表達［19-20］，還能夠通過調控microRNA 間接促進TGFβ1 的表達［21］。我們之前的研究發(fā)現 Ang II 可下調 CFs 中PAX6 的表達水平［4］。而在本研究中，通過外源性增強 PAX6 的表達能夠抑制 Ang II 誘導的 TGFβ1 的mRNA 和蛋白表達。因此，本研究提出了PAX6 過表達抑制心臟CFs 轉分化的機制可能是通過抑制AngII 引起的TGFβ1 表達增加。鑒于PAX6 能夠與Tgfb1內含子特定區(qū)域結合并發(fā)揮轉錄抑制作用［2］，過表達PAX6 抑制TGFβ1 表達這一干預方式可能不僅局限于Ang II 模型，而是適用于所有TGFβ1 表達升高的心肌纖維化環(huán)境，為未來干預心肌纖維化提供了新思路。

綜上所述，本研究進一步證實PAX6對心肌纖維化起保護作用。外源性增加PAX6 的表達能夠作為有效的干預方式抑制TGFβ1 的轉錄表達，進而抑制Ang II誘導的CFs轉分化及ECM蛋白的表達與分泌。本研究為心肌纖維化的預防與治療提供了新的思路與實驗證據。