鐘 娃， 夏忠勝， 于 濤， 倪楚燕， 黎潔瑤， 陳其奎

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120）

胰腺干細(xì)胞屬于未分化細(xì)胞，具備分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、腺泡細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的潛能，可以表達(dá)干細(xì)胞的一些分子標(biāo)志，但尚未發(fā)現(xiàn)其特異性分子標(biāo)志［1］。近年來研究認(rèn)為，胰十二指腸同源異形框1（pancreatic and duodenal homeobox 1，Pdx1）是胰腺干細(xì)胞分子標(biāo)志之一。Pdx1 是胰腺發(fā)育早期、β 細(xì)胞分化及成熟胰島細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子［2］。Pdx1可以誘導(dǎo)內(nèi)胚層向胰腺定向發(fā)育和成熟，其活化可促進(jìn)胰島素、生長(zhǎng)抑素、葡萄糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子2 和胰島淀粉樣多肽等細(xì)胞重要基因的表達(dá)［3］。在胚胎發(fā)育早期，敲除Pdx1后導(dǎo)致小鼠胰腺發(fā)育不良［4］。在胚胎發(fā)育晚期，敲除Pdx1將影響 β 細(xì)胞的成熟，使小鼠糖耐量異常、血糖升高［5］。因此，Pdx1+細(xì)胞可以認(rèn)為是胰腺的前體細(xì)胞。本研究采用Tet-On 系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Pdx1的小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）株，實(shí)現(xiàn)Pdx1基因的定時(shí)、定點(diǎn)和定量表達(dá)，為下一步通過調(diào)控表達(dá)Pdx1誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞分化奠定了基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞 小鼠ESC 名稱：ES-E14TG2a；小鼠品系：129/Ola，購(gòu)于 American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基（Gibco BRL）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于Biochrom；白血癥抑制因子（leukemia inhitory factor，LIF）購(gòu)于Millipore；限制性內(nèi)切酶（NEB）；In-Fusion?PCR Cloning Kit（Clontech）；Taq polymerase（Sino-Bio）；Lipofectamine 2000、目的基因引物和 Trizol（Invitrogen）；293T 細(xì)胞、嘌呤霉素、強(qiáng)力霉素和大腸桿菌菌株DH5α（吉?jiǎng)P基因公司）；PrimeScriptTMRTPCR Kit 和 SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（TaKaRa）；小鼠抗小鼠Pdx1 單克隆抗體（R&D）；Annexin V-FITC/PI 試劑盒（Becton Dickinson）；RNA 引物（上海生工生物技術(shù)有限公司）；羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG 和兔抗小鼠GAPDH 單克隆抗體（CST）。流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）；LightCycler 480 熒 光 定 量 PCR 儀（Roche）；熒光顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠ESC 在無飼養(yǎng)層細(xì)胞中貼壁培養(yǎng)，以高糖DMEM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10% FBS、0.12%碳酸氫鈉、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、10 mmol/L HEPES、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和 1×107U/L LIF，放在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每天觀察并換液，2～3 d傳代1次［6］。

2.2 采用Tet-On 系統(tǒng)構(gòu)建具有綠色熒光蛋白標(biāo)記及嘌呤霉素抗性的Pdx1過表達(dá)慢病毒載體 基因名稱：Pdx1（NM_008814），載體名稱：GV347（圖1）。元件順序：TetIIP-MCS-EGFP-3FLAG-Ubi-TetR-IRESPuromycin，克隆位點(diǎn)是AgeI/AgeI。首先，化學(xué)合成目的基因Pdx1序列，用AgeI/AgeI 酶切化學(xué)合成的含有Pdx1的質(zhì)粒；其次，通過將PCR 產(chǎn)物連接入線性化表達(dá)載體從而構(gòu)建Pdx1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)Pdx1蛋白的表達(dá)；最后，將編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝元件載體質(zhì)粒，按Lipofectamine 2000 使用說明共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，在293T 細(xì)胞中測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度。

Figure 1.The lentiviral vector GV347.圖1 病毒載體GV347

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染ESC 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（ESC組）、空載慢病毒對(duì)照組（PDX1-ESC 組）和Pdx1慢病毒轉(zhuǎn)染組（PDX1+ESC 組）。將1×105個(gè)胚胎干細(xì)胞接種于6 孔板培養(yǎng)板中，培養(yǎng)16 h 后細(xì)胞融合度達(dá)20%～30%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。換無血清培養(yǎng)基，加終濃度為 5 mg/L 的 polybrene，加入滴度為 1×1012TU/L 的病毒6 μL，總體積為1 mL。轉(zhuǎn)染后12 h 更換為含10% FBS 的培養(yǎng)基2 mL，每日換液。轉(zhuǎn)染后48 h，按 1∶4～1∶6 傳代，次日換液，加入嘌呤霉素至終濃度為800 μg/L。篩選2 d 后，換無嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至密度大于80%時(shí)，按1∶4～1∶6 傳代至6孔板中。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性率以及穩(wěn)定表達(dá)Pdx1的ESC 株和陰性對(duì)照ESC 株的構(gòu)建 取ESC組及2 mg/L 多西環(huán)素（doxycycline，DOX）誘導(dǎo)24 h后的 PDX1-ESC 組和 PDX1+ESC 組細(xì)胞，PBS 清洗，消化、中和、離心后取5×105個(gè)細(xì)胞，再離心、去上清，用200 μL PBS 將細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。按上述方法調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010/L，用流式分選儀分選PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組GFP+細(xì)胞，ESC 組細(xì)胞作為對(duì)照。分選后的陽性細(xì)胞立即進(jìn)行離心、去上清，接種至6 孔板中培養(yǎng)，時(shí)間定義為d0。d1 加入終濃度為800 μg/L 的嘌呤霉素，每天換液。d3 可見抗性克隆。用胰酶在單克隆附近消化干凈，用10 μL 的槍頭挑取單克隆，放入96孔板培養(yǎng)。24 h 后加入終濃度為400 μg/L 的嘌呤霉素，維持篩選出單克隆，再逐漸轉(zhuǎn)入24孔板-12孔板-6孔板培養(yǎng)，逐漸擴(kuò)增起來，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。經(jīng)擴(kuò)增、傳代、液氮灌凍存，為下一步實(shí)驗(yàn)備用。

2.5 熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達(dá) ESC 組、PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組細(xì)胞分別接種至6 孔板中，每組接種2孔，24 h后其中一孔加DOX 至終濃度為2 mg/L。24 h后在熒光顯微鏡下觀察。

2.6 RT-qPCR 檢測(cè) Pdx1 的 mRNA 表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL，Pdx1 上、下游引物（序列見表1）各0.4 μL，cDNA 2 μL，加單蒸水7.2 μL 至總體積20 μL。擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測(cè)Pdx1 融合蛋白的表達(dá) 收取細(xì)胞加入RIPA 緩沖液提取總蛋白。采用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用1∶1 000稀釋的小鼠抗小鼠單克隆Pdx1 抗體在4℃孵育過夜。洗膜3 次后，孵育1∶1 000 稀釋的兔抗小鼠IgG，室溫1 h。以βactin 作為內(nèi)參照，進(jìn)行各目的條帶灰度的半定量分析，條帶的灰度分析采用ImageJ 軟件。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的凍存 當(dāng)轉(zhuǎn)染后的ESC 擴(kuò)增到密度為70%～80%時(shí)進(jìn)行凍存。棄去舊液，經(jīng)清洗、消化、中和，用吸管吹打后把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后棄上清，加入凍存液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度約為（1.0～1.2）×1010/L。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中，于4℃放置30 min，再轉(zhuǎn)至-30℃放置30 min，然后轉(zhuǎn)至-80℃過夜，第2天轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；多組間的比較采用方差分析后，進(jìn)一步采用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染細(xì)胞用嘌呤霉素篩選2 d 后，PDX1-ESC 組陽性率為90.72%，PDX1+ESC 組陽性率為94.01%（圖2）。用流式細(xì)胞分選儀分選后，PDX1-ESC組的陽性率為97.84%，PDX1+ESC 組的陽性率為98.13%（圖3）。

2 熒光顯微鏡下觀察

不加 DOX 時(shí)，ESC 組、PDX1-ESC 組和 PDX1+ESC組均未見綠色熒光細(xì)胞；加DOX后，ESC組未見綠色熒光細(xì)胞，PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組均可見綠色熒光細(xì)胞（圖4）。

3 Pdx1的mRNA表達(dá)

加 DOX 后 ESC 組 和 PDX1-ESC 組 Pdx1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），而PDX1+ESC 組的 Pdx1 mRNA 水平 顯 著增高（P＜0.05）；不加 DOX，則 3 組 Pdx1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；組內(nèi)比較，加DOX前后 ESC 組和 PDX1-ESC 組內(nèi) Pdx1 mRNA 表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），而PDX1+ESC 組加DOX 后Pdx1 mRNA 表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

Figure 2.The transfection efficiency of lentiviral vectors determined by flow cytometry.The blue wave crest represented negative control cells，and red wave crest represented positive transfection cells.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例

Figure 3.The positive cells were selected and exhibited in blue frame by flow cytometry.圖3 流式細(xì)胞術(shù)篩選陽性細(xì)胞

Figure 4.Expression of green fluorescent protein was induced by activating the Tet-On system.The scale bar=100 μm.圖4 啟動(dòng)Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)增強(qiáng)綠色熒光蛋白的表達(dá)

Figure 5.The mRNA expression of Pdx1 was induced by activating the Tet-On system.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PDX1+ESC+DOX group.圖5 啟動(dòng)Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)Pdx1 mRNA的表達(dá)

4 Pdx1蛋白的表達(dá)

加 DOX 后 ESC 組 和 PDX1-ESC 組 Pdx1 蛋 白 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），而PDX1+ESC組的Pdx1 蛋白水平明顯增高（P＜0.05），在46 kD 見Pdx1蛋白表達(dá)外，在75 kD左右見Pdx1與EGFP融合蛋白表達(dá)；不加DOX，則3組Pdx1蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；組內(nèi)比較，加 DOX 前后ESC 組和PDX1-ESC 組內(nèi)Pdx1 蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），而 PDX1+ESC 組加 DOX 后Pdx1 蛋白表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的活性及調(diào)控

3 個(gè)月后，從液氮灌取出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，復(fù)蘇后培養(yǎng)，細(xì)胞仍然存活，并受DOX調(diào)控。

討 論

Iwashita等［7］發(fā)現(xiàn)Pdx1過表達(dá)導(dǎo)致胰島相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)。研究表明［8］，上調(diào)Ptf1α和Pdx1可以確定胰腺發(fā)育的方向，促進(jìn)胰腺組織的分化；相反，下調(diào)Pdx1啟動(dòng)子活性，將誘導(dǎo)內(nèi)胚層向腸道上皮的方向分化。在定型內(nèi)胚層表達(dá)Pdx1基因是定型內(nèi)胚層向胰腺細(xì)胞方向分化的前提。所以，定型內(nèi)胚層表達(dá)Pdx1 的細(xì)胞又稱為胰腺前體細(xì)胞。為了能夠分化獲得盡可能多的胰腺樣細(xì)胞，以滿足細(xì)胞移植的需要，上調(diào)Pdx1基因在定型內(nèi)胚層的表達(dá)，讓更多的定型內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)Pdx1基因，是非常關(guān)鍵的一步。

Figure 6.The protein expression of Pdx1 was induced by activating the Tet-On system.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs PDX1+ESC+DOX group.圖6 啟動(dòng)Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)Pdx1蛋白的表達(dá)

Gossen 等［9-10］在 1995 年提出四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Tet-On 系統(tǒng)）。在Tet-On 基因表達(dá)系統(tǒng)中，當(dāng)四環(huán)素或強(qiáng)力霉素增加時(shí)，外源基因表達(dá)逐漸增加，正向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而且，Tet-On 基因表達(dá)系統(tǒng)只對(duì)四環(huán)素或強(qiáng)力霉素反應(yīng)，是一個(gè)嚴(yán)密、高效的反應(yīng)系統(tǒng)，同時(shí)也是目前廣泛使用的條件性基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，它可以人為地控制目的基因在靶細(xì)胞里按需表達(dá)。Tet-On 系統(tǒng)已經(jīng)運(yùn)用多年，并且得到了不斷的完善，構(gòu)建技術(shù)成熟。該系統(tǒng)的使用，對(duì)目的基因的調(diào)控更加便利。鐘女奇等［11］報(bào)道建立了表達(dá)Tet-On 的人肝癌細(xì)胞模型，為研究任何感興趣的目的基因的調(diào)控打下了基礎(chǔ)。在Tet-On 調(diào)控系統(tǒng)中，目的基因表達(dá)的量與DOX 的誘導(dǎo)濃度有關(guān)。通過控制DOX 的誘導(dǎo)濃度可以對(duì)目的基因?qū)崿F(xiàn)定量表達(dá)。有研究認(rèn)為，DOX 的濃度在0～10 mg/L 范圍中，誘導(dǎo)濃度與目的基因表達(dá)的量成正相關(guān)，DOX 的誘導(dǎo)濃度越高，目的基因表達(dá)的量就越大［12］。但不同的細(xì)胞對(duì)DOX 濃度的承受能力是不同的。有研究［13］用濃度為 1 mg/L 的 DOX 誘導(dǎo)目的基因在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)。D′Alessandro 等［14］用 2.5 mg/L 的DOX 誘導(dǎo)目的基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中曾試用3 mg/L 的DOX 誘導(dǎo)Pdx1在胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果細(xì)胞狀態(tài)差，大部分死亡。通過不同濃度的嘗試，最后用DOX 終濃度為2 mg/L 誘導(dǎo)Pdx1的表達(dá)，細(xì)胞保持良好的增殖狀態(tài)。在Tet-On 調(diào)控系統(tǒng)中，目的基因表達(dá)的量與DOX 的誘導(dǎo)時(shí)間亦有關(guān)系。Kumar 等［12］加入 DOX 后 0～24 h 誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，目的基因表達(dá)的量增加。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用DOX 誘導(dǎo)24 h 上調(diào)Pdx1表達(dá)。我們可以通過嘌呤霉素對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選出成功轉(zhuǎn)染Pdx1基因的具有嘌呤霉素抗性的細(xì)胞。在篩選實(shí)驗(yàn)前，我們先對(duì)未轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。用終濃度分別為100 μg/L、200 μg/L、300 μg/L、400 μg/L、500 μg/L、600 μg/L、700 μg/L、800 μg/L 和900 μg/L 的嘌呤霉素培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，2 天后，嘌呤霉素終濃度為 800 μg/L 培養(yǎng)的細(xì)胞，有大于80%的胚胎干細(xì)胞死亡，該濃度為嘌呤霉素的最佳篩選濃度。本實(shí)驗(yàn)，我們構(gòu)建單質(zhì)粒模式的、具有綠色熒光蛋白標(biāo)記及嘌呤霉素抗性的Tet-On調(diào)控系統(tǒng)Pdx1過表達(dá)慢病毒載體，并且感染胚胎干細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察，加DOX 后，ESC組未見綠色熒光細(xì)胞，PDX1-ESC 組和PDX1+ESC 組均可見綠色熒光細(xì)胞；不加DOX，3 組均未見綠色熒光細(xì)胞。目的基因Pdx1位于熒光基因的上游，說明加DOX 可以誘導(dǎo)Tet-On 系統(tǒng)熒光蛋白和Pdx1的表達(dá)。RT-qPCR 和 Western blot 的 結(jié)果 發(fā)現(xiàn) ，加 DOX 后 ，PDX1+ESC組Pdx1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高；不加DOX，3 組間 Pdx1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示本研究構(gòu)建的Tet-On 調(diào)控系統(tǒng)Pdx1過表達(dá)慢病毒載體受DOX 調(diào)控，調(diào)控正常。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株經(jīng)擴(kuò)增、傳代，液氮灌凍存3 月后，取出凍存的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，復(fù)蘇培養(yǎng)，細(xì)胞仍然存活，并受DOX 調(diào)控。結(jié)果說明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株構(gòu)建成功。周光紀(jì)等［15］報(bào)道成功構(gòu)建Pdx1基因真核表達(dá)載體質(zhì)粒并且在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)。我們進(jìn)一步利用Tet-On系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Pdx1的小鼠ESC 株，為下一步研究的實(shí)施提供了便利。

我們構(gòu)建的單質(zhì)粒模式的Tet-On調(diào)控系統(tǒng)Pdx1過表達(dá)慢病毒載體，不僅操作簡(jiǎn)單，而且運(yùn)用Tet-On調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控Pdx1在定型內(nèi)胚層的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pdx1定時(shí)、定點(diǎn)、定量的調(diào)控，為進(jìn)一步研究定型內(nèi)胚層向胰腺細(xì)胞分化奠定了基礎(chǔ)。