羅鵬 鄭遠(yuǎn) 葛海峰

[摘要] 目的 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法，探討非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（NONFH）患者血漿來(lái)源微泡的生物標(biāo)志物，為NONFH的診斷提供依據(jù)。 方法 選取2020年5—11月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的20例NONFH患者及配對(duì)的20名健康體檢者的血漿樣本，分離微泡，并采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析微泡中代謝物，結(jié)合主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘分辨分析法（OPLS-DA）篩選差異性代謝產(chǎn)物。結(jié)果 樣本中共鑒定出12種差異性代謝產(chǎn)物，其中肌苷、次黃嘌呤、尿酸及花生四烯酸上調(diào)（P<0.05）;半胱氨酸、同型半胱氨酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、α-酮戊二酸、硫酸脫氫表雄酮（DHEA-S）和硫酸孕烯醇酮下調(diào)（P<0.05）。 結(jié)論 采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析NONFH血漿來(lái)源微泡的代謝產(chǎn)物是可行的，為NONFH的篩查提供新的參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 股骨頭壞死;微泡;代謝組學(xué);創(chuàng)傷

[中圖分類(lèi)號(hào)] R681.8? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）35-0032-05

Metabonomics study of plasma-derived microvesicles in patients with non-traumatic necrosis of the femoral head

LUO Peng1? ?ZHENG Yuan2? ?GE Haifeng3

1.Department of Orthopedics，the Second Affiliated Hospital and? Children′s Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000，China; 2.The Second School of Medicine of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China; 3.Department of Laboratory Medicine，the Second Affiliated Hospital and Children′s Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou? ?325000，China

[Abstract] Objective To explore the biomarkers of plasma-derived microvesicles from patients with non-traumatic necrosis of the femoral head （NONFH） by using the metabonomics method of liquid chromatography-mass spectrometry， and to provide a basis for the diagnosis of NONFH. Methods A total of 20 patients with NONFH and 20 matched healthy subjects who were admitted to the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University From May to November 2020 were selected. The microbubbles were separated. The metabolites in microvesicles were analyzed using ultra-high performance liquid chromatography tandem time of flight mass spectrometry. The differential metabolites were screened combined with principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares resolution analysis （OPLS-DA）. Results A total of 12 different metabolites were identified in the sample， of which inosine，hypoxanthine，uric acid and arachidonic acid were up-regulated （P<0.05）;cysteine，homocysteine，pyruvate，malic acid，α-ketoglutarate， dehydroepiandrosterone sulfate （DHEA-S） and pregnenolone sulfate were down-regulated（P<0.05）. Conclusion It is feasible to analyze the metabolites of NONFH plasma-derived microbubbles by ultra-high performance liquid chromatography tandem time-of-flight mass spectrometry，which provides a new reference basis for NONFH screening.

[Key words] Femoral head necrosis; Microvesicles; Metabolomics; Trauma

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（Non traumatic osteonecrosis of the femoral head，NONFH）常與長(zhǎng)期、大劑量或不規(guī)范使用糖皮質(zhì)激素、大量酗酒等有關(guān)，約占股骨頭壞死總數(shù)的70%～80%[1]?，F(xiàn)有的多種影像學(xué)方法雖使得NONFH的早期診斷率得以提升，但各類(lèi)影像學(xué)方法仍存在缺陷，使得該病的早期診斷依舊困難重重。微泡（Microvesicles，MVs）是一組由多種細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下釋放的，直徑在100～1000 nm之間的異質(zhì)性膜囊泡[2]。近年來(lái)，隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到微泡在疾病診斷、預(yù)后及個(gè)性化治療方面具有廣闊的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[3]。本研究采用代謝組學(xué)的方法對(duì)健康人群及非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者血漿來(lái)源的微泡進(jìn)行分析，找尋差異性代謝產(chǎn)物，篩選出潛在的生物標(biāo)記物，為疾病的診斷提供新的依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年5—11月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院診治的NONFH患者（NONFH組）和按年齡、性別及身高配對(duì)的健康體檢者（對(duì)照組），每組各20例，血樣分別由本院骨科和體檢中心提供，所有參與者均同意并簽署研究方案的知情同意書(shū)。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。NONFH組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照國(guó)際骨循環(huán)研究會(huì)（Asociation research circulation osseous，ARCO）診斷標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，經(jīng)X線和磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）確診為NONFH，且ARCO分期為Ⅲ或Ⅳ級(jí);②年齡30～70歲。NONFH組患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：①有髖部外傷及手術(shù)史者;②有代謝性骨病的病史，包括嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥、骨腫瘤，伴有骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤、甲狀旁腺功能亢進(jìn)或甲減、Paget病或腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良等;③不同意參加該研究項(xiàng)目者。健康體檢者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①相同時(shí)間段就診的體檢者;②年齡30～70歲;③體檢未發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)性疾病者;④同意參加該項(xiàng)目者。

1.2 儀器與試劑

儀器：高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)5810R）購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司;JEM-1200EX電子顯微鏡購(gòu)于日本JEOL公司;Nanosight 300系統(tǒng)購(gòu)于英國(guó)Malvern Panalytical公司;Waters Xevo G2XS Q-TOF，色譜柱Acquity UPLC HSS T3 column （Waters，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）及數(shù)據(jù)分析軟件Progensis QI均購(gòu)于上海沃特世公司;CD63、TSGl01抗體、PBS（Phosphate-buffered saline）、PBST（Phosphate-buffered saline with Tween 20）、RIPA（Radioimmunoprecipitation assay buffer）裂解液均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;甲醇、乙腈、甲酸、氯仿均購(gòu)于上海Sigma試劑公司、超純水儀購(gòu)于上海Milli-Q公司。

1.3 血漿標(biāo)本采集及儲(chǔ)存

采集血液前一晚禁食（22：00開(kāi)始），次日早晨8時(shí)（早餐前）從NONFH組患者和對(duì)照組受試者獲得血液樣品，將血液標(biāo)本置于5000×g離心機(jī)下離心20 min，取上清（血漿），裝入新的離心管，并置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存以免代謝物衰減。

1.4 微泡的分離

為了最大程度地減少溶劑提取之前血漿樣本中代謝物成分的變化，將所有凍融血漿樣本在室溫下于冰上融化25 min。隨后將樣品置于離心管中，在4℃下以17 000×g離心90 min，棄上清，將沉淀物用PBS重懸，再次以17 000×g離心90 min（4℃）分離出MVs。

1.5 微泡的鑒定

1.5.1 透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM）? 取重懸于PBS中的MVs 20 μL滴置在Formvar—碳涂層的網(wǎng)格（200孔）上吸附10 min，風(fēng)干后，使用2%磷鎢酸溶液染色2 min后，采用JEM-1200EX電子顯微鏡在60 kV電壓下檢查樣品。

1.5.2 Nanosight Tracking? 通過(guò)使用配備有快速視頻捕獲和粒子跟蹤軟件的Nanosight 300系統(tǒng)測(cè)量布朗運(yùn)動(dòng)來(lái)確定分離制劑中存在顆粒的粒徑分布。所有樣品采集后設(shè)置均保持相同，并對(duì)每個(gè)視頻進(jìn)行分析以給出均值和中位數(shù)值來(lái)表示囊泡大小及顆粒濃度的估算值。

1.5.3 Western blot? 用RIPA緩沖液裂解MVs，并進(jìn)行超聲混勻。然后，在10% SDS-PAGE上分離蛋白，并使其轉(zhuǎn)到PVDF（Polyvinylidene fluoride）膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h后，PBST稀釋的一抗CD63（1∶1 000）、TSGl01（1∶500）在4℃下孵育過(guò)夜;用PBST洗滌3次后，將膜與相應(yīng)二抗在室溫下孵育2 h，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑Western Pico將免疫反應(yīng)蛋白條帶可視化，然后在電泳凝膠成像分析系統(tǒng)上成像。

1.6 代謝物提取

將微泡重懸于100 μL水中，2次凍融后超聲裂解并保存在冰上。每個(gè)樣本加入100 μL預(yù)冷的水及267 μL預(yù)冷甲醇，渦旋震蕩1 min。隨后在4℃下以13 000×g離心10 min，吸取全部上清移至新的EP管中，加入533 μL氯仿，渦旋震蕩10 s。相同條件下再次離心5 min，吸取350 μL上層溶液至新的EP管中，氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 50∶50 甲醇水復(fù)溶，渦旋震蕩10 s，通過(guò)0.45 μM濾膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至色譜瓶，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.7 液質(zhì)聯(lián)用分析方法

1.7.1 色譜條件? 色譜柱：Acquity UPLC HSS T3 column（Waters，2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液;洗脫程序：0 min：1% B，1 min：1% B，3 min：15% B，6 min：50% B，12 min：95% B，12.1 min：1% B，15 min：1% B;柱溫：40℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度10℃;進(jìn)樣量10 μL;流速0.5 mL/min。Waters Xevo G2XS Q-TOF質(zhì)譜條件：氮?dú)庾鳛殪F化氣、錐孔氣;氬氣作為碰撞氣;正負(fù)離子模式;主要的參數(shù)設(shè)置包括：錐孔電壓30.0 V;萃取錐孔電壓3.5 V;離子源溫度120℃;脫溶劑氣溫度450℃;反向錐孔氣流速50.0 L/h;脫溶劑氣流速800.0 L/h;離子傳輸管電壓：正離子模式下為3.0 kV，負(fù)離子模式下為2.8 kV;Lockspray鎖定質(zhì)量數(shù)556.2771（+）、554.2615（-）。

1.7.2 質(zhì)譜方法? 掃描模式MSE、分析模式：靈敏度模式、質(zhì)荷比范圍50～1000 Da、掃描間隔時(shí)間0.02 s、數(shù)據(jù)采集模式：continuum、碰撞能10～50 V。

1.7.3 質(zhì)量控制方法? 在所有待測(cè)樣本中各取10 μL，混合后作為質(zhì)量控制樣本（Quality control， QC），以便評(píng)價(jià)分析方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，每8個(gè)待測(cè)定樣本中插入1個(gè)QC樣本。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

樣本品的檢測(cè)通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法（Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry， UPLC/Q-TOF-MS）進(jìn)行。所得樣本的總離子流色譜圖，在 Progenesis QI軟件下，進(jìn)行峰校準(zhǔn)、背景扣除、面積歸一化及數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化處理，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物保留時(shí)間與質(zhì)荷比信息的csv 格式文件。將上述文件導(dǎo)入EZinfo 2.0軟件，通過(guò)主成分分析（Principal compoments analysis，PCA）、正交偏最小二乘法—判別分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到兩組之間的差異代謝物，通過(guò)MMCD、HMDB、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和部分標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行匹配比較并最終確認(rèn)潛在生物標(biāo)志物。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較;計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組的年齡、性別、身高、體重及BMI比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

2.2 微泡的分離與鑒定

采用透射電鏡下兩組提取的MVs大小均一，外形呈圓形或橢圓形的茶托樣結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)明顯的膜性結(jié)構(gòu)（圖1A）。Nanosight Tracking分析表明，純化的MVs樣品的直徑范圍80～400 nm，平均大小約為（152.4±5.6）nm[SD，（42.9±3.1）nm]，濃度為[（7.70×1010）±（8.74×109）]顆粒/mL（圖1B）。Western blot結(jié)果顯示，血漿來(lái)源的微泡表面攜帶特標(biāo)識(shí)蛋白CD63及TSG101（圖1C）。

2.3 兩組血漿來(lái)源微泡樣本的UPLC/Q-TOF-MS總離子流色譜圖

正、負(fù)離子模式下，血漿來(lái)源微泡樣本的典型總離子流色譜圖（Total ion chromatogram，TIC）。見(jiàn)圖2。使用Progenesis QI軟件進(jìn)行峰的提取后，正離子模式下共檢測(cè)到946個(gè)離子，負(fù)離子模式下共檢測(cè)到784個(gè)離子。

2.4 兩組血漿來(lái)源微泡樣本的PCA與OPLS-DA分析

將所有樣本連同QC樣本進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析（PCA），以便評(píng)價(jià)離群值及監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。在正、負(fù)離子模式下的PCA 得分圖中兩組的樣本點(diǎn)在分布上完全分開(kāi)，組內(nèi)的聚集效果良好，同時(shí)組間的分離趨勢(shì)顯著，提示預(yù)測(cè)模型的擬合能力較好，同時(shí)QC樣本在正、負(fù)離子模式下的聚集程度良好，表明系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性。見(jiàn)圖3。

使用有監(jiān)督的正交最小二乘法判別分析（OPLS-DA）來(lái)篩選兩組樣本的差異代謝物。兩組的OPLS-DA 得分圖如圖4所示，兩組的樣本點(diǎn)具有良好的分離趨勢(shì)，其中正離子模式下：R2X=0.566，R2Y=0.953， Q2=0.823;負(fù)模式下R2X=0.564，R2Y=0.912，Q2=0.862。結(jié)果提示正、負(fù)離子模式下模型均良好。

2.5 潛在生物標(biāo)記物的篩選

篩選出同時(shí)滿(mǎn)足OPLS-DA的計(jì)算變量投影重要度（Variable importance for the projection，VIP）值>1，且獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05的代謝物，表明該代謝物在兩組樣本之間具有顯著性差異，即潛在的生物標(biāo)記物。本研究共鑒別出12個(gè)差異代謝物。見(jiàn)表2。

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（收稿日期：2021-03-01）

[基金項(xiàng)目] 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ17H260005）;浙江省溫州市基礎(chǔ)性科研項(xiàng)目（Y2020057）