王歡，許荔立，陳孝煊,3，袁軍法，田丁，蔣飛，吳志新,3

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070； 2.湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)研究中心，武漢430070；3.水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))，武漢 430070

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)具有分布廣泛、適應(yīng)力強(qiáng)、繁殖力高等特點(diǎn)，在我國部分濕地形成自然種群[1]，是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。2018年克氏原螯蝦經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值已達(dá)3 690億元，養(yǎng)殖密度的提高以及養(yǎng)殖水體污染等原因，導(dǎo)致克氏原螯蝦疾病頻發(fā)。副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)等細(xì)菌性病原被認(rèn)為是造成螯蝦某養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的原因之一[2-4]。

恩諾沙星enrofloxacin(ENR)作為人工合成的廣譜抗菌藥，具有對(duì)細(xì)菌選擇性高，口服給藥迅速，生物利用度高，半衰期較長，血藥濃度、毒副作用小等特點(diǎn)應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，預(yù)防和治療多種細(xì)菌和支原體感染，在臨床治療中已成為很多感染性疾病的首選藥物，使用頻率僅次于青霉素類[5]。

國內(nèi)外學(xué)者采用不同的給藥方式，研究了恩諾沙星在水生動(dòng)物中的藥物動(dòng)力學(xué)及殘留特征，如銀鯽(Carassiusauratusgibelio)(肌肉注射)[6]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)(靜脈注射和口灌)[7]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)(肌肉注射和口灌)[8]、大西洋馬蹄蟹(Limuluspolyphemus)(圍心竇注射)[9]等。本研究分析了在18 ℃和25 ℃ 2種溫度下克氏原螯蝦圍心竇注射20 μg/kg的恩諾沙星后，恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)在蝦體內(nèi)的組織分布和藥代動(dòng)力學(xué)特征，以期為制定合理用藥量和休藥期提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1200型高效液相色譜儀，Agilent Chemistation色譜工作站，美國Agilent公司；全自動(dòng)樣品快速研磨儀，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；MTN-2800W恒溫水浴氮吹裝置，天津奧賽恩斯儀器有限公司；WH-2微型漩渦混合儀，上海滬西儀器分析廠。

1.2 藥品與試劑

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；色譜級(jí)乙腈和甲醇，美國Tedia公司；正己烷、乙腈、三乙胺等試劑為分析純，購于國藥化學(xué)試劑有限公司。恩諾沙星原粉(含量99%)，上虞京新藥業(yè)有限公司。

恩諾沙星與環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取0.01 g恩諾沙星及環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，分別用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液助溶，用超純水定容至100 mL，配置成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

恩諾沙星注射液的配制：稱取4 g的恩諾沙星原藥，用少量氫氧化鈉溶液助溶，用超純水定容至100 mL，配置成40 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用克氏原螯蝦來自湖北武漢克氏原螯蝦某養(yǎng)殖基地，平均體質(zhì)量(20.0±2.0) g，暫養(yǎng)于消毒后的水族箱中，試驗(yàn)用水為經(jīng)過曝氣的自來水,分別控制水溫在(18±1) ℃和(25±1) ℃。試驗(yàn)前停食1 d，選擇健康活潑的蝦進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)方法

1)色譜條件。色譜柱：Shodex Silica C18(250 mm ×4.6 μm，5 μm)，流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2.4)/乙腈=86/14(V/V)；流速：1.0 mL/min；紫外線檢測波長：278 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2)給藥與取樣。正式給藥前禁食1 d，給藥前采集空白血淋巴及組織樣品檢測是否有藥物殘留。用100 μL微量注射器將恩諾沙星藥液注射到克氏原螯蝦圍心竇，劑量為20 μg/kg(約10 μL)。于 0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、120 h時(shí)間點(diǎn)采集血淋巴、肌肉、肝胰腺。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6只螯蝦。使用注射器從圍心竇取血淋巴，并取肌肉、肝胰腺，樣品保存于-80 ℃冰箱。

3)樣品處理。冷凍保存的樣品室溫下自然解凍。吸取0.5 mL血淋巴于10 mL離心管中，加入7 mL的提取液(1 mol/L鹽酸∶乙腈=4∶500，V/V)，旋渦混合2 min，8 000 r/min 離心10 min，將上清液置于40 ℃恒溫水浴氮?dú)獯蹈伞?zhǔn)確加入1 mL流動(dòng)相，過0.22 μm濾膜，濾液用高效液相色譜儀檢測。取1 g組織(肌肉、肝胰腺)勻漿，加入1 mL氯化鈉溶液(1 mol/L)和1 mL PBS緩沖液，渦旋振蕩2 min，加入4 mL酸化乙腈(1 mol/L鹽酸∶乙腈=4∶500，V/V)，渦旋混合2 min，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min。提取上清液移入另一離心管中，殘留物加4 mL酸化乙腈充分渦旋震蕩2 min，4 ℃下8 000 r/min離心10 min，提取上清液。合并上清液，取上清液于氮吹儀上40 ℃氮吹至干，用1 mL流動(dòng)相溶解，2 mL正己烷去脂，取下清液用0.22 μm濾膜過濾，濾液用高效液相色譜檢測藥物含量。因?yàn)楦我认僦兄竞枯^多，增加一次去脂步驟。

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)工作液用超純水分別稀釋為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，取10 μL進(jìn)樣檢測進(jìn)行分析。以藥物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度C(μg/mL或μg/g)為橫坐標(biāo)(X)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

5)工作曲線。將克氏原螯蝦中空白血淋巴或空白組織勻漿，加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含恩諾沙星和環(huán)丙沙星為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL(μg/g)的血淋巴樣品和組織樣品。將各樣品將按照本文“1.4”樣品方法處理后，進(jìn)行HPLC分析，求出工作曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

6)回收率、精密度和檢測限。取空白血淋巴和組織，分別添加100、10、1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，使各組織恩諾沙星、環(huán)丙沙星藥物含量為10、1、0.1 μg，將各樣品處理后，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測定3次，連續(xù)測定3 d，計(jì)算回收率和精密度。以引起3倍信噪比(S/N=3)的濃度為檢測限。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜行為

恩諾沙星和環(huán)丙沙星出峰時(shí)間分別為9.529、13.351 min，目標(biāo)藥物峰形明顯尖銳，基線平穩(wěn)(圖1)。本方法可以有效地分離恩諾沙星和環(huán)丙沙星，在樣品中與其他色譜峰明顯分離，無干擾峰(圖2～4)。

圖1 恩諾沙星(ENR)和環(huán)丙沙星(CIP)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 空白血淋巴色譜圖與加標(biāo)血淋巴色譜圖

圖3 空白肌肉色譜圖與加標(biāo)肌肉色譜圖

圖4 空白肝胰臟色譜圖與加標(biāo)肝胰腺色譜圖

2.2 分析方法驗(yàn)證

恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=61.618X-2.6977，Y=60.376X+0.1429，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。恩諾沙星及環(huán)丙沙星在0.01～20 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表1)。各組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星回收率均在80%～110%，說明回收率是在合理范圍的(表2)。檢測值日內(nèi)變異系數(shù)均小于5%，日間變異系數(shù)均小于6%；檢測限在0.003～0.008 μg/mL(μg/g)，均低于歐盟(0.1 μg/mL 或μg/g)和日本(0.01 μg/mL或μg/g)規(guī)定的最高殘留限量，表明本試驗(yàn)所用樣品前處理和高效液相色譜檢測方法具有較高的精確度。

表1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的工作曲線方程和相關(guān)系數(shù) Table 1 ENR and CIP work composition line sum correlation number

表2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的回收率、變異系數(shù)、檢測限 Table 2 ENR and CIP-like recovery rate,variation number,limit of measurement

2.3 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的藥-時(shí)變化規(guī)律

注射給藥后，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴的藥時(shí)曲線見圖5。由圖5可見，恩諾沙星在18 ℃和25 ℃下在0.083 0 h達(dá)到峰值，分別為20.185 4 μg/mL和19.248 6 μg/mL，1～8 h恩諾沙星藥物質(zhì)量濃度呈快速下降趨勢，8～120 h時(shí)藥物質(zhì)量濃度緩慢下降。18 ℃時(shí)環(huán)丙沙星在2 h達(dá)到第1個(gè)峰值(18 ℃為0.054 0 μg/mL)，24 h時(shí)會(huì)出現(xiàn)第2個(gè)峰值(0.050 0 μg/mL)；25 ℃時(shí)環(huán)丙沙星在2 h有1個(gè)峰值(0.072 6 μg/mL)。

注射給藥后，恩諾沙星在克氏原螯蝦肌肉中的藥時(shí)曲線見圖6。恩諾沙星在25 ℃(0.026 3 h)比18 ℃(0.344 7 h)更快達(dá)到峰值，隨后出現(xiàn)緩慢下降，18 ℃時(shí)在6 h會(huì)出現(xiàn)第2個(gè)峰(9.848 5 μg/g)。18 ℃時(shí)，環(huán)丙沙星在0.75 h達(dá)到峰值(0.150 3 μg/g)，在8 h時(shí)出現(xiàn)第2個(gè)峰(0.157 9 μg/g)。25 ℃時(shí)，環(huán)丙沙星在0.25 h達(dá)到峰值(0.733 9 μg/g)，在4 h達(dá)到第2個(gè)峰，然后很快下降。

圖5 18 ℃(A)和25 ℃(B)下單次注射后ENR和CIP在血淋巴中的藥-時(shí)曲線(n=6)

圖6 18 ℃(A)和25 ℃(B)下單次注射后ENR和CIP在肌肉中的藥-時(shí)曲線(n=6)

單次注射給藥后，恩諾沙星在克氏原螯蝦肝胰腺中的藥時(shí)曲線見圖7。18 ℃時(shí)，恩諾沙星質(zhì)量濃度在0～1 h時(shí)間段快速上升，4 h達(dá)到峰值，4～8 h出現(xiàn)快速下降；25 ℃時(shí)，恩諾沙星質(zhì)量濃度在1 h達(dá)到峰值。18 ℃下環(huán)丙沙星分別在0.75、4 h達(dá)到峰值；25 ℃時(shí)，環(huán)丙沙星濃度在2 h達(dá)到峰值。

圖7 18 ℃(A)和25 ℃(B)下單次注射后ENR和CIP在肝胰腺中的藥-時(shí)曲線(n=6)

2.4 藥代動(dòng)力學(xué)特征

恩諾沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的藥時(shí)數(shù)據(jù)用PK2.0軟件和Graphpad Prism5軟件進(jìn)行擬合分析，結(jié)果顯示，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴中的藥時(shí)數(shù)據(jù)符合二室開放模型，恩諾沙星在克氏原螯蝦肌肉和肝胰腺中的藥時(shí)數(shù)據(jù)符合一級(jí)吸收二室開放模型，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。環(huán)丙沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的藥時(shí)數(shù)據(jù)為非房室模型，其主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)見表4。

表3 恩諾沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) Table 3 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in Procambarus clarkii

表4 環(huán)丙沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) Table 4 Pharmacokinetic parameters of ciprofloxacin in Procambarus clarkii

3 討 論

3.1 恩諾沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征

恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴中的藥時(shí)數(shù)據(jù)符合二室開放模型，在肌肉和肝胰腺中的藥時(shí)數(shù)據(jù)符合一級(jí)吸收二室開放模型，這與恩諾沙星在三疣梭子蟹[10]、金鱒[11]、西伯利亞鱘[12]、中華絨螯蟹[13]中的結(jié)果相似。

本試驗(yàn)中，在18 ℃水溫下，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的Tmax分別為0.083 0、0.344 7、1.933 5 h，Cmax分別為20.185 4、13.221 3、16.555 5 μg/mL，在25 ℃水溫下，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的Tmax分別為0.083 0、0.263 4、1.165 8 h，Cmax分別為19.248 6、16.425 0、30.731 3 μg/mL，這說明溫度較高時(shí)，恩諾沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)達(dá)峰時(shí)間快。與不同溫度下恩諾沙星在中華絨螯蟹中的達(dá)峰時(shí)間快和達(dá)峰濃度的規(guī)律一致[13]。

18 ℃水溫下，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的T1/2α分別為0.896 5、3.559 6、6.641 1 h，AUC(0-t)分別為514.306 2、494.711 3、745.454 9(μg·h)/mL；25 ℃時(shí)T1/2α分別為0.297 3、1.681 1、11.174 5 h，AUC(0-t)分別為257.857 3、531.497 0、1 293.194 5(μg·h)/mL。AUC越大，說明恩諾沙星在克氏原螯蝦中分布越廣泛，可以更好地起到殺菌作用。溫度較高時(shí)，恩諾沙星在血淋巴、肌肉中的分布半衰期更短。在大菱鲆中，溫度同樣促進(jìn)了分布半衰期的減少[7]。

消除半衰期T1/2β和清除率CL是藥物在體內(nèi)消除快慢的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[13]。18 ℃時(shí)恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的T1/2β分別為68.552 7、58.914 4、74.622 1 h，25 ℃時(shí)分別為18.608 7、52.743 7、55.740 3 h。18 ℃恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的CL分別為0.021 9、0.027 2、0.011 2 L/(h·kg)，25 ℃時(shí)分別為0.065 5、0.028 0、0.012 6 L/(h·kg)，溫度提高，血淋巴、肌肉、肝胰腺中的恩諾沙星消除加快，這與有關(guān)的研究結(jié)果一致[14]。溫度提高可以促進(jìn)恩諾沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的分布和消除，但由于生物種類、給藥劑量、養(yǎng)殖環(huán)境的不同，恩諾沙星代謝程度存在差異[15-17]，與其他甲殼類動(dòng)物[18]一樣，克氏原螯蝦擁有開放性循環(huán)系統(tǒng)，肝胰腺是藥物吸收的主要器官，因此肝胰腺中藥物濃度高、消除半衰期較長。

3.2 環(huán)丙沙星在克氏原螯蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征

研究表明，恩諾沙星在水生動(dòng)物體內(nèi)大部分以原藥形式存在，有一部分去乙基代謝轉(zhuǎn)化為環(huán)丙沙星[19]，因此研究恩諾沙星的代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)同樣具有重要意義。在本試驗(yàn)中，18 ℃時(shí)環(huán)丙沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的消除斜率常數(shù)分別為0.005 0、0.003 1、0.011 5 1/h，在肝胰腺中消除最快，其次是血淋巴、肌肉。25 ℃水溫條件下環(huán)丙沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的消除斜率常數(shù)分別為0.014 6、0.015 5、0.012 3 1/h，在肌肉中消除最快，其次是血淋巴、肝胰腺。溫度較高時(shí)，加快了各組織中環(huán)丙沙星的消除。除血淋巴外，肌肉和肝胰腺中的達(dá)峰時(shí)間在25 ℃ 時(shí)( 0.25 h、2 h)比18 ℃ (8 h、12 h)快，血淋巴、肌肉、肝胰腺在25 ℃時(shí)的清除率也比18 ℃快。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星的濃度比恩諾沙星的濃度要低得多，水溫18 ℃和25 ℃下血淋巴中環(huán)丙沙星和恩諾沙星的AUC比值分別為0.8%和0.5%，這與大菱鲆(口灌)[7]和鯽(注射和口灌)[16]中的結(jié)果相似。肝胰腺中環(huán)丙沙星的比值要比血淋巴、肌肉中高，這種現(xiàn)象也存在于中華絨螯蟹中[13]。藥物主要代謝產(chǎn)物所占的比例在一定程度上體現(xiàn)動(dòng)物對(duì)該藥的代謝強(qiáng)度[20]，且與水溫成正比[17]。試驗(yàn)中環(huán)丙沙星呈不規(guī)則衰減的方式，可能受恩諾沙星代謝的影響[21]。

3.3 休藥期

由于恩諾沙星在克氏原螯蝦的肝胰腺中代謝較慢，同時(shí)要不斷轉(zhuǎn)化為環(huán)丙沙星，因此把肝胰腺作為藥物殘留的靶器官。在2019年發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中，規(guī)定的最大殘留限量為0.2 μg/g(恩諾沙星+環(huán)丙沙星)[18]；日本則規(guī)定恩諾沙星最高殘留限量為0.01 μg/g。以0.2 μg/g為殘留標(biāo)準(zhǔn)，利用軟件WT 1.4計(jì)算出本試驗(yàn)中25 ℃水溫時(shí)恩諾沙星在肝胰腺達(dá)到殘留標(biāo)準(zhǔn)需要311.470 0 h，18 ℃水溫時(shí)恩諾沙星在肝胰腺達(dá)到殘留標(biāo)準(zhǔn)為417.770 0 h。以0.01 μg/g為殘留標(biāo)準(zhǔn)，利用軟件WT 1.4計(jì)算出本試驗(yàn)中25 ℃時(shí)恩諾沙星在肝胰腺達(dá)到殘留標(biāo)準(zhǔn)為490.640 0 h，18 ℃時(shí)恩諾沙星在肝胰腺達(dá)到殘留標(biāo)準(zhǔn)為680.580 0 h。制定休藥期不僅要考慮殘留量，還要考慮水溫等狀況[22]。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，按照國家標(biāo)準(zhǔn)0.2 μg/g為殘留標(biāo)準(zhǔn)，建議休藥期為325 (℃·d)。以日本0.01 μg/g為殘留標(biāo)準(zhǔn)，建議休藥期為511 (℃·d)。