吳黎明,宋放,王策,王志靜,何利剛,彭抒昂,蔣迎春,劉繼紅

1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，武漢 430064； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070

柑橘枯水是柑橘類果肉汁胞的生理失調(diào)癥，是一種生理性病害，常常發(fā)生在果實成熟和采后貯藏過程中，導(dǎo)致果實品質(zhì)和果實貯藏性能嚴重下降。柑橘枯水主要分為汁胞?；涂菟椭s型枯水，?；强菟谋硇椭?，一般在甜橙和寬皮柑橘中稱作“枯水”，而在柚中稱為“?；薄？菟墓麑嵆霈F(xiàn)含水量減少、果實質(zhì)量明顯減輕、果實“發(fā)泡”等特征，初期果肉表現(xiàn)出汁胞變硬、變干、?；翌伾儨\，囊瓣增厚等現(xiàn)象，后期嚴重時果汁減少、糖酸物質(zhì)喪失、營養(yǎng)物質(zhì)流失、果實風(fēng)味寡淡，甚至失去食用價值和商品價值[1-2]。

柑橘枯水于1934年首次由Barthofomew等報道。其后，一些柑橘生產(chǎn)大國如澳大利亞、巴西、中國、印度、以色列、日本等的研究者也作了相關(guān)報道[3-8]。世界上幾乎所有柑橘種類和栽培品種果實都會在一定程度上出現(xiàn)枯水現(xiàn)象，甜橙類品種如‘鳳梨橙’‘華盛頓臍橙’‘哈姆林甜橙’‘血橙’‘倫晚臍橙’等以及寬皮柑橘如‘丹西橘’等，發(fā)生果實枯水嚴重一些，而其他柑橘種類如‘葡萄柚’‘酸柚’‘檸檬’‘萊檬’‘探戈橘’等發(fā)生較輕[5,7]。目前柑橘果實枯水發(fā)生的生理和分子機制仍不清楚,有效防治措施也尚未解決。本文從細胞學(xué)、品質(zhì)營養(yǎng)、激素水平、酶活性和基因表達等方面對柑橘果實枯水發(fā)生的生理變化和分子機制進行綜述，旨在為后期進一步深入開展枯水機制和防控措施的研究奠定基礎(chǔ)。

1 柑橘果實發(fā)生枯水的細胞形態(tài)學(xué)變化

正常的柑橘果實果皮與果肉通過囊瓣膜(囊衣)緊連，果心間隙小，囊瓣密合，汁胞汁液充足；而枯水后果皮和果肉之間、囊瓣之間以及汁胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，果皮發(fā)育失衡，白皮層內(nèi)側(cè)細胞停止生長，而外側(cè)的細胞則繼續(xù)生長，進而導(dǎo)致白皮層組織疏松，空隙增大增多，果皮和果肉組織分離[9]。果實枯水初期，細胞組織結(jié)構(gòu)松散；隨枯水程度增加，細胞壁增厚，細胞數(shù)量增多；在果實枯水后期，汁胞營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，內(nèi)含物不斷減少，細胞原生質(zhì)收縮，薄壁細胞崩塌，出現(xiàn)較大空隙[10]。柑橘果實在貯藏過程中，果皮細胞角質(zhì)層和蠟質(zhì)層發(fā)育不良或果皮細胞組織疏松，引起果皮組織衰老，呼吸代謝加強，果實失水加快，發(fā)生采后果實枯水[11-13]。

劉芳等[14]通過對溫州蜜柑進行解剖學(xué)研究，認為粗皮大果易發(fā)生枯水，是由于粗皮果果皮凹凸不平、果皮細胞組織排列疏松、細胞層數(shù)增長快，導(dǎo)致果皮變厚?？菟泄ぜ毎谟休^大的細胞間隙，胞間層發(fā)生了明顯的解體，從而導(dǎo)致細胞間連接松動和細胞壁腫脹，細胞壁的纖維物質(zhì)發(fā)生了明顯分離，細胞間隙變大[15]。Burdon等[16]對溫州蜜柑浮皮枯水果或正常果皮的磁振顯影技術(shù)圖像分析表明，枯水果實中果皮與囊瓣之間存在較大的間隙，間隙面積約占果實總橫切面積的5%。王少峰[17]通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蘆柑枯水果的果皮油胞層細胞增大，同時細胞內(nèi)的液泡增大，引起細胞質(zhì)總量的減少，從而造成果皮發(fā)泡。溫明霞等[18]采用石蠟切片方法觀察溫州蜜柑貯藏期間枯水果，發(fā)現(xiàn)其細胞排列不規(guī)則、結(jié)構(gòu)松散和紊亂，細胞壁增厚，嚴重時原生質(zhì)收縮，薄壁細胞崩潰，砂囊中汁胞與汁胞之間出現(xiàn)了一些較大的空隙。甜橙類果實枯水主要發(fā)生在中心柱或者果皮附近的汁胞中，汁胞萎縮失水，密度下降，導(dǎo)致中心柱空隙增大，但是果皮無明顯變化，很難從外觀上進行判斷[19]。Wu等[20]通過組織切片觀察,發(fā)現(xiàn)倫晚臍橙枯水后果實中心柱附近的汁胞皺縮，汁胞間出現(xiàn)空隙，且隨著枯水程度的加深，汁胞間的空隙也增大，汁胞空癟、顏色變淺；Wu等[20]還通過Periodic Acid-Schiff染色發(fā)現(xiàn)倫晚臍橙枯水果實的細胞壁纖維素和木質(zhì)素增多、細胞壁增厚，細胞內(nèi)含物減少。柚類果實發(fā)生枯水時，汁胞膨大、變硬、木質(zhì)化，果汁顯著減少，后期汁胞嚴重枯水、干癟，通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)汁胞?；Y狀從頂部開始出現(xiàn)，汁胞表面橫紋逐漸消失；潘東明等[21]通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，?；毎诩雍衩黠@，纖維素、木質(zhì)素、半纖維素類物質(zhì)等填充細胞壁中膠層，細胞內(nèi)可見線粒體和高爾基體，同時觀察到多個核仁，嚴重粒化時可見原生質(zhì)收縮、質(zhì)壁分離等現(xiàn)象。在果實發(fā)育成熟后期和貯藏過程中觀察到，柚類果實汁胞粒化發(fā)展過程經(jīng)歷正常、凝膠化、?；拔s階段，?；脑蚴谴蠖鄶?shù)細胞的細胞壁木質(zhì)化加厚形成厚壁組織[22]。

2 柑橘果實枯水產(chǎn)生的生理生化變化

2.1 果實水分含量變化

柑橘正常成熟果中水分含量約為85%～90%[23]，發(fā)生枯水時果實中水分嚴重散失、果實質(zhì)量減輕、果肉營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，食用時呈現(xiàn)粗糙、干枯、不化渣等口感[9]。柑橘果實汁胞發(fā)生枯水時，水分束縛在果膠中，在Ca2+的參與下形成凝膠，導(dǎo)致自由水含量顯著減少，果汁率降低[24]。柑橘果實囊瓣之間、果皮和果肉之間水分相互流通，在貯藏期或受逆境脅迫發(fā)生枯水時，水分從果肉流向果皮轉(zhuǎn)移加快，以維持果皮生理活性，水分脅迫誘導(dǎo)了相關(guān)激素信號、基因表達、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控以及相關(guān)生理生化反應(yīng)[25]。果皮中的水分會進一步散逸到空氣中，且水分參與的一些生化反應(yīng)會生成難溶性物質(zhì)，從而引起水分含量下降[26-27]。

2.2 果實營養(yǎng)物質(zhì)代謝變化

柑橘果實中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物、有機酸、維生素、礦質(zhì)營養(yǎng)、抗氧化物質(zhì)等，其中糖酸是柑橘的核心品質(zhì)，果實成熟時其含量和類型決定柑橘果實的風(fēng)味[28]。糖酸主要指可溶性糖和有機酸，可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖及果糖；有機酸以檸檬酸為主，占總含量的70%～90%；還含有少量蘋果酸、奎寧酸、琥珀酸、烏頭酸、延胡索酸等[29-30]。在糖酸代謝途徑中，柑橘糖主要通過蔗糖代謝途徑中幾種關(guān)鍵酶如蔗糖合酶、蔗糖磷酸合成酶和轉(zhuǎn)化酶降解[31]。蔗糖的降解首先轉(zhuǎn)化為己糖，然后作為呼吸底物通過糖酵解途徑進一步合成其他碳水化合物[32-33]。柑橘果實中的主要有機酸是檸檬酸，在果實發(fā)育過程中不斷增加，而在成熟期和采后過程中逐漸減少[25，34-35]。檸檬酸的減少很大程度上是由于它被用于呼吸底物或合成氨基酸[32,36]。檸檬酸的降解由一系列酶進行催化，例如烏頭酸酶(ACO)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)[37-38]，經(jīng)由三羧酸循環(huán)(TCA)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酰胺合成、乙酰輔酶A合成等多個降解途徑[34-35,37]。

柑橘果實枯水與糖酸物質(zhì)代謝直接相關(guān)?？菟铀倭税ㄨ?、臍橙和椪柑等[39-41]柑橘果實中糖酸的降解。柑橘枯水不僅導(dǎo)致果實中可溶性固形物含量急劇減少，不溶性蛋白質(zhì)、中性糖(包括鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖等)和可溶性糖(包括葡萄糖、果糖和蔗糖等)含量也降低[41]。在柑橘枯水果實中淀粉或水溶性碳水化合物(可溶性固形物和單糖)轉(zhuǎn)化為聚合多糖等不溶性物質(zhì)，細胞壁合成加快導(dǎo)致細胞壁加厚[42]。果實汁胞的枯水與可滴定酸呈負相關(guān)關(guān)系[43-44]，甜橙酸含量下降和果汁pH值升高會引起果實枯水的發(fā)生，在發(fā)生枯水的汁胞中，抗壞血酸的含量出現(xiàn)先下降后增加的趨勢[42]。柚類品種在貯藏過程中果實主要品質(zhì)可溶性固形物、可滴定酸等呈下降趨勢，?；笖?shù)增加，含水量顯著下降[45]。琯溪蜜柚果實?；麢幟仕岷彤悪幟仕岷枯^正常果實低，其果汁總酸含量也隨之降低，但發(fā)生?；蔫制涔刑O果酸含量較正常果汁含量高，通過測定發(fā)現(xiàn)有機酸代謝相關(guān)酶在轉(zhuǎn)錄水平上產(chǎn)生了調(diào)節(jié)，順烏頭酸酶活性的增強導(dǎo)致了檸檬酸的降解，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)誘導(dǎo)了蘋果酸的生化合成[40]。不同柑橘種類，包括寬皮橘、臍橙、柚等，當果實出現(xiàn)枯水時，糖酸營養(yǎng)物質(zhì)降解較快，可溶性糖和有機酸的含量均顯著下降，嚴重時降低至正常汁胞的25%～30%[29]。因此，柑橘果實枯水時，糖酸降解導(dǎo)致果實的營養(yǎng)風(fēng)味發(fā)生劣變。還有研究表明，與正常果相比，在一些寬皮柑橘品種中檢測到枯水果的呼吸速率增加，呼吸速率加強導(dǎo)致了枯水果營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗[46-47]。對葡萄柚粒化的研究中發(fā)現(xiàn)，呼吸速率增強為細胞壁生物合成、糖酸底物降解提供能量[48-49]。在柑橘采后貯藏過程中還觀察到果皮的再生長[50]，進一步合理解釋了果肉發(fā)生枯水的原因[51]。

柑橘果實發(fā)生枯水時，果汁顏色變淡，汁胞變白，其中類胡蘿卜素含量顯著下降[52]，抗壞血酸、多酚等營養(yǎng)物質(zhì)含量也顯著降低，最高下降50%左右[2]。香氣物質(zhì)是形成果實風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，主要以萜烯類物質(zhì)如單萜烯類、倍半萜烯類為主[53]，還有酯類、醇類以及醛酮類等揮發(fā)性物質(zhì)[54-55]，枯水導(dǎo)致柑橘香氣物質(zhì)尤其萜烯類物質(zhì)D-檸檬烯大量減少[56]，這些物質(zhì)的大量減少，導(dǎo)致柑橘感官品質(zhì)中香氣喪失，大大降低了果實的風(fēng)味品質(zhì)。

2.3 果實礦質(zhì)營養(yǎng)狀況變化

有較多的研究表明，柑橘果實枯水與植株自身營養(yǎng)狀況有關(guān)。謝志南等[57]發(fā)現(xiàn)在琯溪蜜柚果實?；械V質(zhì)營養(yǎng)元素尤其是N、P、K等大量元素顯著增加，而葉片中Ca元素含量減少，并且隨著?；潭仍黾樱寥乐杏行u含量增加。在甜橙中發(fā)現(xiàn)，枯水果實枯水率越高，葉片和果肉中Ca、Zn、B含量越低，但葉片中N、K、Mg、S、Cu、Mn元素含量無顯著性變化[42]。Munshi 等[58]研究發(fā)現(xiàn)，隨著2個甜橙品種果實枯水的發(fā)生，葉片N、P、K、Mg、Zn、Cu等營養(yǎng)元素含量增加，而Ca、Fe、B含量減少?！の鏖佟ぶ蠯、Mg及果肉中N、P、K、Ca含量水平增加與果實較高枯水發(fā)生率相關(guān)[59]。Kotsias[60]研究發(fā)現(xiàn)果實在枯水過程中，光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運受到了限制，但增加K和一些微量元素如B、Zn、Cu等有助于營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和減少枯水的發(fā)生。Wang等[40]在琯溪蜜柚果實?；l(fā)生研究中也發(fā)現(xiàn)?；c植株礦質(zhì)營養(yǎng)存在相關(guān)性，枯水汁胞中檢測到礦質(zhì)元素尤其是P、Mg、S、Zn、Cu等的積累。然而，Singh等[61]發(fā)現(xiàn)在‘金諾橘’中果實枯水與植株N、K、Mg、Zn、Cu、Fe含量沒有明顯關(guān)系，可能與柑橘不同品種在逆境脅迫(枯水)下對礦質(zhì)元素吸收和利用存在差異有關(guān)。

2.4 果實酶活性變化

1)細胞壁代謝與水解酶類。柑橘果實枯水與汁胞次生壁形成和細胞壁加厚密切相關(guān)[47,62]，細胞壁結(jié)構(gòu)的變化主要是由于細胞壁組分包括木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和果膠含量的增加[27,61,63]。

佘文琴等[64]研究發(fā)現(xiàn)，紅肉蜜柚果實粒化與細胞壁組分和水解酶活性密切相關(guān)。在?；l(fā)生期間，汁胞內(nèi)果膠甲酯酶(PME)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纖維素酶(CL)等細胞壁降解酶活性較正常果低，而原果膠、纖維素和半纖維素等細胞壁組分物質(zhì)含量較正常果高。同樣，在發(fā)生枯水的臍橙突變體中，果實汁胞細胞壁組分物質(zhì)如原果膠、纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素在整個發(fā)育過程中具有較高的含量[65]。在晚熟雜柑黃果柑枯水研究中發(fā)現(xiàn)，果實枯水使果皮細胞膜透性增大，細胞壁中木質(zhì)素、纖維素含量增加，內(nèi)源多胺物質(zhì)精胺(Spd)、亞精胺(Spm)合成減少，腐胺(Put)含量降低，(Spd+Spm)/Put比值降低，枯水果抗逆性下降，同時果實中可溶性固形物、Vc、糖以及可食率降低，品質(zhì)下降[66]。在椪柑果實采后枯水研究中，伴隨椪柑果實枯水逐漸發(fā)展，參與糖酵解途徑、檸檬酸降解途徑以及果膠、纖維素、木質(zhì)素等細胞壁組分的合成途徑的相關(guān)酶基因表達增加。與此同時，枯水汁胞中參與細胞壁合成途徑的酶活性增強，從而增加了纖維素和木質(zhì)素含量[28]。

正常柑橘果實成熟時，細胞壁的果膠物質(zhì)在果膠甲基酯酶(PME)的作用下去甲基化和脫酯化，隨后被多聚半乳糖醛酸酶(PG)分解成可溶性果膠，細胞壁發(fā)生降解從而導(dǎo)致果實軟化。由于柑橘果實枯水是一個復(fù)雜的生理病變過程，在果實成熟過程中，枯水果實的果膠代謝關(guān)鍵水解酶活性變化也存在差異。例如紅桔果實發(fā)生枯水時，果皮果膠甲基酯酶(PME)活性升高，原果膠降解加快，果皮組織細胞結(jié)構(gòu)變疏松[67]。特早熟溫州蜜柑品種‘脅山’在采前果實浮皮枯水發(fā)生過程中，果皮和果肉中PG活性升高，果皮丙二醛(MDA)不斷累積，細胞發(fā)生膜脂過氧化，從而引起果皮早衰[68]。Sharma等[2]對雜交寬皮柑橘‘金諾橘’果實枯水進行研究，發(fā)現(xiàn)枯水果實果膠甲基酯酶(PME)活性較正常果高。譚興杰等[69]對椪柑采后枯水進行研究，發(fā)現(xiàn)果實細胞壁代謝相關(guān)的果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶出現(xiàn)2個活性高峰，在高峰期間果實質(zhì)量減輕，高峰過后，果實出現(xiàn)枯水癥狀。

2)自由基代謝酶類。正常情況下植物細胞內(nèi)的活性氧處于一種累積與清除的動態(tài)平衡過程，一旦這種平衡被破壞將導(dǎo)致細胞內(nèi)的生理紊亂，從而引起植物生理病變。Sharma 等[7]研究發(fā)現(xiàn)盡管多酚氧化酶(PPO)活性在不同柑橘品種中存在差異，但枯水果實中PPO的活性均低于正常果實。柚類不同品種采后貯藏期果皮和果肉的過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性變化存在差異，果皮POD先升后降，SOD先降后升，而果肉POD活性較低且變化無規(guī)律，SOD先升后降，呈與果皮相反的趨勢；并且隨著果皮中SOD活性的增加和果肉中SOD活性的下降，果實開始出現(xiàn)?；痆70]?，g溪蜜柚在果實成熟后期，活性氧H2O2代謝失調(diào)，在細胞中過量累積，膜脂過氧化；同時H2O2活性氧不斷積累誘導(dǎo)相關(guān)清除酶類SOD、POD、CAT(過氧化氫酶)活性不斷增強，促進細胞內(nèi)木質(zhì)素合成，從而果實發(fā)生?；痆71]。胡位榮等[52]選取紅肉蜜柚正常汁胞、半枯汁胞、全枯汁胞為材料對比分析汁胞枯水氧化酶活性，發(fā)現(xiàn)隨?；l(fā)生和發(fā)展，汁胞中SOD活性顯著下降，而POD活性顯著上升，CAT活性先上升后下降，PPO氧化酶活性也顯著降低，積累較多的活性氧H2O2，引起自由基代謝失調(diào)，細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量增加，膜脂過氧化，且木質(zhì)素不斷累積，汁胞硬化、粗糙，呈現(xiàn)粒化較為典型的癥狀。

2.5 果實激素含量變化

植物激素和生長調(diào)節(jié)劑在柑橘果實發(fā)育和采后貯藏中起重要調(diào)控作用，與果實枯水發(fā)生存在相關(guān)性。在枯水過程中，果實內(nèi)源激素含量會相應(yīng)發(fā)生改變。椪柑果實在貯藏過程中，枯水果的果皮中脫落酸(ABA)含量較正常果高，而IAA和CTK含量則低于正常果，且果肉ABA含量在枯水過程中顯著上升[72]。ABA的增加和積累加快了柑橘果實次生物質(zhì)如木質(zhì)素、纖維素以及果膠等的代謝，導(dǎo)致糖酸含量下降，細胞壁變厚，呈現(xiàn)枯水癥狀。自交琯溪蜜柚汁胞粒化比較嚴重，而通過雜交授粉的琯溪蜜柚其果實汁胞粒化較輕。前人研究發(fā)現(xiàn)，雜交果中含有較高含量的內(nèi)源激素GA3，授粉后可使子房IAA、ABA等內(nèi)源激素含量增加，促進果實發(fā)育，從而降低果實?；陌l(fā)生率[73]。另外，外源施加植物激素也能調(diào)控柑橘果實枯水的發(fā)生。例如，Inder等[74]通過外源施用GA、2,4-D、2,4,5-T和NAA 顯著降低了‘丹西’紅桔枯水的發(fā)生率和發(fā)生程度，并增加了單果質(zhì)量、總糖和可溶性固形物。Shi等[75]通過外源激素持續(xù)處理離體培養(yǎng)的柚汁胞50 d，發(fā)現(xiàn)外源IAA和ABA可以顯著抑制或者促進CgMYB58及其靶基因CgPAL1、CgPAL2、Cg4CL1和CgC3H的表達量，從而有效調(diào)控華農(nóng)紅柚汁胞?；陌l(fā)生。

3 柑橘果實枯水的分子生物學(xué)研究進展

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，柑橘枯水的研究不再停留于形態(tài)、生理生化和細胞層面，轉(zhuǎn)而從分子層面和基因?qū)用鎸Ω涕俟麑嵖菟臋C制進行研究。佘文琴等[71]采用mRNA 差異顯示技術(shù)對琯溪蜜柚汁胞響應(yīng)?；幕蜻M行鑒定，獲得了25 個差異cDNA 片段，并進一步采用RACE技術(shù)克隆了相關(guān)基因cDNA全長。鐘鳳林[76]采用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對琯溪蜜柚汁胞不同發(fā)育時期響應(yīng)粒化的蛋白質(zhì)進行分析，鑒定到30個在粒化汁胞中差異表達的蛋白，包括與細胞壁伸展相關(guān)的Germin(草酸氧化酶)蛋白和汁胞發(fā)育相關(guān)的APX(抗壞血酸過氧化物酶)蛋白。楊明等[77]采用抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建了椪柑果肉枯水差減文庫，分離到52個椪柑枯水相關(guān)差異表達基因，其中8個參與衰老、抗逆防御、幾丁質(zhì)和細胞壁代謝、蛋白降解的基因均顯著上調(diào)表達。Zhang等[63]利用生物信息學(xué)分析篩選到12個與甜橙枯水相關(guān)的候選miRNA，并且發(fā)現(xiàn)csi-miR397，N-miR828 可能通過分別調(diào)控Cs6g06890.1和Cs1g17590.1基因的表達來調(diào)控木質(zhì)素的合成從而調(diào)控柑橘汁胞枯水。Yao等[29]采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究椪柑果實采后枯水機制，發(fā)現(xiàn)細胞壁果膠合成關(guān)鍵基因 UDP-葡萄糖醛酸-差向異構(gòu)酶基因(GAE)和半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因(GAUT)表達量顯著上調(diào)，而果膠降解關(guān)鍵基因果膠甲酯酶基因(PME)表達量顯著下調(diào)，導(dǎo)致枯水汁胞中果膠積累。纖維素合酶基因和木質(zhì)素合成基因如肉桂醇脫氫酶(CAD)基因表達量顯著上調(diào)，導(dǎo)致細胞壁纖維素和木質(zhì)素含量增加。Wu等[20]通過轉(zhuǎn)錄組測序從晚熟臍橙采前枯水果實中鑒定出903個差異表達基因，并且發(fā)現(xiàn)與果膠分解相關(guān)的PME基因上調(diào)表達，多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因則下調(diào)表達；與木質(zhì)素合成相關(guān)的苯丙氨酸酶(PAL)、CAD和POD上調(diào)表達，而參與纖維素分解的CL下調(diào)表達。Shi等[75]對‘華農(nóng)紅柚’‘HB柚’和‘高班柚’不同發(fā)育時期果實進行分析，發(fā)現(xiàn)‘華農(nóng)紅柚’最易發(fā)生枯水，同時其木質(zhì)素含量也最高；隨后對‘華農(nóng)紅柚’‘HB柚’和‘高班柚’不同發(fā)育時期汁胞進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)PAL、4-香豆酸酯CoA連接酶基因(4CL)、肉桂酸4-羥化酶基因(C4H)、咖啡酰CoA 3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(CCoAOMT)等17個木質(zhì)素合成相關(guān)基因在易枯水的華農(nóng)紅柚汁胞中高表達，說明木質(zhì)素合成途徑可能是影響柑橘果實枯水的關(guān)鍵因素。

轉(zhuǎn)錄因子在植物次生細胞壁生物合成和發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用[78-79]。Yao等[29]在椪柑枯水汁胞中鑒定到一些響應(yīng)枯水的轉(zhuǎn)錄因子如NAC、MYB等。前人研究表明，柑橘CsMYB330、CsMYB3308和CsMYB85可以精細調(diào)控木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因表達，進而調(diào)控次生細胞壁合成[80-81]。Shi等[75]發(fā)現(xiàn)將CgMYB58瞬時超量表達‘華農(nóng)紅柚’和‘高班柚’的白皮層或穩(wěn)定超表達柑橘愈傷組織能夠激活木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因CgPAL1、CgPAL2、Cg4CL1和CgC3H的表達，可以顯著增加木質(zhì)素的含量，說明MYB58能夠通過調(diào)控木質(zhì)素的合成而直接影響柚果實的粒化。

4 柑橘果實枯水發(fā)生的生理及分子機制

柑橘果實長期儲存或受冬季低溫脅迫的影響，導(dǎo)致汁胞中果膠分解相關(guān)的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因下調(diào)表達，PG酶活性較低，而果膠甲基酯酶(PME)基因顯著上調(diào)表達，果膠被PME酶去甲基化和脫酯化，溶解性不斷增加，但由于PG酶的低活性可能不足以完全解離膠質(zhì)側(cè)鏈并順利分解果膠，從而導(dǎo)致高分子質(zhì)量果膠的積累并增加了果汁的粘度。隨后果膠物質(zhì)與游離的Ca2+結(jié)合導(dǎo)致果實汁胞硬化[82]。當可溶性果膠積累達到一定水平時，可在Ca2+的作用下形成鈣橋或被酯鍵固定化，從而形成凝膠，將水分束縛在凝膠中。同時，汁胞中纖維素酶(CL)基因的表達顯著下調(diào)，纖維素酶活性低，降解過程受阻，導(dǎo)致纖維素含量的積累。此外，轉(zhuǎn)錄因子MYB58的表達上調(diào)，導(dǎo)致汁胞中PAL、4CL、CAD和POD等與木質(zhì)素合成有關(guān)的基因顯著上調(diào)表達，相應(yīng)的酶活性升高，木質(zhì)素大量合成。隨著木質(zhì)素合成的增加，分解速率低于合成速率，導(dǎo)致次生壁生長、增厚，呈現(xiàn)出枯水癥狀。上述過程同時受到植物細胞內(nèi)源激素尤其是脫落酸(ABA)和生長素(IAA)的調(diào)控，ABA在發(fā)生枯水過程中一直保持著高水平，而IAA則保持較低水平。ABA和IAA能夠顯著抑制或者促進CgMYB58及其靶基因CgPAL1、CgPAL2、Cg4CL1和CgC3H的表達量，從而導(dǎo)致果實枯水的發(fā)生(圖1)。

ABA：脫落酸，IAA：吲哚-3-乙酸，PME：果膠甲基酯酶，PG：多聚半乳糖醛酸酶，PAL：苯丙氨酸解氨酶，C4H：肉桂酸4-羥化酶，4CL：4-香豆酸酯CoA連接酶，CAD：肉桂醇脫氫酶，POD：過氧化物酶，CL：纖維素酶。紅色表示在枯水的柑橘果實中上調(diào)，綠色表示下調(diào)。ABA:Abscisic acid,IAA:Indole-3-acetic acid,PME:Pectin methylesterase,PG:Polygalacturonase,PAL:Phenylalanine ammonia lyase,C4H:Cinnamate 4-hydroxylase,4CL:4-Coumarate CoA ligase,CAD:Ainnamyl alcohol dehydrogenase,POD:Peroxidase,CL:Cellulase. Red colour indicated up-regulation in granulated citrus fruits,green colour indicated down-regulation.

5 展 望

柑橘果實汁胞受內(nèi)源激素、相關(guān)酶和基因的調(diào)控，發(fā)生糖酸物質(zhì)代謝、營養(yǎng)物質(zhì)消耗等一系列生理生化變化，汁胞水分和內(nèi)含物質(zhì)的不斷轉(zhuǎn)移和消耗，最終導(dǎo)致果實汁胞崩塌、變癟、變干和枯水。近年來研究人員從細胞學(xué)、品質(zhì)營養(yǎng)、激素水平、酶活性和分子生物學(xué)等方面對柑橘果實枯水發(fā)生的生理和分子機制進行了初步的探究，并在柚類果實?；霓D(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究中取得了突破性的進展。但關(guān)于柑橘果實枯水過程中代謝產(chǎn)物的變化和基因的生物學(xué)功能還有待深入研究。今后對柑橘枯水機制和防控的研究應(yīng)集中于以下幾個方面：(1)通過靶向/非靶向LC-MS對柑橘枯水果實中的代謝物進行檢測，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組明確影響柑橘枯水的關(guān)鍵代謝物及其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；(2)通過酵母文庫深入挖掘調(diào)控柑橘果實枯水的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并通過柑橘遺傳轉(zhuǎn)化研究細胞壁代謝關(guān)鍵基因(PG、PME、PAL、POD、PAL、4CL等)及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能；(3)基于柑橘枯水生理生化和分子機制研究成果，在生產(chǎn)中開展柑橘枯水的防控技術(shù)措施研究，包括柑橘新品種區(qū)域化布局、柑橘園溫濕度等環(huán)境調(diào)控、砧穗組合篩選、礦質(zhì)營養(yǎng)和生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用、留樹和采后保鮮藥劑篩選等，從而預(yù)防和減輕柑橘果實枯水。