廖丁瑩，付麗麗，鄭玉萍，王麗君，李宏松，張文怡，王建明，趙 琳

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種常見的視網(wǎng)膜變性疾病，主要發(fā)生于50歲以上的中老年人群。近20a來，ARMD的患病率已經(jīng)達(dá)到8.7%[1]。濕性ARMD是以黃斑區(qū)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)為主要特點(diǎn)，異常的新生血管會(huì)引起出血和滲出，使黃斑部感光細(xì)胞功能減退，甚至造成纖維瘢痕化和視網(wǎng)膜脫離，視力永久性喪失[2]。目前一線治療方法為玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)類藥物治療，抑制或減少新生血管的形成及出血滲出。但是隨著該類藥物的廣泛應(yīng)用和隨訪時(shí)間的延長，視網(wǎng)膜下纖維化逐漸加重的情況日益突顯。有文獻(xiàn)指出在CNV疾病中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是新生血管和纖維化過程中多因素作用的關(guān)鍵細(xì)胞，脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞符合內(nèi)皮細(xì)胞的特有表型[3]。內(nèi)皮細(xì)胞在各種刺激因子的作用下，其內(nèi)皮特性逐漸消失而轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞(endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT)，最終導(dǎo)致纖維化，形成視網(wǎng)膜下瘢痕[4]。目前普遍認(rèn)為缺氧會(huì)使轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)水平升高，TGF-β又是刺激EndoMT發(fā)生的最常見的因子，同時(shí)也會(huì)引起下游纖維化因子增多[5]，進(jìn)一步加重視網(wǎng)膜下纖維化的程度。

吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)是一種新型的廣譜抗纖維化小分子化合物，其主要作用靶點(diǎn)是TGF-β，可有效抑制纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積[6]，已成為治療肝、腎及心肌纖維化的一線藥物。但PFD是否能夠延緩CNV患者視網(wǎng)膜下纖維化的進(jìn)展尚未見報(bào)道。本研究初步觀察PFD對缺氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT過程的抑制作用及機(jī)制，探討PFD延緩視網(wǎng)膜下纖維化的可行性。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器M199培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(BI)，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ScienCell)，吡非尼酮(Sigma)，CoCl2(Sigma)，CCK-8(索萊寶)，Trizol(Invitrogen)，反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒(TaKaRa)，PCR引物(生工)，BCA蛋白定量試劑盒(赫特)。電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和發(fā)光儀(Bio-Rad)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Step One Plus)；熒光成像顯微鏡(Zeiss)。

1.2方法

1.2.1原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分離及培養(yǎng)標(biāo)本取自于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科正常剖宮產(chǎn)的新生兒無菌臍帶，約25～30cm，置于無菌保存液中轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究標(biāo)本取材獲得西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批[No.(2019)倫審-研第(021)號]。在超凈臺(tái)內(nèi)用滅菌PBS緩沖液反復(fù)沖洗臍靜脈內(nèi)部以除去凝血塊及殘留物，預(yù)熱至37℃的0.1% Ⅰ型膠原酶10mL灌入臍靜脈內(nèi)，夾閉臍帶兩端，37℃消化10min，期間不時(shí)地晃動(dòng)臍帶使膠原酶Ⅰ充分接觸靜脈內(nèi)壁。消化結(jié)束后回收消化液至離心管內(nèi)，室溫下800×g離心5min得到臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，加入含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，吹打混勻種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后換液。待內(nèi)皮細(xì)胞生長融合至80%～90%時(shí)，用0.05%胰蛋白酶消化傳代，經(jīng)vWF因子抗原實(shí)驗(yàn)鑒定確認(rèn)原代細(xì)胞分離成功，選第4～7代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2原代HUVECs鑒定免疫熒光法檢測vWF因子抗原。將細(xì)胞均勻接種于置有滅菌爬片的24孔板內(nèi)，生長至約50%時(shí)，PBS緩沖液清洗后加入4%多聚甲醛冰上固定30min，PBS緩沖液洗滌后加入0.1% Triton-X100溶液，室溫破膜20min，小牛血清室溫封閉1h，加入兔抗人vWF因子抗體(Abcam，ab154193，1∶300)，4℃過夜，再加入488nm熒光素標(biāo)記的羊抗兔二抗(CST，#4412，1∶800)室溫孵育1h，DAPI室溫作用20min后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力將細(xì)胞每孔100μL均勻接種于96孔板中，根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]的濃度梯度，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度PFD(0、0.01、0.1、0.3、0.6、0.9mg/mL)或CoCl2(0、25、50、100、200、400、800μmol/L)，分別孵育不同時(shí)間(12、24、48h)后，每孔加入10μL CCK-8工作液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，取出后測定各孔在450nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%，篩選出合適的藥物濃度和作用時(shí)間。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：(1)正常對照組：不含CoCl2和PFD的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h；(2)CoCl2模型組：含200μmol/L CoCl2的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h；(3)CoCl2+低濃度PFD組：含0.3mg/mL PFD的無血清培養(yǎng)基預(yù)處理1h，再用含200μmol/L CoCl2和0.3mg/mL PFD的無血清培養(yǎng)基共同培養(yǎng)細(xì)胞24h；(4)CoCl2+高濃度PFD組：含0.6mg/mL PFD的無血清培養(yǎng)基預(yù)處理1h，再用含200μmol/L CoCl2和0.6mg/mL PFD的無血清培養(yǎng)基共同培養(yǎng)細(xì)胞24h。收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測蛋白質(zhì)相對表達(dá)量收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，與上樣緩沖液混合后高溫煮10min。在聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳，使用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至激活的PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h。按照目標(biāo)蛋白的分子量裁膜，分別加入上皮標(biāo)志物CD31(Santa Cruz，sc-376764，1∶500)、VE-cadherin(Abcam，ab33168，1μg/mL)，纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA(Abcam，ab5694，1μg/mL)、FSP1(Abcam，ab197896，1∶1000)，通路因子p-p38(ABclonal，AP0057， 1∶1000)、p38(ABclonal，A4771，1∶1000)和內(nèi)參GAPDH(Proteintech，60004-1-lg，1∶25000)抗體，4℃過夜，TBST洗膜后分別加入羊抗兔(Elabscience，E-AB-1003，1∶3000)、羊抗鼠(Elabscience，E-AB-1001，1∶3000)二抗，室溫孵育1h，洗膜后加入ECL顯色液后曝光拍照。

圖1 原代HUVEC細(xì)胞的形態(tài)及鑒定 A：光鏡(×40)；B：光鏡(×100)；C：vWF因子熒光染色(×200)。

1.2.6細(xì)胞免疫熒光雙染法檢測蛋白表達(dá)情況細(xì)胞隨機(jī)均勻種于鋪有無菌爬片的24孔板中，貼壁后各組分別加入相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，24h后4%多聚甲醛冰上固定30min，PBS緩沖液洗滌后加入0.1% Triton-X100溶液，室溫破膜20min，小牛血清室溫封閉1h，滴加鼠抗人CD31(Abcam，ab24590，1∶150)和兔抗人α-SMA(Abcam，ab5694，1∶100)混合抗體，4℃過夜，洗滌后分別滴加種屬對應(yīng)的594nm(Proteintech，SA00013-3，1∶250)和488nm(CST，#4412，1∶800)熒光二抗，避光室溫孵育1h，洗滌后DAPI避光染色20min，洗滌后封片。鏡下拍照觀察。

1.2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力預(yù)先在六孔板背面畫出定位線，細(xì)胞隨機(jī)均勻種于各孔，貼壁后用200μL槍頭垂直于定位線畫出劃痕，按照分組分別加入相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，每孔于劃痕后0、24h在顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞遷移率=(0h劃痕距離-24h劃痕距離)/0h劃痕距離×100%。

1.2.8實(shí)時(shí)定量q-PCR檢測mRNA含量按各個(gè)分組進(jìn)行培養(yǎng)干預(yù)后收集細(xì)胞，使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測定純度和濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用20μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，1個(gè)循環(huán)，94℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s，循環(huán)40次。TGF-β1引物序列：5’-CAGCAACAATTCCTGGCGATA-3’，5’-GCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3’；SNAI1引物序列：5’-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3’，5’-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3’；β-actin引物序列：5’-TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC-3’，5’-GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線結(jié)果，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1原代HUVECs細(xì)胞鑒定接種24h后，鏡下可見內(nèi)皮細(xì)胞貼壁，呈梭形或橢圓形，邊界清晰。第4～6d，內(nèi)皮細(xì)胞單層生長融合成片，排列緊密的部分呈典型的鋪路鵝卵石樣(圖1A、1B)。熒光顯微鏡下可見內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)均有亮度較強(qiáng)的綠色熒光，說明人vWF因子存在于細(xì)胞內(nèi)，證明上述方法分離HUVECs細(xì)胞成功，且純度可達(dá)95%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1C)。

2.2不同濃度CoCl2和PFD對HUVECs的增殖活力影響

篩選CoCl2誘導(dǎo)缺氧建立纖維化模型的最佳作用時(shí)間和濃度。結(jié)果如圖2A所示，隨著CoCl2作用時(shí)間和濃度的增加，細(xì)胞的增殖率逐漸下降，24h時(shí)各組細(xì)胞的增殖活力均在50%左右，對照組、25、50、100、200、400、800μmol/L CoCl2組的增殖率分別為(100±0)%、(83.48±9.11)%、(79.52±10.00)%、(69.72±11.78)%、(59.05±7.40)%、(44.75±10.69)%、(38.17±4.97)%，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.52，P<0.01)。與對照組相比，100、200、400、800μmol/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.298、13.56、12.66、30.54，均P<0.001)，表明CoCl2會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞缺氧，降低增殖率，具有一定的濃度依賴性。200μmol/L CoCl2干預(yù)細(xì)胞24h后增殖率略大于50%，故本實(shí)驗(yàn)使用200μmol/L CoCl2刺激細(xì)胞24h建立細(xì)胞模型。

篩選PFD最佳治療時(shí)間和濃度。結(jié)果如圖2B所示，不同時(shí)間不同濃度PFD組分別與對照組、DMSO組相比，細(xì)胞增殖率基本不受影響(F12h=0.418，F(xiàn)24h=0.289，F(xiàn)48h=0.240，均P>0.05)，表明使用DMSO溶解PFD不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，且單純使用PFD不會(huì)對內(nèi)皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。

圖2 CoCl2和PFD對內(nèi)皮細(xì)胞增殖率的影響 A：CoCl2對細(xì)胞增殖率的影響(a P<0.05，b P<0.01 vs 對照組)；B：PFD對細(xì)胞增殖率的影響；C：PFD對缺氧條件下細(xì)胞增殖率的影響(b P<0.01 vs 對照組；d P<0.01 vs 單純?nèi)毖踅M)。

不同濃度PFD預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1h后，再加入200μmol/L CoCl2，使其共同干預(yù)刺激細(xì)胞24h，結(jié)果如圖2C所示，對照組、單純?nèi)毖踅M、0.01、0.1、0.3、0.6、0.9mg/mL PFD組細(xì)胞增殖率分別為(100±0)%、(60.81±5.23)%、(59.4±5.90)%、(60.81±7.23)%、(72.45±6.30)%、(75.85±6.21)%、(79.7±4.94)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.1，P<0.001)。與對照組相比，單純?nèi)毖踅M細(xì)胞增殖率降低(t=13.8，P<0.001)；與單純?nèi)毖踅M相比，經(jīng)0.3、0.6、0.9mg/mL PFD溶液預(yù)處理后細(xì)胞增殖率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.478、4.534、6.427，均P<0.01)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用200μmol/L CoCl2和0.3、0.6mg/mL PFD共同干預(yù)細(xì)胞。

2.3 PFD對缺氧誘導(dǎo)的EndoMT過程中細(xì)胞遷移能力的影響各組細(xì)胞遷移率分別為(100±5.34)%、(332.63±10.37)%、(183.97±13.27)%、(204.75±9.40)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=129.4，P<0.001)。正常對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，24h后劃痕邊緣整齊光滑，仍清晰可見；CoCl2模型組細(xì)胞劃痕邊緣在24h時(shí)基本消失，細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移，狀態(tài)不佳，變形及死亡的細(xì)胞數(shù)量增多；CoCl2模型組與正常對照組相比，缺氧后內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力增加(t=38.87，P=0.0007)。經(jīng)低濃度或高濃度PFD溶液預(yù)處理后，兩組細(xì)胞的形態(tài)較CoCl2模型組改善，兩組間細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.369，P=0.078)，但與模型組對比遷移率均明顯減小(t=88.41、16.29，均P<0.01)。證明PFD可抑制缺氧對內(nèi)皮細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)作用(圖3)。

2.4 PFD對缺氧誘導(dǎo)的EndoMT過程中各標(biāo)志物蛋白及mRNA表達(dá)的影響PFD可抑制EndoMT過程中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)和增加內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)。與正常對照組相比，CoCl2模型組細(xì)胞的α-SMA、FSP1的蛋白表達(dá)水平顯著升高(t=5.328、4.706，均P<0.05)，CD31、VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平降低(t=6.379、5.78，均P<0.05)；與CoCl2模型組比較，低濃度PFD組和高濃度PFD組均能顯著抑制α-SMA、FSP1的蛋白表達(dá)，使CD31、VE-cadherin的蛋白表達(dá)仍維持在一個(gè)較高的水平(均P<0.05)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見圖4，表1。

PFD可抑制EndoMT過程中轉(zhuǎn)錄因子及通路因子的表達(dá)。與正常對照組相比，CoCl2模型組中p-p38磷酸化蛋白被激活(t=7.382，P<0.05)，經(jīng)高低濃度PFD干預(yù)后，p-p38蛋白的磷酸化過程被抑制(t=4.667、9.392，均P<0.05)，p38總蛋白含量不變(P>0.05)，圖5A、5B，表1。

q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CoCl2模型組細(xì)胞中TGF-β1、轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 mRNA含量較正常對照組明顯升高(t=14.46、9.89，均P<0.05)；與CoCl2模型組相比，低濃度和高濃度PFD組能明顯抑制TGF-β1、轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 mRNA轉(zhuǎn)錄(均P<0.05)，且兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2，圖5C。

細(xì)胞免疫熒光雙染檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞CD31和α-SMA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.6、33.42，均P<0.001)。與正常對照組相比，CoCl2模型組細(xì)胞CD31紅色熒光強(qiáng)度顯著變?nèi)?t=18.02，P<0.01)，α-SMA綠色熒光強(qiáng)度增加(t=24.26，P<0.01)；與CoCl2模型組比較，低濃度和高濃度PFD組細(xì)胞α-SMA綠色熒光強(qiáng)度均被抑制(t=7.403、4.935，均P<0.05)，CD31紅色熒光強(qiáng)度增加(t=10.09、4.394，均P<0.05)；低濃度和高濃度PFD組相比，α-SMA和CD31熒光強(qiáng)度無明顯差異(t=1.021、1.152，均P>0.05)，見圖6。

圖3 PFD對缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響 A：光鏡下各組遷移距離的測量(×40)；B：各組遷移率的定量分析。b P<0.01 vs 正常對照組；d P<0.01 vs CoCl2模型組。

圖4 PFD對缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT過程中相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)量的影響 A：內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志因子(CD31、VE-cadherin)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子(α-SMA、FSP1)的蛋白表達(dá)檢測條帶；B：各標(biāo)志因子蛋白表達(dá)的定量分析。a P<0.05 vs 正常對照組；c P<0.05 vs CoCl2模型組。

表1 各組細(xì)胞中CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP1、p-p38和p38蛋白條帶灰度值

表2 各組細(xì)胞中TGF-β1和SNAI1 mRNA表達(dá)情況

3討論

眼底新生血管性疾病對視力產(chǎn)生影響的原因主要有活動(dòng)性新生血管的出血滲出和新生血管萎縮后形成的纖維化組織。目前抗VEGF治療主要針對的是減少新生血管的生成及出血滲出，而對血管萎縮后的纖維化改變關(guān)注較少。Pedrosa等[8]對接受抗VEGF連續(xù)治療的ARMD患者展開60mo的隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)有55.69%的隨訪者出現(xiàn)了較嚴(yán)重的黃斑部視網(wǎng)膜下纖維化。雖然纖維化是新生血管的必然結(jié)局，但是多次抗VEGF治療會(huì)破壞血管新生和纖維化之間的平衡，和自然病程共同引起過度的纖維增殖[9]。多項(xiàng)研究證實(shí)在各種因素刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞可通過TGF-β、Notch、Wnt等信號通路在心臟、肺和腎組織中發(fā)生EndoMT[10]。目前視網(wǎng)膜下纖維化的研究多集中于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，而脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndoMT)則關(guān)注較少。

圖5 PFD對缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞EndoMT過程中轉(zhuǎn)錄因子及通路因子表達(dá)的影響 A：通路標(biāo)志因子(p38、p-p38)的蛋白表達(dá)檢測條帶；B：p38、p-p38蛋白表達(dá)的定量分析；C：通路標(biāo)志因子TGF-β1和轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 mRNA表達(dá)的定量分析。a P<0.05，b P<0.01 vs 正常對照組；c P<0.05，d P<0.01 vs CoCl2模型組。

圖6 PFD對缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞中CD31和α-SMA表達(dá)的影響 A：各組細(xì)胞CD31和α-SMA的免疫熒光雙染結(jié)果(×200，CD31為紅色熒光，α-SMA為綠色熒光)；B：CD31和α-SMA的免疫熒光強(qiáng)度定量分析。b P<0.01 vs 正常對照組；c P<0.05，d P<0.01 vs CoCl2模型組。

缺氧是導(dǎo)致ARMD疾病發(fā)展的一個(gè)重要因素，缺氧會(huì)促進(jìn)新生血管的發(fā)生，而血管的生長則使缺血進(jìn)一步加重，使脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入EndoMT過程，引起視網(wǎng)膜下纖維瘢痕形成，所以尋找抑制視網(wǎng)膜下纖維化的方法顯得尤為重要。由于人脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞很難獲得，HUVECs是從人臍帶靜脈血管中分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞，是研究新生血管及其后期進(jìn)展的重要體外細(xì)胞模型，在視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管的研究中也廣泛應(yīng)用[11]，故本研究使用HUVECs作為細(xì)胞模型。首先，本研究利用CoCl2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞缺氧，建立纖維化模型。實(shí)驗(yàn)中觀察到內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧環(huán)境中遷移能力增強(qiáng)，形態(tài)由鋪路鵝卵石樣逐漸變?yōu)楠M長梭形，細(xì)胞之間的緊密連接變松散，間隙增大，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VE-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1表達(dá)增多，說明該缺氧模型可以成功誘導(dǎo)EndoMT的發(fā)生。

既往研究證實(shí)PFD在腎、肺和肝臟等器官中可以減少促纖維和促炎癥因子的分泌和表達(dá)，如TGF-β、TNF-α，從而抑制細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化和膠原蛋白產(chǎn)生[12]。眼部的新生血管形成和纖維化均與TGF-β有關(guān)[13]。Martin等[14]學(xué)者發(fā)現(xiàn)患者接受抗VEGF藥物治療后，玻璃體腔中TGF-β含量增加，與后期纖維化顯著相關(guān)。本研究通過CCK-8法檢測了不同濃度PFD對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示PFD可明顯抑制缺氧細(xì)胞的增殖，其濃度為0.3、0.6和0.9mg/mL時(shí)均有效果，且組間無明顯差異，考慮到0.9mg/mL濃度較高，可能會(huì)引起藥物副作用，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度選擇0.3、0.6mg/mL。實(shí)驗(yàn)中各濃度PFD對正常內(nèi)皮細(xì)胞的增殖無明顯影響，主要是因?yàn)樵谡Ｒ暰W(wǎng)膜脈絡(luò)膜組織中，TGF-β處于無活性的“潛活狀態(tài)”，當(dāng)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜組織受到缺血、缺氧、炎癥等損傷時(shí)，可以激活TGF-β[15]，使其可以發(fā)揮促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞外基質(zhì)降解等纖維化改變，此時(shí)PFD可以有效抑制這些生物學(xué)效應(yīng)。

本研究對缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞給予PFD治療后，光鏡下觀察治療組的細(xì)胞形態(tài)比單純?nèi)毖踅M的形態(tài)更圓潤，細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞邊緣突起減少，比較接近正常內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)可以觀察到PFD組的細(xì)胞遷移能力較單純?nèi)毖踅M弱。與單純?nèi)毖踅M相比，PFD組的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VE-cadherin的蛋白質(zhì)表達(dá)增多，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1的蛋白質(zhì)表達(dá)減少。上述改變在高低濃度PFD組間沒有顯著差異。由此證實(shí)了PFD可抑制內(nèi)皮細(xì)胞向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的EndoMT過程，且該抑制作用對PFD濃度的差異不敏感，可以說明0.3～0.6mg/mL均為細(xì)胞治療窗，PFD的有效濃度范圍較大，該有效濃度與Guo等[7]報(bào)道的用于抑制Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖遷移時(shí)的濃度相同。

近年來，TGF-β/Smad通路被認(rèn)為是促進(jìn)纖維化的經(jīng)典信號通路。除此之外，多種Smad非依賴性信號通路可以被TGF-β激活[16]。Choi等[17]驗(yàn)證了PFD通過TGF-β/Smad通路抑制纖維化的發(fā)生。有研究已經(jīng)證明TGF-β能夠通過p38 MAPK信號通路促進(jìn)眼部各組織多種細(xì)胞的新生血管生長和瘢痕化[18]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧的內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β1和轉(zhuǎn)錄因子SNAI1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，p-p38磷酸化蛋白被激活，而加入PFD干預(yù)后可以抑制這些因子的轉(zhuǎn)錄增加以及p-p38磷酸化蛋白的激活，初步提示PFD抑制EndoMT過程是通過TGF-β/p38 MAPK通路進(jìn)行的，這對PFD可以延緩視網(wǎng)膜下纖維化的效果及機(jī)制提供了更充分的理論依據(jù)。

綜上所述，PFD可以有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞纖維化的進(jìn)展，TGF-β/p38 MAPK通路可能是PFD調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化EndoMT過程的機(jī)制之一，這可以成為PFD抗視網(wǎng)膜下纖維化的理論基礎(chǔ)，但該作用在眼內(nèi)的實(shí)際效果，則需要更進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)論證。