楊 義，張文芳，李玉婷，趙 鑫，張金紅，張冬梅，李 志

0引言

高海拔視網(wǎng)膜病變是一種常見的高原疾病，臨床上常常以視網(wǎng)膜血管的扭曲擴張，視網(wǎng)膜斑點狀或火焰狀出血，棉絮斑，玻璃體出血和視盤水腫為特征[1]。近年隨著高原地區(qū)經(jīng)濟的發(fā)展，高海拔視網(wǎng)膜病變成為影響高原旅游人群視功能損傷的主要原因，高海拔視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率逐年增加[2]。目前對高海拔視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制并不清楚，其預防及治療仍在探索研究階段。既往有研究指出黃芪、人參、紅景天、蕨麻等傳統(tǒng)中藥在高原疾病防治中有著重要的臨床應用價值[3]，復方血栓通膠囊的主要成分為三七、黃芪、丹參和玄參，具有活血化瘀，益氣養(yǎng)陰的功效。本文擬利用高原倉模擬高原缺氧環(huán)境，通過動物實驗研究高海拔視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制，初步探討復方血栓通膠囊在高海拔視網(wǎng)膜病變的預防作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康清潔級雄性SD大鼠48只，年齡8～10周齡，體質(zhì)量200±20g，來自于蘭州大學動物實驗中心[SCXK(甘)2013-0002]，裂隙燈下見雙眼角膜透明，前房清，晶狀體透明，直接檢眼鏡下眼底未見明顯異常。飼養(yǎng)于通風、安靜、陰暗環(huán)境，室內(nèi)溫度18℃～26℃，濕度30%～60%，干燥、新鮮飼料喂養(yǎng)大鼠。實驗動物及實驗使用條件均參照國家《實驗動物管理條例》的規(guī)定執(zhí)行。本研究通過蘭州大學第二醫(yī)院倫理委員會批準(審批編號：D2017-098)。

1.1.2主要試劑與儀器主要試劑：戊巴比妥鈉(北京普博斯生物有限公司)，速眠新Ⅱ注射液(吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司)，復方托吡卡胺滴眼液(沈陽興齊)，卡波姆眼用凝膠，蘇木素染液(北京，Solarbio life science)，HIF-1兔抗鼠抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，DAB顯色試劑(北京博奧森生物技術有限公司)，大花紅景天口服液(國藥準字B20070002，西藏藏藥集團股份有限公司)，復方血栓通膠囊(國藥準字Z20030017，廣東眾生藥業(yè)股份有限公司)，肌苷片(國藥準字H44021166，廣東恒健制藥有限公司)。主要儀器設備：高原環(huán)境負壓模擬艙(HA-6，濰坊華信氧業(yè)有限公司)，羅蘭視覺電生理儀(德國ROLAND)。

1.2方法

1.2.1高海拔視網(wǎng)膜病變動物模型的建立雄性SD大鼠24只隨機分為6組，每組4只，速眠新Ⅱ注射液和1%戊巴比妥鈉注射液腹腔麻醉后，散瞳，暗適應3h，行電生理檢查，再次標準喂養(yǎng)1d，然后分別飼養(yǎng)于模擬高海拔艙內(nèi)2、4、6、10、24、72h。模擬艙的各參數(shù)設置為：海拔5000m，氣壓：54.02kPa，氧分壓：11.3kPa，溫度：22℃～26℃，相對濕度：26%～30%，海拔上升速度：16m/s，控制器參數(shù)設置SP1=0.304，SP2=0.307，自動調(diào)控系統(tǒng)維持艙內(nèi)負壓恒定。各組大鼠出艙后，立即腹腔注射麻醉藥物麻醉大鼠后，再次行電生理檢查，隨后處死大鼠，將右眼球浸入固定液內(nèi)固定，行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)及免疫組織化學(IHC)染色觀察大鼠視網(wǎng)膜缺氧誘導因子(HIF)-1α的表達。

1.2.2復方血栓通對大鼠高原視網(wǎng)膜病變的預防作用雄性SD大鼠24只隨機分為4組，每組6只，腹腔麻醉后行電生理檢查，標準飼養(yǎng)1d后，根據(jù)人體用藥量換算成大鼠等效劑量作為大鼠給藥量，分別在每日13∶00給予安慰劑(生理鹽水)，大花紅景天口服液(40mL/kg)，肌苷片(240mg/kg)及復方血栓通膠囊(0.45g/kg)灌胃，連續(xù)7d，7d喂藥結束后飼養(yǎng)于模擬海拔為5000m模擬艙內(nèi)(具體參數(shù)如高海拔視網(wǎng)膜病變動物模型的建立)。10h后出艙，腹腔麻醉后再次行電生理檢查，然后處死大鼠摘取右眼球行HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)及免疫組織化學染色觀察大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α的表達。

1.2.3電生理檢查根據(jù)大鼠視網(wǎng)膜電圖和閃光視覺誘發(fā)電位記錄標準化方案，每只大鼠出艙后，暗適應3h后，暗箱轉移至暗室，弱紅光照明條件下行大鼠腹腔麻醉，散瞳，雙眼角膜處放置角膜電極，尾部皮下刺入接地電極，雙側頰黏膜刺入?yún)⒖茧姌O后再次暗適應5min后進行F-ERG檢查，記錄雙眼F-ERG的b波振幅。每只大鼠均統(tǒng)一選擇右眼F-ERG數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.2.4 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)大鼠處死后，取右眼球?qū)⑵浣牍潭ㄒ簝?nèi)固定48h，然后用眼科顯微剪沿著角鞏緣剪開眼球，小心去除角膜，晶狀體后沿視神經(jīng)剪開眼球，乙醇脫水，石蠟包埋，冷卻切片，展片，烤片，脫臘后蘇木精染色，0.5%鹽酸乙醇分化，氨水返藍，伊紅染色，酒精脫水，最后滴入中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察、采集圖像。

1.2.5 IHC染色觀察大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α的表達取出固定液內(nèi)的眼球，去除角膜、晶狀體，平行視軸切開眼球，脫水，包埋，切片后，切片常規(guī)脫臘至水，熱修復抗原，切片冷卻，PBS漂洗，3% H2O2溫室孵育，再次PBS漂洗，滴加Ultra V Block室溫孵育后PBS液漂洗，加兔抗原HIF-1α(1∶300)；0.1mol/L PBS替代一抗作陰性對照。滴加生物素標記二抗，孵育后沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，孵育沖洗，DAB顯色，鏡下觀察染色效果，漂洗，蘇木精復染，脫水、透明、封片，觀察采圖。

圖1 5000m海拔高度HE染色顯示的視網(wǎng)膜水腫狀態(tài)(×200) A：0h；B：2h；C：4h；D：6h；E：10h；F：24h；G：72h。

圖2 5000m海拔高度各組SD大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α免疫組化染色像(×200) A：0h；B：2h；C：4h；D：6h；E：10h；F：24h；G：72h。

統(tǒng)計學分析：本實驗所得的數(shù)據(jù)均輸入SPSS 22.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。每個時間組入艙前和入艙后的SD大鼠視網(wǎng)膜F-ERG自身前后對照比較采用配對樣本t檢驗。每組大鼠相互之間進艙前后視網(wǎng)膜F-ERG變化比較采用單因素方差分析，如總體差異有統(tǒng)計學意義，再采用LSD-t檢驗進行兩兩比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1高海拔視網(wǎng)膜病變SD大鼠模型的建立

2.1.1 5000m海拔高度下不同時間SD大鼠視網(wǎng)膜HE染色HE結果顯示模擬海拔5000m時，正常對照組(0h)SD大鼠視網(wǎng)膜各層結構規(guī)整，細胞排列整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞邊緣清晰完整，分布均勻。在高海拔視網(wǎng)膜病變SD大鼠模型中，隨著各實驗時間的增加，神經(jīng)節(jié)細胞層細胞腫脹明顯，內(nèi)核層細胞間水腫明顯，外核層層距明顯增加，外叢狀層疏松；并且在10h達到高峰，隨著時間的進一步推移，視網(wǎng)膜各層水腫仍存在，但逐漸減輕(圖1)。

2.1.2 5000m海拔高度下不同時間SD大鼠視網(wǎng)膜免疫組化染色免疫組化HIF-1α染色顯示在正常對照組(0h)SD大鼠視網(wǎng)膜組織中，HIF-1α在神經(jīng)節(jié)細胞層微量表達，在高海拔視網(wǎng)膜病變SD大鼠模型中，隨著各實驗時間的增加，大鼠視網(wǎng)膜組織中，HIF-1α在神經(jīng)節(jié)細胞及內(nèi)核層細胞胞漿明顯著色，表達增高，10h時最為明顯，隨后24h及72h HIF-1α表達較10h降低(圖2)。

表1 各組SD大鼠進入高原模擬艙前后F-ERG 暗適應最大反應b波振幅

2.1.3 5000m海拔高度下不同時間入艙前后SD大鼠視網(wǎng)膜F-ERG

2.1.3.1 5000m海拔高度下各時間組入艙前后SD大鼠視網(wǎng)膜F-ERG比較模擬5000m海拔高度下，各組SD大鼠進艙前后F-ERG暗適應最大反應b波振幅檢測結果見圖3，各組進艙前后自身對照比較，結果顯示2h和24h組F-ERG暗適應最大反應b波振幅在進入高原模擬艙前后未見明顯改變(P>0.05)，4、6、10、72h組F-ERG暗適應最大反應b波振幅在進入高原模擬艙前后有明顯改變，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

圖3 各時間組SD大鼠進艙前和進艙后的視網(wǎng)膜F-ERG暗適應最大反應b波振幅 a P<0.05 vs 進艙前。

圖4 各組SD大鼠進入高原模擬艙前后F-ERG暗適應最大反應b波振幅 b P<0.05 vs 2h組；c P<0.05 vs 24h組。

圖5 5000m海拔高度各組SD大鼠視網(wǎng)膜HE染色結果(×200) A：安慰劑組；B：復方血栓通組；C：紅景天組；D：肌苷組。

2.1.3.2 5000m海拔高度下各時間組間入艙前后SD大鼠視網(wǎng)膜F-ERG比較模擬5000m海拔高度下，各組SD大鼠進艙前和進艙后F-ERG暗適應最大反應b波振幅檢測結果見圖4。進艙前各組間b波幅值比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.471，P=0.236)；進艙后各組間b波幅值比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=3.809，P=0.010)。進艙后各組間兩兩比較，2h組與4h組、6h組、10h組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007、0.008、0.002)；24h組與4h組、6h、10h組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.035、0.040、0.012)，余各組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2復方血栓通對SD大鼠高海拔視網(wǎng)膜病變預防作用

2.2.1各組SD大鼠視網(wǎng)膜HE染色結果分別給予安慰劑(生理鹽水)、復方血栓通、紅景天及肌苷連續(xù)灌胃7d后，將SD大鼠置于模擬海拔5000m高原艙內(nèi)10h后，結果顯示復方血栓通組、紅景天組及肌苷組的視網(wǎng)膜水腫與安慰劑組相比較均明顯減輕，且復方血栓通組與紅景天組視網(wǎng)膜水腫程度明顯低于肌苷組，其中復方血栓通組內(nèi)核層細胞水腫程度最低，紅景天組神經(jīng)節(jié)細胞層水腫程度最低(圖5)。

2.2.2各組SD大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α表達免疫組化染色分別予安慰劑(生理鹽水)，復方血栓通，紅景天及肌苷連續(xù)灌胃7d后，將SD大鼠置于模擬海拔5000m高原艙內(nèi)10h后，結果顯示HIF-1α在安慰劑組SD大鼠視網(wǎng)膜組織的神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層明顯表達，復方血栓通組及紅景天組HIF-1α在神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層表達較安慰劑組明顯下降，尤其在紅景天組HIF-1α在神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層表達最少，但肌苷組同安慰劑組相比HIF-1α在神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層表達無明顯差異(圖6)。

圖6 5000m海拔高度各組SD大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α表達免疫組化染色(×200) A：安慰劑組；B：復方血栓通組；C：紅景天組；D：肌苷組。

圖7 各組SD大鼠進艙前后F-ERG暗適應最大反應b波振幅 a P<0.05 vs 安慰劑組；c P<0.05 vs 肌苷組。

2.2.3各組SD大鼠進艙前后F-ERG暗適應最大反應b波振幅比較分別予安慰劑(生理鹽水)、肌苷、復方血栓通及紅景天連續(xù)灌胃7d后，將SD大鼠置于模擬海拔5000m高原艙內(nèi)10h，各組SD大鼠進艙前后F-ERG暗適應最大反應b波振幅檢測結果見圖7，進艙前各組總體上不存在差異(F=0.177，P=0.911)，進艙后各組總體上存在差異(F=5.432，P=0.007)。進艙后各組間兩兩比較，安慰劑組與復方血栓通組(P=0.032)，安慰劑組與紅景天組(P=0.001),肌苷組與紅景天組(P=0.042)比較，差異均有統(tǒng)計學意義；復方血栓通組及紅景天組b波振幅進艙前后差值均遠低于安慰劑組，可見復方血栓通及紅景天對高海拔下大鼠視網(wǎng)膜功能均有保護作用。但肌苷組與安慰劑組、復方血栓通組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3討論

近年交通業(yè)的迅速發(fā)展使進入高原地區(qū)旅游、建設、生活、訓練的人群越來越多，對于初進入高原的人群，高海拔視網(wǎng)膜病變常是引起其視力下降的主要原因，也成為了制約高原地區(qū)旅游業(yè)和經(jīng)濟發(fā)展因素之一，因此高海拔視網(wǎng)膜病變的防治顯得尤為重要。當前國內(nèi)外對高海拔視網(wǎng)膜病變的研究主要集中在個案病例報告，臨床觀察及流行病學調(diào)查方面。Russo等[4]報道了3例患者在完成海拔6000m以上地區(qū)探險返回后，視物出現(xiàn)暗點，視力下降。眼底檢查發(fā)現(xiàn)多發(fā)性后極部出血，2mo后視力恢復眼底出血完全消退。我們團隊曾對青海省瑪沁縣40歲以上世居藏族人群視網(wǎng)膜血管性疾病相關因素的流行病學調(diào)查，顯示高海拔是視網(wǎng)膜血管性疾病的高危因素[5]。有研究指出高海拔視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制是由血視網(wǎng)膜屏障完整性破壞，神經(jīng)節(jié)細胞損傷及炎癥介質(zhì)及細胞因子的異常釋放等多種因素共同作用[6-9]，但是確切原因并未完全清楚。此外高海拔地區(qū)自然環(huán)境惡劣、多變也增加了研究難度，因此，建立有效穩(wěn)定的高海拔視網(wǎng)膜病變動物模型，繼續(xù)探索其發(fā)病機制及防治的實驗研究仍然是十分必要的。

本研究運用動物高原環(huán)境模擬實驗艙構建高海拔視網(wǎng)膜病變動物模型。在模擬海拔5000m的高海拔視網(wǎng)膜病變大鼠模型中，組織形態(tài)上通過病理組織切片觀察到隨著入艙時間的增加，大鼠視網(wǎng)膜水腫明顯，其中神經(jīng)節(jié)細胞層細胞腫脹明顯，內(nèi)核層細胞間水腫明顯，外核層層距明顯增加，外叢狀層疏松；并且在10h達到高峰，隨著時間的進一步推移，視網(wǎng)膜各層水腫仍存在，但逐漸減輕。分子水平上通過免疫組織化學染色觀察到，隨著各入艙時間的增加，大鼠視網(wǎng)膜組織中，HIF-1α在神經(jīng)節(jié)細胞及內(nèi)核層細胞胞漿明顯著色，表達增高，10h時最為明顯，隨后24、72h HIF-1α表達較10h降低。視網(wǎng)膜功能上通過F-ERG檢查，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，ERG暗視視錐-視桿細胞反應b波振幅逐漸下降，在10h下降最為明顯；隨后機體逐漸適應并開始恢復即耐受，b波振幅下降趨勢逐漸變緩慢。因此我們推測在模擬高海拔環(huán)境下，缺氧使得HIF-1α表達增高，HIF-1α通過激活血管內(nèi)皮生長因子等的表達，導致血視網(wǎng)膜屏障功能受損，視網(wǎng)膜組織水腫，神經(jīng)節(jié)細胞的腫脹、變性甚至凋亡，造成視網(wǎng)膜的形態(tài)及功能受損。

缺氧是引起高海拔視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的主要因素，以紅景天、人參、當歸等中藥制劑及肌苷片，苯丙胺等西藥制劑為代表的抗缺氧藥物的應用成了預防高海拔視網(wǎng)膜病變的研究熱點。紅景天是世居西藏高原的藏族人民防治高原病的經(jīng)驗用藥，盡管具體藥物機制不詳，但越來越多的研究指出紅景天可以降低氧耗速度又可以增加供氧作用，顯著提高機體的抗氧能力。郄濤等[10]研究認為紅景天提取物紅景天苷可以改善心肌的缺血缺氧，減少心肌的細胞損傷，周林甫等[11]發(fā)現(xiàn)紅景天苷可通過提高腦組織內(nèi)的抗氧化酶的活性，清除自由基，上調(diào)抗凋亡蛋白的表達而對神經(jīng)細胞起保護作用。肌苷在體內(nèi)轉化后參與細胞的能量代謝和蛋白質(zhì)合成，可提高輔酶A等活性，保護細胞在缺氧狀態(tài)仍繼續(xù)進行代謝[12]。然而,現(xiàn)有的中西藥物還不能滿足有效預防和治療缺氧的需求。尋找與發(fā)現(xiàn)安全有效的抗缺氧藥物,對積極防治高海拔視網(wǎng)膜病變?nèi)匀痪哂兄匾饬x。復方血栓通膠囊為復方藥，其主要成分為三七、黃芪、丹參和玄參，研究表明三七可通過對抗氧自由基損傷、抗脂質(zhì)過氧化、抑制鈣通道防止鈣超載等途徑減輕細胞損傷[13]。黃芪被證實具有增強免疫、抗疲勞、耐缺氧以及抗菌、降壓、改善缺血再灌注損傷等多種藥理作用[14]。丹參和玄參具有保護血管內(nèi)皮細胞、改善微循環(huán)、抑制和解除血小板聚集，提高機體耐缺氧能力,抑制膠原纖維的產(chǎn)生和促進纖維蛋白的降解、抗炎、抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基的功效[15-16]。

本研究通過構建高海拔視網(wǎng)膜病變大鼠模型，以中藥紅景天，西藥肌苷片及安慰劑生理水為對照，運用HE染色、免疫組化及電生理觀察復方血栓通膠囊對模擬的高海拔缺氧條件下大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)及功能的影響，以期為高原眼病的防治提供新的依據(jù)。鑒于高海拔視網(wǎng)膜病變大鼠造模階段發(fā)現(xiàn)，模擬海拔5000m入艙10h，大鼠視網(wǎng)膜HE染色顯示視網(wǎng)膜水腫最為明顯，其中以神經(jīng)節(jié)細胞層細胞腫脹及內(nèi)核細胞層間水腫為甚，故我們選擇在模擬海拔5000m入艙10h，觀察復方血栓通膠囊，紅景天及肌苷片對高海拔視網(wǎng)膜病變有無保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，入艙前連續(xù)給藥7d后，復方血栓通、紅景天及肌苷均可減輕視網(wǎng)膜水腫，其中復方血栓通減輕內(nèi)核層細胞水腫程度最低，紅景天減輕神經(jīng)節(jié)細胞層水腫程度最低。紅景天和復方血栓通均可使大鼠神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層HIF-1α表達明顯下降，尤以紅景天更為明顯，而肌苷同安慰劑組相比，HIF-1α在神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層表達無明顯差異，提示紅景天和復方血栓通均可抑制高海拔環(huán)境下HIF-1α的表達，改善視網(wǎng)膜缺血狀態(tài)。F-ERG檢測顯示，預防給予復方血栓通及紅景天進入高原艙后，b波入艙前后振幅差值均遠遠低于預防給予生理鹽水，提示復方血栓通及紅景天對高海拔下大鼠視網(wǎng)膜功能均有保護作用。

我們的研究證實在模擬高海拔環(huán)境下，復方血栓通及紅景天可能是通過抑制HIF-1α的表達對大鼠高海拔視網(wǎng)膜病變有保護作用，但是具體作用機制有待我們進一步研究。