周 強(qiáng)，孫冬偉，李海燕，岳 杰，陳旭輝，曲 波，張麗杰

(1.遼寧省林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，沈陽(yáng)110031；2.撫順市林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 撫順113006；3.遼寧老禿頂子國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)撫順管理站，遼寧 撫順113208；4.沈陽(yáng)市東陵公園管理中心， 沈陽(yáng)110161；5.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)a.生物技術(shù)學(xué)院，b.林學(xué)院/遼寧省林木遺傳育種與培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 沈陽(yáng)110161)

蘭科植物是被子植物分布最廣范的科之一，全世界大約有736 屬28000 種蘭科植物，廣泛分布于大部分陸地生態(tài)系統(tǒng)中[1-2]。我國(guó)野生蘭科植物最為豐富，具有從原始蘭科到高級(jí)蘭科的一系列進(jìn)化群以及復(fù)雜多樣的地理分布類型[3]。蘭科植物在系統(tǒng)演化上作為一類比較特殊的類群，已成為生物學(xué)的研究熱點(diǎn)[4]。據(jù)現(xiàn)有資料表明，蘭科植物多為珍稀瀕危植物，全世界所有野生蘭科植物均已列為《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）的保護(hù)范圍，蘭科植物的保護(hù)也日趨受到國(guó)內(nèi)外研究者的高度重視[5-7]。

雙蕊蘭（Diplandrorchis sinica）是蘭科（Orchidaceae）雙蕊蘭屬（Dipladrorchis）腐生小草本，為我國(guó)特有的單種屬孓遺物種[8]，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)珍稀瀕危植物[9]。 陳心啟[8]提出雙蕊蘭屬是一個(gè)極其原始和在系統(tǒng)發(fā)育上有重要意義的蘭科新屬。 何毅等[10]于2012 年和2013 年連續(xù)兩年在秦嶺和黃土高原對(duì)植被資源進(jìn)行調(diào)查，首次發(fā)現(xiàn)該地區(qū)有雙蕊蘭變異種出現(xiàn)，豐富了對(duì)該珍稀瀕危物種的認(rèn)識(shí)。雙蕊蘭因其具有兩枚生于蕊柱頂端腹背方向的能育雄蕊而得名。 植株具13～17 朵淡綠色或綠白色花；花瓣與唇瓣相似，花藥寬卵狀長(zhǎng)圓形，柱頭頂生，蕊喙不存在，其花被近輻射對(duì)稱；花近直立幾不扭轉(zhuǎn)、柱頭直立且無蕊喙等特征表明其應(yīng)屬于蘭科鳥巢蘭族中最為原始的類群之一[11]。 雙蕊蘭營(yíng)腐生生活，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求非常高，且生活周期短，僅20 余天[12-13]。 雙蕊蘭的分布區(qū)域極其狹窄，繁殖方式及傳粉方式至今未知，極大地限制了雙蕊蘭的種群數(shù)量。 至今，雙蕊蘭瀕危機(jī)制尚不清楚。 稀有和瀕危植物的遺傳學(xué)研究是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究和討論的熱點(diǎn)[14]。 對(duì)稀有或?yàn)l危物種遺傳多樣性進(jìn)行研究，有助于深層次了解物種進(jìn)化歷史及致瀕機(jī)制，便于采取有效的科學(xué)措施進(jìn)一步保護(hù)瀕危物種，這也是保護(hù)生物學(xué)研究的核心[14-15]。物種遺傳變異高低不僅僅與類群的分布范圍有關(guān)而且也與類群的起源、進(jìn)化歷史、生殖特點(diǎn)、生物學(xué)特性以及環(huán)境條件等諸多因素有關(guān)[14-15]。因此，珍稀瀕危植物致瀕機(jī)制的研究就需要建立在對(duì)其物種本身遺傳多樣性和土壤生境微生物多樣性充分了解的基礎(chǔ)上，對(duì)珍稀瀕危物種不僅要保護(hù)其種群數(shù)量，更要保護(hù)其遺傳多樣性和微生物多樣性及進(jìn)化潛力，這樣才能有助于揭示物種瀕危的內(nèi)在機(jī)制。土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的主要分解者，在改良土壤質(zhì)量、促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)過程中具有重要的作用[16]。 這些微生物中細(xì)菌作為主要組成菌種，以其對(duì)環(huán)境變化的敏感性和活躍性成為一個(gè)重要指示指標(biāo)[17]。 土壤根際是一個(gè)特殊的生態(tài)系統(tǒng)，根際土壤易受植物根系的影響，是有益和有害微生物與宿主植物之間發(fā)生復(fù)雜相互作用的一個(gè)微小區(qū)域，在這個(gè)微小區(qū)域中蘊(yùn)含著及其豐富的微生物資源[18]。 在這些微生物資源中，細(xì)菌則是根際土壤中數(shù)量最為豐富、種類最多的微生物類群，有些種類的細(xì)菌可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而有害微生物亦可抑制植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[19-20]。近年來，很多學(xué)者運(yùn)用微生物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)和Miseq 測(cè)序技術(shù)等分子生物學(xué)手段探索土壤微生物和植物生長(zhǎng)之間的互作關(guān)系[19]。 因此，為探明環(huán)境中土壤細(xì)菌與雙蕊蘭生長(zhǎng)的相互關(guān)系，以雙蕊蘭根際土壤為研究對(duì)象，基于Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)瀕危雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4 區(qū)片段進(jìn)行測(cè)序，擬從分子水平揭示雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌群落多樣性，以期為有效保護(hù)雙蕊蘭瀕危植物資源提供科學(xué)借鑒和參考，并為進(jìn)一步探討雙蕊蘭的人工繁殖、仿生境栽培及瀕危機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品于2016 年8 月10 日采自遼寧省老禿頂子自然保護(hù)區(qū)撫順管理局鴻雁護(hù)林防火站（124°41′13″～125°5′15″E，41°11′11″～41°21′34″N），在海拔500～632m 雙蕊蘭保護(hù)區(qū)內(nèi)選取生長(zhǎng)的3 株雙蕊蘭，以雙蕊蘭植株生長(zhǎng)點(diǎn)為中心，取0～20cm 深度的土壤作為根區(qū)土壤。 根際土壤采用抖落法[21]，先抖落根系上附著的大塊土壤，然后輕輕抖落根系或用小鑷子輕觸附著在肉質(zhì)根上的0～4mm 的土壤，收集起來為根際土。 將根際土裝入無菌封口塑料袋中，置于冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即將土壤樣品進(jìn)行混合，混勻后過篩去除雜質(zhì)，均分為4 等份，分別標(biāo)記為T1，T2，T3，T4。 樣品置于-80℃冰箱內(nèi)保存，供土壤微生物指標(biāo)分析使用。

1.2 根際土壤基因組DNA 提取

使用MO BIO Power 土壤DNA 提取試劑盒提取根際土壤總DNA。 具體方法按照試劑盒說明書操作。 然后使用NanoDrop 分光光度計(jì)檢查DNA 濃度和質(zhì)量。 DNA 樣品保存于-40°C 冰箱供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3 PCR 擴(kuò)增

以提取的雙蕊蘭根際土壤基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 細(xì)菌16S rRNA 采用F515：5"-GTGCCAG CMGCCGCGG-3′和R909：5′-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′作為通用引物， 使用Miseq 測(cè)序儀擴(kuò)增16S rRNA 基因的V4 高變區(qū)，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序[22-23]。 PCR 混合物反應(yīng)體系為25μL，包含1x PCR 緩沖液，1.5mM Mg-Cl2，0.4μM 脫氧核苷三磷酸，1.0μM 引物，0.5U ExTaq（TaKaRa）和土壤基因組DNA10ng。 PCR 擴(kuò)增程序包括初始變性。94℃3min，然后進(jìn)行94℃40s，56℃60s 和72℃60s 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行兩次PCR 反應(yīng)， 使用1.0%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳。 使用DNA 凝膠提取試劑盒 （Sangon Biotech SK8132） 回收并純化條帶， 定量后將所有樣品以等摩爾量混合制備測(cè)序樣品。 應(yīng)用于Illumina Miseq 系統(tǒng)Reagent Kit v22×250bp 進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

通過高通量測(cè)序技術(shù)獲得原始數(shù)據(jù)，借助于生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列拼接、過濾，最后獲得高質(zhì)量的Taqs 序列。 基于97%閾值對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行分類單元聚類分析，并采用Mothur 軟件對(duì)細(xì)菌群落多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瀕危雙蕊蘭根際土壤總DNA 提取

使用MO BIO Power 土壤DNA 提取試劑盒提取根際土壤總DNA。 并用分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度和質(zhì)量。 土壤總DNA 質(zhì)量和濃度見表1。 由表1 可知，所獲得的DNA 可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

根據(jù)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，通過對(duì)雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌16S rRNA 的V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，共獲得26690 條原始序列，有效序列26471 條?；凇?7%的相似度水平，利用QIIME 軟件進(jìn)行聚類分析，獲得有效的OTUs 共9556 個(gè)（表2）。 使用稀疏曲線對(duì)雙蕊蘭根際土壤樣品細(xì)菌的Alpha 多樣性指數(shù)（香濃指數(shù)、Chao1 指數(shù)和辛普森指數(shù)）進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，稀釋曲線趨于飽和，證明此次測(cè)序的深度是合理的，繼續(xù)測(cè)序不會(huì)再產(chǎn)生較多新的OTU（圖1）。

表1 雙蕊蘭根際土壤總DNA 質(zhì)量和濃度Table 1 Total DNA quality and concentration in rhizosphere soil of Diplandrorchis sinica

表2 雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌微生物多樣性指數(shù)Table 2 Soil sample sequence and α diversity index in rhizosphere of Diplandrorchis sinica

2.3 雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌多樣性

通過對(duì)雙蕊蘭根際土壤高通量測(cè)序分析，共獲得9556 個(gè)OTUs，分屬于33 門，108 綱，210 目，324 科，472屬。 由圖2a 可知，雙蕊蘭根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群分別為：變形菌門（Protecbacteria）占41.86%；為放線菌門（Actinbacteria）占19.93%；擬桿菌門（Bacteroidetes）占9.57%；酸桿菌門（Acidobacteria）占9.01%；疣微菌門（Verrucomicrobia）占7.67%；浮霉菌門（Planctomycetes）占3.81%；綠彎菌門（Chloroflexi）占2.73%；泉古菌門（Crenarchoeota）占1.92%；其他菌門占3.5%。

由圖2b 可知，相對(duì)豐度在1%以上的15 個(gè)綱所占比例總和達(dá)到86.09%，分別為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria） 占20.39%； 嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）9.76%；β-變形菌綱（Betaproteobacteria）占9.27%；γ-變形菌綱 （Gammaproteobacteria） 占8.13%； 疣微菌綱（Spartobacteria） 占7.43%； 擬桿菌綱 （Saprospirae）占5.67%；放線菌綱（Actinobacteria）占5.99%；鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia） 占2.35%；δ-變 形 菌 綱（Deltaproteobacteria） 占3.86%； 浮霉菌綱 （Planctomycetia）占3.06%；氯酸桿菌（Chloracidobacteria）綱占3.09%；酸微菌綱 （Acidimicrobiia） 占2.52%； 奇古菌綱（Thaumarchaeota）占1.90%；黃桿菌綱（Flavobacteriia）占1.21%，酸桿菌綱（Acidobacteria-6）占1.49%；其他菌綱占13.9%。

由圖2c 可知，在相對(duì)豐度大于1%時(shí)的21 個(gè)目所占比例總數(shù)可以占77.40%。相對(duì)豐度占比較高的9 個(gè)目依次是根瘤菌目（Rhizobiales）占16.68%；蓋勒氏菌目（Gaiellales）占7.01%；紅桿菌目（Chthoniobaceterales）占7.43%；腐螺旋菌目（Saprospirales）占5.67%；放線菌目（Actinomycetales）占5.84%；鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）占2.35%；伯克氏菌目（Burkholderiales）占4.11%；假單胞菌目（Pseudomonadales）占4.63%；酸微菌目（Acidimicrobales）占2.52%；其他菌目占46.28%。

圖1 雙蕊蘭根際土壤高通量測(cè)序稀釋性曲線Figure 1 High-throughput sequencing of soil in rhizosphere of Diplandrorchis sinica

圖2 瀕危物種雙蕊蘭根際細(xì)菌群落豐度分析Figure 2 Abundance analysis of rhizosphere bacteria community of endangered species Diplandrorchis sinica

從細(xì)菌科水平劃分，相對(duì)豐度大于1%的24 個(gè)科所占比例總數(shù)可達(dá)68.98%（圖2d）。 豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌科主要有8 個(gè)科，分別為生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）占7.62%；蓋勒氏菌科（Gaiellaceae）占6.72%；紅桿菌科（Chthoniobacteraceae）占7.43%；噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）占5.62%；慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）占5.11%；鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae）占2.22%；互營(yíng)桿菌科（Syntrophobacteracea）占2.65%；假單胞菌科（Pseudomonadaceae）占4.63%；草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）占2.68%。 其他菌科占55.37%。

從細(xì)菌屬的水平上（圖2e）可知，相對(duì)豐度大于1%時(shí)的16 個(gè)屬所占比例達(dá)到53.69%，相對(duì)豐度較大的有6 個(gè)屬，依次為未分類的蓋氏屬（unclassified Gaiellaceae）占6.715%；紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）占5.07%；慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）占4.69%；鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）占4.69%；假單胞菌屬（Pseudomonas）占4.62%；紫色桿菌屬（Janthinobacterium）占1.95%；其他菌屬占48%；還有一些無法歸類的菌屬占比為27.41%。

3 討論與結(jié)論

雙蕊蘭為腐生小草本，依附群落主要是櫟樹、楊樹和白樺樹為主的天然混交林。 下層被壓木主要有色木槭（A.mono Maxim.）、茶條槭（Ulmus pumila L.）、花曲柳（Fraxinus rhyncophylla）等，地被植物主要有忍冬（Lonicera japonica）、木賊（Equisetum hiemale L.）等。 雙蕊蘭主要生長(zhǎng)在地被物稀少且坡度較緩的半陽(yáng)坡山腹部。 這里土壤腐殖質(zhì)層較厚并有枯落物覆蓋[24]。 雙蕊蘭根際土壤pH 值可達(dá)到6.93，而非根際土壤pH 值僅為5.5，說明雙蕊蘭喜偏中性土壤生長(zhǎng)，這可能也是影響雙蕊蘭生長(zhǎng)的一個(gè)重要原因。 目前，關(guān)于蘭科植物根際細(xì)菌多樣性方面的研究較少，尤其針對(duì)瀕臨滅絕的單種屬物種雙蕊蘭根際微生物多樣性的研究尚未見報(bào)道。 本研究已初步獲得雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌在不同分類水平上的相對(duì)豐度及優(yōu)勢(shì)菌群。 這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群主要涵蓋為八大類，其中變形菌門（Protecbacteria）是第一優(yōu)勢(shì)菌群，所占比例可達(dá)到41.87%；其次為放線菌門（Actinbacteria），占19.93%。 雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬主要是紅游動(dòng)菌屬、慢生根瘤菌屬、鞘氨醇桿菌屬、假單胞菌屬、紫色桿菌屬等。張劍等[25]通過研究大花杓蘭根際土壤細(xì)菌多樣性發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、馬賽菌屬以及分枝桿菌屬等，這與雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌略有差異。 造成這種根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬差異顯著的原因應(yīng)該是與植物營(yíng)養(yǎng)、土壤類型及植物所生長(zhǎng)的環(huán)境和根系分泌物等因素有關(guān)。 已有的一些研究結(jié)果表明，慢生根瘤菌屬、鞘氨醇桿菌屬可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及種子的萌發(fā)[25-26]。 國(guó)內(nèi)很多學(xué)者也已從蘭屬（Cymbidium）、石斛屬（Dendrobium）、斑葉蘭屬（Goodyera）等蘭花品種內(nèi)生細(xì)菌中分離鑒定出假單胞菌和芽孢桿菌為蘭科植物的優(yōu)勢(shì)菌種[27-31]。 但是在雙蕊蘭根際土壤中存在的優(yōu)勢(shì)菌屬是否也具有這些生物學(xué)功能，需要分離出雙蕊蘭根際土或肉質(zhì)根中的相關(guān)菌株才能被證實(shí)。 另外，在瀕危物種雙蕊蘭根際土壤中還存在大量的未確定分類地位的細(xì)菌，這些菌種資源還需充分挖掘和研究，才能從更深層次上揭示其瀕危機(jī)制。在根際土壤微生物中，細(xì)菌有很多種類通過各種復(fù)雜的機(jī)制影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，直接或間接地改變著土壤結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)；同時(shí)，土壤中的一些病原菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物影響著植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[32]。 植物在生長(zhǎng)過程中利用根系從土壤中吸收水分及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)滿足自身生長(zhǎng)[33-35]，并通過根際向土壤中釋放代謝產(chǎn)物影響土壤微生物群落多樣性，通過各種途徑影響根際土壤微環(huán)境。 因此，在土壤中，植物根際、微生物群落之間存在著重要的相互作用，在有限的生存空間中競(jìng)爭(zhēng)著土壤微環(huán)境空間及營(yíng)養(yǎng)資源。 目前，關(guān)于植物與土壤微生物之間的互相影響已愈來愈受到研究者的關(guān)注，但其互作的機(jī)理尚未深入研究，尤其是蘭科植物。BEVER[36]研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落組成與森林植被類型關(guān)系密切，不同的植被類型影響著土壤微生物的組成和活性。 同一環(huán)境植被類型不同土壤微生物群落組成也會(huì)隨著小環(huán)境的變化而不同，對(duì)于某一特定森林生態(tài)系統(tǒng)，環(huán)境因子穩(wěn)定，土壤微生物數(shù)量和活性也會(huì)隨著小環(huán)境的植被群落組成和結(jié)構(gòu)而發(fā)生變化[35-36]。

本研究利用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)珍稀瀕危物種雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，瀕危物種雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌多樣性較為豐富，在門、綱、目、科、屬分類水平上雙蕊蘭根際土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群主要為變形菌門（Protecbacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）、生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）和未被確定分類的蓋氏菌屬。 這些研究結(jié)果首次揭示了瀕危物種雙蕊蘭根際土壤細(xì)菌群落的多樣性，為進(jìn)一步探討雙蕊蘭及其與根際細(xì)菌的相互關(guān)系以及雙蕊蘭的繁殖及瀕危機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。