魏忠平，谷雷嚴，羅 慶，王 輝，馬冬菁，武文昊

（1.遼寧省林業(yè)科學研究院，沈陽110032；2.沈陽大學 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復教育部重點實驗室，沈陽110044；3.遼寧省林業(yè)調查規(guī)劃監(jiān)測院，沈陽110122）

當前，我國重金屬污染物排放總量仍處于高位水平，重金屬污染依然較為嚴重，鎘（Cd）、鉛（Pb）作為重要的金屬資源在工業(yè)生活中被廣泛使用，在造福人類的同時也造成了嚴重的環(huán)境污染[1]。 土壤中的重金屬能夠通過影響植物根系吸收營養(yǎng)元素、 引起植物細胞超微結構的改變以及影響植物光合作用和呼吸作用等嚴重影響植物發(fā)育和作物的產量并通過食物鏈放大最終危害人體健康[2]。 已有研究表明，土壤中Cd、Pb 可能對玉米籽粒中的蛋白質含量造成影響[3]，Pb 污染會抑制辣椒的萌發(fā)[4]。 目前，土壤重金屬污染修復技術主要包括稀釋法、固定/穩(wěn)定化技術[5]、化學還原法[6]、土壤淋洗[7]、電動修復法[8-9]和生物修復法[10]等。 同其他修復技術相比，生物修復法因具有成本低、易操作、生態(tài)友好等優(yōu)點[11]而具有廣闊的應用前景。生物修復還可以進一步細化為植物修復、微生物修復和植物-微生物聯(lián)合修復技術[12]。 雖然在實驗室的理想化條件下微生物修復技術的表現(xiàn)良好[13]，但是具體到實際環(huán)境時，由于干擾因素較多，如溫度、pH 值等，會使該技術受到限制而無法發(fā)揮其優(yōu)勢。 相比之下，植物修復技術對環(huán)境條件有更強的適應性，其抗性強、耐受重金屬濃度高的特點已成為研究熱點[14]。

植物修復技術當前主要存在著修復效率較低、修復周期長的問題。 添加有機酸能夠增加土壤中Cd、Pb 的有效態(tài)含量，提高其生物有效性，進而促進植物對Cd、Pb 的轉運和富集。 研究表明，有機螯合劑（檸檬酸，乙酸，蘋果酸，草酸等）的應用顯著提高了各種植物物種對金屬的吸收[15]。 例如，向土壤中添加乙二胺四乙酸（EDTA）后，其以自由形式進入植物根系，在根系與金屬結合并增強金屬在植物體內的流動性[16]，有效態(tài)Pb 含量顯著提高[17-18]，顯著促進了植物地上部對Pb 的吸收[19]。添加外源檸檬酸對Cd 從根部遷移至地上部具有積極作用[20-21]。外源蘋果酸和乙酸可減少Cd 的植物毒性并增強Cd 在向日葵植物根系中的積累[22]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，東南景天在受到Cd、Pb 脅迫時，根際草酸分泌量較未受脅迫時有顯著增加[23]。 因此，本研究以超富集植物東南景天為研究對象，探討草酸添加對東南景天富集土壤中Cd、Pb 的促進作用，并考察添加草酸對土壤pH 值、有機碳、營養(yǎng)元素等理化性質的影響，以期為提高重金屬污染土壤的植物修復效率提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 盆栽試驗

供試土壤采自遼寧省沈陽市沈北新區(qū)一塊重金屬污染農田，采樣深度為0～20cm。土樣經自然風干后，剔除其中的石塊和動植物殘體，部分大顆粒經碾碎過孔徑為2mm 的標準篩貯存?zhèn)溆?。該土壤樣品的理化性質為：土壤有機質含量為5.44%，陽離子交換量為13.09cmol·kg-1，pH 值7.17，土壤容重1220kg·m-3，粘粒、粉粒和砂粒含量分別為26.11%、72.82%、1.07%，重金屬Cd、Pb 的平均含量分別為0.61mg·kg-1和135.4mg·kg-1。

供試植物富集生態(tài)型東南景天（Sedum alfredii）采集自浙江省衢州市一個古老的鉛鋅礦區(qū)，地理坐標為：東經118°56"，北緯29°17"。

準確稱取3kg 土壤樣品裝入深40cm 的花盆中，加入分析純KH2PO4300mg·kg-1、NH4NO3400mg·kg-1作為基肥，混勻，并加水保持持水量為50%～60%，穩(wěn)定5d 后備用。試驗共設置6 個處理，重復3 次（表1）。東南景天移栽1 個月后（此時東南景天已長出較旺盛根系）施用草酸淋洗劑，東南景天移栽4 個月后收獲。 分別收集東南景天的地上部和根部， 分別收集0～20cm 和20～40cm兩個土層的東南景天根際土。

1.2 土壤及植物樣品中重金屬的測定

將收獲的東南景天于105 ℃烘箱中殺青30min，然后在60℃條件下烘干至恒重，測定干物質量。 用研缽將植物研碎磨細，過0.9mm 篩，使用HNO3/HCl 雙酸法進行電熱板消解，火焰原子吸收分光光度法測定Cd、Pb 濃度[24]。

表1 草酸強化植物修復試驗處理Table 1 Treatments of oxalic acid reinforced phytoremediation

土壤樣品使用HNO3/HCl 雙酸法進行電熱板消解，火焰原子吸收分光光度法測定Cd、Pb 濃度[24]。

1.3 土壤理化性質的測定

土壤pH 值測定采用酸度pH 計法[25]；土壤陽離子交換量測定采用乙酸銨交換法[26]；土壤有機碳測定采用重鉻酸鉀外加熱法[27]；全氮測定采用半微量開氏法[28]；全磷測定采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法[29]；全鉀測定采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法[30]。

1.4 數據處理

所有結果均以均值±標準差表示，使用Origin 9.0(Origin Lab Corporation,Northampton,MA)作圖，采用SPSS 24.0 進行單因素方差分析[最小顯著差數法（LSD），不同字母表示不同處理間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 草酸添加對土壤中Cd、Pb 含量的影響

圖1 是東南景天移栽前和收獲后表層（0～20cm）和底層（20～40cm）土壤中Cd 的含量以及表層和底層土壤中Cd 的消減率和增加率。 由圖1 可知，對照的表層土壤中Cd 含量有一定的減少，這可能是澆水形成的淋濾作用，導致表層土壤中的Cd 進入到底層土壤，但這種由水產生的淋濾作用非常細微。 種植東南景天后，表層土壤中Cd 含量有一個顯著的下降，下降率為21.4%；而底層土壤中Cd 含量卻有一定的增加，增加率為1.6%。 這表明東南景天僅能吸收富集其根際土壤中的Cd，底層土壤遠離其根部，底層土壤中的Cd 未被東南景天吸收富集。底層土壤中Cd 含量的增加，原因與對照相似，可能是由澆水形成的淋濾作用導致。

當施用草酸淋洗液后，表層土壤中的Cd 含量進一步下降，下降率隨著草酸淋洗液濃度的增加而顯著增加，當草酸濃度為50mmol·kg-1土時，下降率達到63.5%。而底層土壤中Cd 含量一直增加，當草酸濃度為50mmol·kg-1土時，底層土壤中Cd 增加量為0.06mg·kg-1，增加率到達10.5%，與20mmol·kg-1土的草酸淋洗液相比，增加率有一個明顯的提高。 這表明草酸的添加能顯著提升東南景天的修復效率，但當草酸添加濃度過大時，草酸活化的Cd 過量，而東南景天吸收富集Cd 的速率一定，多余的Cd 就會通過淋濾作用進入到下層土壤，對下層土壤造成污染。 因此，應選擇既能夠促進東南景天的修復效率、又能夠不形成淋濾作用對下層土壤造成污染的合適的草酸添加濃度。 本試驗表明，草酸的添加量為20mmol·kg-1土時，可滿足該要求。

圖1 表層和底層土壤Cd 含量Figure 1 The content of Cd in top and bottom soil

圖2 是東南景天移栽前和收獲后表層和底層土壤中Pb 的含量以及表層和底層土壤中Pb 的削減率和增加率。 由圖2 可知，土壤中Pb 的變化趨勢與Cd 的變化趨勢相似。 種植東南景天能顯著降低表層土壤中Pb 的含量，草酸能顯著促進東南景天對Pb 的修復效率。 草酸添加的濃度越高，表層土壤中Pb 含量降低的越多。 由于淋濾作用，底層土壤中的Pb 含量一直呈增加趨勢，當草酸濃度增加到50mmol·kg-1土時，底層土壤中Pb 增加量為20mg·kg-1，增加率達到14.8%，與20mmol·kg-1土時的3.6%相比，增加率有一個明顯的提高。 這也表明草酸的添加能顯著增加東南景天的修復效率，但當草酸添加濃度過大時，草酸活化的Pb 過量，而東南景天吸收富集Pb 的速率一定，多余的Pb 就會通過淋濾作用進入到下層土壤，對下層土壤造成污染。 因此，本研究選擇草酸的添加量為20mmol·kg-1土。

圖2 表層和底層土壤Pb 含量Figure 2 The content of Pb in top and bottom soil

2.2 草酸添加對東南景天中Cd、Pb 含量的影響

由圖3 可知，施用草酸淋洗液后，東南景天地上部和根中Cd、Pb 含量均增加，并且隨著草酸淋洗液濃度的增加而顯著增加， 這表明草酸能夠促進東南景天對重金屬Cd、Pb 的吸收富集。 但是， 當草酸淋洗液濃度從20mmol·kg-1土增加到50mmol·kg-1土時，東南景天地上部和根中Cd、Pb 含量差異不顯著，這表明東南景天對Cd、Pb 的吸收富集趨于飽和。

不同深度土壤中Cd、Pb 含量的變化情況和東南景天中Cd、Pb 含量的變化情況均表明，草酸能夠促進東南景天對土壤中Cd、Pb 的吸收富集，但過量的草酸會導致表層土壤中的Cd、Pb 向下層土壤遷移，污染下層土壤。因此， 選擇20mmol·kg-1土的草酸添加濃度較為合適， 既可最大限度促進東南景天對土壤中Cd、Pb 的吸收富集，又能確保表層土壤中的Cd、Pb 不向下層遷移。

圖3 東南景天Cd、Pb 含量Figure 3 The content of Pb and Cd in S.alfredii

2.3 草酸添加對土壤理化性質的影響

為評估草酸添加對土壤理化性質、土壤質量的影響，本研究分析了6 個處理條件下土壤pH 值、土壤有機碳含量以及土壤營養(yǎng)元素全氮、全磷和全鉀的含量。 由圖4 可知，當草酸添加量較少時，土壤pH 值的變化較小，可忽略。 當草酸添加量增加到50mmol·kg-1土時，土壤pH 值從7.17 降至7.02，對土壤表現(xiàn)出一定的酸化作用。 種植東南景天后，土壤的有機碳含量有一定程度的增加，增加量約為0.2%，這可能是東南景天根系分泌物以及根系在土壤中的殘留，使得土壤有機碳含量增加。 添加草酸與未添加草酸種植東南景天相比，土壤有機碳含量變化較小，表明草酸的添加對土壤有機碳含量沒有影響。 與對照相比，種植東南景天降低了土壤營養(yǎng)元素全氮、全磷和全鉀的含量，降低量分別為0.16，0.11 和0.26g·kg-1，這可能是東南景天在生長過程中對土壤中營養(yǎng)元素的攝取，使得土壤中營養(yǎng)元素氮磷鉀的減少。添加草酸與未添加草酸種植東南景天相比，土壤中全氮、全磷和全鉀的含量變化較小，這表明草酸的添加對土壤中營養(yǎng)元素全氮、全磷和全鉀的含量沒有影響。

圖4 表層土壤的pH 值，有機碳和全氮、全磷、全鉀含量Figure 4 The pH, the content of organic carbon and N, P and K in topsoil

3 討論與結論

植物對金屬的吸收富集包括金屬在土壤中的解吸、可溶性重金屬通過擴散或質量流遷移至根系表面、根對金屬的吸收和向地上部轉移等一系列過程。 東南景天主要通過共質體運輸完成對土壤中Cd 的根部吸收、木質部裝載、轉運至地上部[31]。 外源小分子有機酸的添加會導致東南景天根際的pH 值降低，與金屬離子絡合，從而影響土壤對金屬離子的吸附和植株對金屬離子的吸收[32]。 已有研究表明，草酸施加量與土壤中可交換態(tài)Cd 呈顯著正相關，添加草酸后，重金屬離子被活化,可交換態(tài)重金屬含量增加，同時提高了重金屬在土壤溶液中移動性,使根系能有更多的機會與重金屬接觸，加速了其向木質部的轉運，相較于對照組可以看到表層土壤內的Cd和Pb 濃度有一個顯著的下降，說明草酸對東南景天吸收富集Pb 和Cd 有顯著的促進作用[33]。 LI 等[34]在試驗中觀察到在1.5mmol·L-1檸檬酸和3mmol·L-1草酸處理下，苧麻根部對Cd 的吸附分別提高1.3 倍和1.2 倍，地上部Cd 均增加2 倍。 這與本研究結果基本一致。

Cd 和Pb 在東南景天地上部和地下部的分布存在差異，表現(xiàn)在植物地上部Cd 濃度遠高于地下部，Pb 濃度地下部高于地上部，這與之前的研究一致[35-37]，即植物各部對Cd 的富集能力：葉＞莖＞根；對Pb 的富集能力：根＞莖＞葉。 有研究表明，東南景天根部Pb、Cd 都主要分布于根尖分生組織和中柱里[38]，隨著與根面距離的增加,土壤有效態(tài)Cd、Pb 的含量表現(xiàn)出升高的趨勢[39]。植物葉片中部Cd 在維管組織和上皮層含量較高，Pb 主要積累在葉脈中，其次則是表皮；在植物莖部90%以上的Pb 積累于維管束中[20]。 LI 等[34]推測了Cd 在植物體內的分布過程：pH 值的增加以及有機酸中強有機配體的釋放進入植物-溶液界面，增加了Cd 的溶解度和有效性，促進了Cd 被苧麻根系吸收并轉移到莖部；質膜中的ATP 酶被激活，導致負責金屬轉運的離子發(fā)生改變所以轉移因子增加；有機酸螯合重金屬有效參與植物木質部金屬離子遠距離轉運，避免了游離金屬離子毒性；螯合-金屬復合體可能通過破壞根內皮層和卡氏帶進入植物組織，隨后在蒸騰作用的協(xié)助下向上遷移到地上部。

韓洋等[43]的研究表明，添加少量草酸并不會對土壤pH 值產生影響，這與本研究結果一致。通過比較空白樣本可以看出，種植東南景天后土壤氮磷鉀含量有少許下降，氮、磷、鉀被視為植物合成自身所需蛋白質、葉綠素和酶以及影響自身代謝的重要物質，對植物完成自身生理活動起關鍵作用。 植物對Cd 的吸收是一個能量依賴的活性過程，因此可能存在添加草酸之后東南景天加速吸收重金屬導致植物自身能量消耗速度加快，從而導致土壤中氮、磷、鉀含量的下降，但是目前來看這種影響十分微小[31]。雖然有研究表明，乙酸、檸檬酸等有機酸對土壤的淋洗可通過溶解土壤中原有氧化物、碳酸鹽和有機質等造成土壤物理化學性質的改變[40-42]，但是本研究的結果表明，草酸的添加對土壤理化性質的影響微小，通過顯著性差異分析可以看出添加草酸前后土壤理化性質并無顯著變化。 其原因可能是土壤淋洗是短時間、瞬時的，沒有考慮土壤本身具有強大的緩沖能力和自凈能力。

總的來看，添加草酸能夠顯著提高東南景天對Cd 和Pb 污染土壤的修復效率，草酸添加量為20mmol·kg-1土時最為合適，在這一條件下既能顯著促進東南景天吸收富集表層土壤中的Cd 和Pb，又不會因過量活化Cd、Pb 使其通過淋濾作用向下遷移污染底層土壤。 本研究結果還表明，添加草酸不會對土壤Ph 值、有機碳和氮磷鉀含量造成明顯的影響。