張?zhí)m香，詹雨娟，李夢珠，王 嚴(yán)，李心玫，褚凌渺，孫恩濤

(皖南醫(yī)學(xué)院 衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

粉螨隸屬于蜱螨亞綱(Acari)、真螨總目(Acariformes)、無氣門亞目(Astigmata)。粉螨種類繁多,是重要的致敏原,可導(dǎo)致螨性過敏性疾病[1]。不同粉螨所含致敏原不同,因此,粉螨的準(zhǔn)確鑒定可為臨床藥物和免疫治療提供基礎(chǔ)資料[2]。螨類鑒定主要依據(jù)成螨形態(tài),然而粉螨個(gè)體微小、生境復(fù)雜等現(xiàn)象難以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定[3]。

自2003年Hebert等[4]提出DNA條形碼概念,DNA條形碼廣泛應(yīng)用于物種鑒定[5-6]。目前,常用于螨類鑒定的分子標(biāo)記主要包括線粒體基因和核基因[5-7]。線粒體COI基因具有較快的進(jìn)化速率、明顯的種間差異、較低的種內(nèi)變異等特性,因而常用于探討近緣種、地理種群等低級(jí)階元的鑒定[7-9]。Webster等[8]基于377 bpCOI基因中央?yún)^(qū)段鑒定粗腳粉螨(Acarussiro)及其近緣種小粗腳粉螨(A.farris)和靜粉螨(A.immobilis)；吳太葆[9]基于該中央?yún)^(qū)段研究不同地理種群的橢圓食粉螨(Aleuroglyphusovatus)和腐食酪螨(T.putrescentiae),未發(fā)現(xiàn)不同地理種群間該中央?yún)^(qū)段序列存在差異。

研究表明,COI基因不同區(qū)段的進(jìn)化速率差異會(huì)影響DNA條形碼的鑒定[6,10]。Yang等[11]應(yīng)用377bpCOI基因中央?yún)^(qū)段對(duì)粉螨進(jìn)行物種鑒定,未擴(kuò)增到熱帶無爪螨(Blomiatropicalis)的目的片段,且不同螨種所需退火溫度差異較大；Khaing等[12]基于該中央?yún)^(qū)段的系統(tǒng)樹表明建樹結(jié)果不符合形態(tài)學(xué)分類,且部分粉螨的分類置信度較低。因此，僅基于377bpCOI基因中央?yún)^(qū)段對(duì)粉螨進(jìn)行分類鑒定有一定局限性。

線粒體DNA的661 bpCOI基因5′端區(qū)段[13]被廣泛用于癢螨、蠕形螨等螨類的物種鑒定[5-6]。目前尚未報(bào)道該基因區(qū)段對(duì)于粉螨的物種鑒定。因此,本研究探討661 bpCOI基因5′端區(qū)段是否適合常見儲(chǔ)藏物粉螨的物種鑒定,為構(gòu)建粉螨DNA條形碼數(shù)據(jù)庫提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集、分離和形態(tài)鑒定 本研究樣本采集于2019年5～7月安徽省部分地區(qū)的儲(chǔ)藏物中(表1)。從樣本中挑取單個(gè)成螨，進(jìn)行純培養(yǎng)。從培養(yǎng)標(biāo)本中挑取成螨制成玻片標(biāo)本，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定[14]。另取成螨于70%乙醇溶液固定，存放于-20℃，備DNA提取。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增、克隆和測序 參照文獻(xiàn)[15]提取單只螨基因組DNA。擴(kuò)增引物為COI基因5′端區(qū)段[13]：LOC1490 5′-TTTTCTACHAAYCATAAAGATATTGC-3′，HCO2198 5′-TATAAACYTCDGGATGNCCAAAAAA-3′，經(jīng)PCR擴(kuò)增、克隆測序后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 序列分析 所獲序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)合GenBank已知12條粉螨COI基因5′端序列，用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，基于MEGA X軟件[16]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以粒形硬蜱(lxodes granulatus)作為外群，構(gòu)建Maximum Likelihood(ML)系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 本次采集的粉螨隸屬于5科6屬7種,表中基因序列號(hào)均來自本實(shí)驗(yàn)的PCR測序剪切上傳至Genbank，見表1。

表1 粉螨采集信息及基因序列號(hào)

2.2 分子鑒定 共獲77條661 bp的粉螨COI基因序列，其中單倍型29條序列，并將序列上傳至GenBank(表1)。所獲序列經(jīng)Blast比對(duì)顯示，表2中5種粉螨分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致；由于GenBank缺少拱殖嗜渣螨和納氏皺皮螨相關(guān)序列，因此未能準(zhǔn)確比對(duì)結(jié)果。

表2 獲得序列在GenBank中Blast比對(duì)結(jié)果

2.3 堿基組成和變異位點(diǎn) 7種粉螨COI基因單倍型序列29條，結(jié)合GenBank已知12條粉螨COI基因序列(表3)。對(duì)10種粉螨的COI基因序列堿基組成分析可知，COI片段具有A/T含量偏向性。依據(jù)不同地理種群變異位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示種內(nèi)變異位點(diǎn)小于種間。10種粉螨共檢測到261個(gè)變異位點(diǎn)，400個(gè)保守位點(diǎn)，247個(gè)簡約信息位點(diǎn)。

表3 GenBank中粉螨COI基因序列

2.4 遺傳距離 依據(jù)不同地理種群遺傳距離分析結(jié)果見表4。種內(nèi)遺傳距離小于種間，種間遺傳距離大于種內(nèi)10倍以上。

表4 10種粉螨的遺傳距離分析

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹 基于線粒體COI基因5′端區(qū)段，以粒形硬蜱(lxodesgranulatus)作為外群，使用MEGA X軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。7種不同種屬粉螨均能獨(dú)立聚為一支，且支持率均達(dá)100%，與形態(tài)學(xué)分類一致。

*為本研究所獲得的序列。

3 討論

粉螨形態(tài)學(xué)鑒定容易受到螨體微小、形態(tài)不完整及環(huán)境變異等限制[3]，DNA分子標(biāo)記可有效彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足[8]，常用于粉螨鑒定的線粒體COI基因具有適宜的進(jìn)化速率，廣泛用于親緣關(guān)系較近的粉螨物種鑒定[7-9]。研究表明，基于377 bpCOI基因中央?yún)^(qū)段[11-12]探究粉螨種屬關(guān)系尚存在一定限制。

本研究基于661 bpCOI基因5′端區(qū)段進(jìn)行7種常見儲(chǔ)藏物粉螨的物種鑒定，通過堿基組成分析，均存在A/T偏向性；進(jìn)行變異位點(diǎn)和遺傳距離分析，同種粉螨不同地理種群間序列差異較小，遺傳距離均小于2%，說明661 bpCOI基因5′端區(qū)段不受地理種群影響；種內(nèi)序列差異小于種間，種間遺傳距離與種內(nèi)之比大于10倍以上，符合Hebert等[4]提出的物種鑒定有效標(biāo)準(zhǔn)。說明該基因區(qū)段能較好地區(qū)別種屬關(guān)系；同時(shí)結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，7種不同種屬粉螨均能獨(dú)立聚為一支，與形態(tài)學(xué)鑒定一致。提示該基因5′端區(qū)段可用于7種常見儲(chǔ)藏物粉螨的物種鑒定。

本研究首次提交了納氏皺皮螨和拱殖嗜渣螨的661 bpCOI基因5′端區(qū)段序列，由于GenBank缺乏其相關(guān)序列信息，因此沒有準(zhǔn)確的比對(duì)結(jié)果。表明DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定受數(shù)據(jù)庫中信息不全的限制，亟待盡可能全地收集不同種類及地理種群的粉螨，完善661 bpCOI基因5′端區(qū)段的數(shù)據(jù)庫，為構(gòu)建DNA條形碼數(shù)據(jù)庫提供基礎(chǔ)資料。