寧金卓，卓 棟，程 帆

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院 泌尿外科，湖北 武漢 430000；2皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 泌尿外科，安徽 蕪湖 241000)

睪丸扭轉(zhuǎn)是青少年期和青春期常見的泌尿外科急癥之一，其基本病理生理過程是扭轉(zhuǎn)的精索使睪丸的血供減少或中斷，導(dǎo)致組織發(fā)生缺血、壞死[1-2]。一旦確診，應(yīng)盡快恢復(fù)睪丸的血流供應(yīng)，以防止睪丸生精細(xì)胞的損傷[3-4]。睪丸扭轉(zhuǎn)引起的缺血損傷和睪丸復(fù)位引起的再灌注損傷均可造成睪丸組織生化和形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)一步導(dǎo)致生精功能的破壞，甚至不育[5]。研究證實長鏈非編碼RNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(long non-coding RNA metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript1,lncRNA MALAT1)可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在多種系統(tǒng)和器官的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)過程中發(fā)揮作用，但I(xiàn)ncRNA MALAT1對睪丸IRI的作用及其機(jī)制尚未見報道。本研究以睪丸生精細(xì)胞GC-1為研究對象，探討IncRNA MALAT1在睪丸IRI過程中的作用，為睪丸扭轉(zhuǎn)發(fā)病機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及器材 小鼠睪丸精原細(xì)胞GC-1,美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清,美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000及Trizol試劑,美國Invitrogen公司；MTT檢測試劑盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒，美國Biovision公司；RNA快速提取試劑盒,廣州威佳科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green real time PCR試劑,Takara 生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)精原細(xì)胞GC-1，培養(yǎng)條件為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2。細(xì)胞傳代培養(yǎng)后給予缺氧3h環(huán)境后，復(fù)氧24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。實驗組轉(zhuǎn)染IncRNA MALAT1和Si-MALAT1，對照組轉(zhuǎn)染空白的NC和Si-NC。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中IncRNA MALAT1和miR-214的表達(dá) TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，檢測IncRNA MALAT1和miR-214的表達(dá)。相應(yīng)引物擴(kuò)增的序列IncRNA MALAT1為F:5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，R:5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′;miR-214為F:5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3′，R:5′-CAGACGAGGCTCCGTGGT-3′;GAPDH為F:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,R:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′;U6為F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，R:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。采用2-△△Ct法計算IncRNA MALAT1和miR-214的相對表達(dá)量。

1.4 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞增殖抑制的檢測采用MTT比色法，將成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后形成游離細(xì)胞后接種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。20 mL MTT溶液于37℃孵育4 h后棄去上清液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，混勻后于490 nm處檢測光密度(OD)值。

1.5 AnnexinV-FITC/PI法測定細(xì)胞凋亡 以等量DMSO為對照組，隨后每孔加入1 mL培養(yǎng)基混勻后離心棄上清，收集細(xì)胞。無菌的PBS液漂洗并離心2次，500 μL PBS重懸后加入預(yù)冷的70%乙醇，在4℃冰箱留置過夜；次日加入1 mL PBS緩沖液吹打混勻，離心棄上清兩次后向EP管加入300 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL RNaseA(10mg/mL)，在37℃下靜置1 h。最后加入700 μL 50 mg/mL的碘化丙啶(PI)，染色后進(jìn)樣流式細(xì)胞儀，觀察細(xì)胞凋亡變化。

1.6 Western blot實驗檢測caspase-3和cytc蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，混勻后置于冰上(4℃)裂解30 min，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。用PVDF膜轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入caspase-3及cytc抗體,放置于4℃孵育過夜。采用羊抗鼠的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST液洗滌3次，每次10 min，在暗室中滴加超敏化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)曝光顯影。

1.7 熒光素酶報告實驗 利用生物信息預(yù)測軟件預(yù)測IncRNA MALAT1和miR-214的結(jié)合片段，用RT-PCR擴(kuò)增IncRNA MALAT1上兩者的結(jié)合片段，將合成IncRNA MALAT1片段插入到pMIR-Report Luciferase中，構(gòu)建IncRNA MALAT1熒光素酶報告載體，將上述熒光素酶報告載體及突變載體共同轉(zhuǎn)染至GC-1細(xì)胞,檢測IncRNA MALAT1與miR-214的直接結(jié)合關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MALAT1和miR-214在不同復(fù)氧損傷時間的表達(dá)水平 本實驗采用qRT-PCR方法檢測GC-1細(xì)胞不同復(fù)氧損傷時間點IncRNA MALAT1和miR-214的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著復(fù)氧損傷時間的增加，IncRNA MALAT1表達(dá)增高(P<0.05)，尤其以缺氧3 h/復(fù)氧24 h細(xì)胞上調(diào)最為明顯；而miR-214的表達(dá)降低(P<0.05)(圖1A、1B)；相關(guān)分析顯示，GC-1細(xì)胞中IncRNA MALAT1與miR-214的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖1C)。因此，本實驗選擇缺氧3 h/復(fù)氧24 h時間點用于后續(xù)的IncRNA MALAT1功能研究。

A.IncRNA MALAT1在不同復(fù)氧損傷時間GC-1細(xì)胞株中的表達(dá)情況(F=37.692，P=0.000)；B.miR-214在不同復(fù)氧損傷時間GC-1細(xì)胞株中的表達(dá)情況(F=67.814，P=0.000)；C.相關(guān)分析結(jié)果顯示GC-1細(xì)胞株中IncRNA MALAT1與miR-214的表達(dá)相關(guān)性。與正常組比較，*P<0.05。

2.2 轉(zhuǎn)染lncRNA MALAT1對GC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響 通過qRT-PCR實驗檢測IncRNA MALAT1轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，過表達(dá)IncRNA MALAT1高于其對照組(P<0.05)，而沉默IncRNA MALAT1低于其對照組(P<0.05)(圖2A);MTT法檢測GC-1細(xì)胞增殖能力的變化。過表達(dá)IncRNA MALAT1使GC-1細(xì)胞的增殖能力下降(P<0.05),沉默IncRNA MALAT1使GC-1細(xì)胞的增殖能力增強(P<0.05)(圖2B)；運用流式細(xì)胞術(shù)測定GC-1細(xì)胞凋亡水平的改變。過表達(dá)IncRNA MALAT1使GC-1細(xì)胞的凋亡能力增強(P<0.05)，沉默IncRNA MALAT1使GC-1細(xì)胞的凋亡能力被抑制(P<0.05)(圖2C、2D)；Western blot法檢測轉(zhuǎn)染IncRNA MALAT1后GC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3和cytc蛋白水平的變化。過表達(dá)IncRNA MALAT1使caspase-3和cytc表達(dá)增加(P<0.05),沉默IncRNA MALAT1后使caspase-3和cytc表達(dá)減少(P<0.05)(圖2E～2G)。

A.過表達(dá)IncRNA MALAT1和沉默IncRNA MALAT1后IncRNA MALAT1的表達(dá)情況(F=111.300，P=0.000)；B.轉(zhuǎn)染IncRNA MALAT1對GC-1細(xì)胞增殖能力的影響(F=208.200，P=0.000)；C、D.轉(zhuǎn)染IncRNA MALAT1對GC-1細(xì)胞凋亡能力的影響(F=35.440，P=0.000)；E～G.轉(zhuǎn)染IncRNA MALAT1對GC-1細(xì)胞caspase-3和cytc蛋白水平的影響(F=46.720,P=0.000;F=38.210,P=0.000)。與各自對照組比較，*P<0.05。

2.3 lncRNA MALAT1靶向調(diào)控GC-1細(xì)胞miR-214的表達(dá) 生物信息學(xué)預(yù)測顯示，IncRNA MALAT1序列中含有一段與miR-214互補結(jié)合序列(圖3A)；本研究進(jìn)一步構(gòu)建了IncRNA MALAT1-Wt(野生型)以及結(jié)合位點序列突變IncRNA MALAT1-Mut的熒光素酶報告載體，與pri-miR-214或pri-miR-214 ctrl共轉(zhuǎn)染GC-1細(xì)胞觀察熒光索酶活性。結(jié)果顯示，miR-214共轉(zhuǎn)染的GC-1細(xì)胞中，IncRNA MALAT1-Wt表達(dá)水平降低(t=-7.056，P=0.002)，而MALAT1-Mut(突變型)相對熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.153，P=0.886)(圖3B)；qRT-PCR實驗顯示,與對照組比較，過表達(dá)IncRNA MALAT1能抑制GC-1細(xì)胞miR-214表達(dá)(P<0.05),沉默IncRNA MALAT1能促進(jìn)GC-1細(xì)胞miR-214表達(dá)(P<0.05)(圖3C)。

A.生物信息學(xué)預(yù)測的IncRNA MALAT1-miR-214結(jié)合位點序列及其突變序列；B.熒光素酶報告載體試驗檢測IncRNA MALAT1-Wt和IncRNA MALAT1-Mut與pri-miR-214或pri-miR-214 ctrl共轉(zhuǎn)染GC-1細(xì)胞的熒光素酶活性。與pri-miR-214 ctrl組比較，*P<0.05；C.轉(zhuǎn)染IncRNA MALAT1對GC-1細(xì)胞miR-214水平的影響(F=42.160，P=0.000)。與各自對照組比較，*P<0.05。

3 討論

lncRNA是一類長度超過200核苷酸單位，在真核細(xì)胞基因組被普遍轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA分子。其多位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，通常由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ)轉(zhuǎn)錄生成[6-7]。研究已證實，lncRNA可通過多個層面調(diào)控基因的表達(dá)，在生物體生長、發(fā)育、衰老及死亡等過程中發(fā)揮重要的功能[8-10]。據(jù)研究報道，lncRNA在多種器官的IRI過程中發(fā)揮調(diào)控作用，UCA1在心臟IRI通過靶向p27的表達(dá)，發(fā)揮凋亡調(diào)控作用[11]；N1LR在腦IRI中可負(fù)調(diào)節(jié)Nck1基因的表達(dá)，減少腦神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)增殖[12]；lncRNA AK139328在肝臟IRI中高表達(dá)，沉默AK139328可通過激活A(yù)kt信號通路，從而抑制NF-kB和caspase-3的活性，發(fā)揮抗凋亡以及抗炎作用[13]。

MALAT1又被稱為核富集常染色體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2(nucleraenriched autosomal transcript 2，NEAT2)，定位于11q13.1染色體上，全長約8 000 nt，是一種主要在核內(nèi)表達(dá)、長度為8 kb且高度保守的、缺乏明確的開放式閱讀框的ncRNA[14]。研究發(fā)現(xiàn)，IncRNA MALAT1在心臟和腦IRI過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控功能。Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IncRNA MALAT1可通過miR-145/Bnip3通路調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的凋亡；Li等[16]研究報道IncRNA MALAT1在腦IRI過程中，可減少腦血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究首先建立不同復(fù)氧損傷時間點的生精細(xì)胞GC-1模型，發(fā)現(xiàn)IncRNA MALAT1在復(fù)氧損傷后表達(dá)增高，而miR-214表達(dá)降低。為了明確IncRNA MALAT1在睪丸IRI中的生物學(xué)功能，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IncRNA MALAT1可使GC-1細(xì)胞增殖能力降低，凋亡水平增加；而沉默IncRNA MALAT1可使GC-1細(xì)胞增殖能力增強，凋亡水平減弱，提示IncRNA MALAT1可能參與了睪丸IRI的發(fā)生及發(fā)展過程。為進(jìn)一步探討IncRNA MALAT1在睪丸IRI過程中的影響機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)IncRNA MALAT1序列上存在連續(xù)的miR-214結(jié)合位點，且過表達(dá)IncRNA MALAT1能抑制生精細(xì)胞GC-1中miR-214的表達(dá)；而沉默IncRNA MALAT1后，miR-214表達(dá)水平增加，提示IncRNA MALAT1與miR-214在睪丸IRI過程中的靶向調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，本研究闡明了IncRNA MALAT1在睪丸IRI生物學(xué)行為中所發(fā)揮的重要作用，進(jìn)一步揭示了IncRNA MALAT1分子可通過競爭性吸附miR-214來調(diào)控睪丸IRI過程中增殖和凋亡的能力，這將為睪丸IRI發(fā)病機(jī)制的探索提供新的思路及發(fā)展方向。