劉 俊,盛 斌,陳 銘,張卿云
(皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科,安徽 蕪湖 241000;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 神經(jīng)外科,上海 200092;3.馬鞍山市中心醫(yī)院 神經(jīng)外科,安徽 馬鞍山 243000)
神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率占原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的第一位。神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者即使接受了放療和化療的輔助治療,但療效仍不理想[1]。最近發(fā)現(xiàn),人轉(zhuǎn)酮醇酶樣蛋白1(transketolase like protein 1,TKTL-1)基因的異常激活在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起重要作用[2-3]。TKTL-1的高表達(dá)可能促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生。癌細(xì)胞需要足夠的能量來使其快速生長。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的代謝途徑,稱為Warburg效應(yīng),其特征是在正常的氧氣供應(yīng)下,葡萄糖在癌細(xì)胞作用下可以發(fā)生糖酵解反應(yīng)。此外,磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)的主要功能是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為核糖以合成核酸,轉(zhuǎn)酮酶(transketolase,TK)系這一途徑的關(guān)鍵酶。最近,有研究發(fā)現(xiàn)一些新型轉(zhuǎn)酮醇酶如TKTL-1基因在許多惡性腫瘤中高表達(dá),與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。TKTL-1表達(dá)的增加可促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。然而,TKTL-1促進(jìn)腫瘤增殖侵襲的潛在機(jī)制仍不清楚[4]。
1.1 樣本 采集2012年2月~2019年8月皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、上海新華醫(yī)院、馬鞍山市中心醫(yī)院神經(jīng)外科共65例原發(fā)性星形細(xì)胞瘤速凍標(biāo)本。其中10例為毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤,12例為彌漫性星形細(xì)胞瘤,17例為間變性星形細(xì)胞瘤,26例為多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。從接受尸檢的患者中收集5份正常腦組織樣本作為對(duì)照。病理診斷根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2007年制定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。經(jīng)三所醫(yī)院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽訂知情同意書。為了便于分析,將神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本分為低級(jí)別(WHO Ⅰ和Ⅱ級(jí))組和高級(jí)別(WHO Ⅲ和Ⅳ級(jí))組。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑 將U87、U251人膠母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(來自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所)在5%CO2的潮濕環(huán)境下使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。HAc細(xì)胞作為對(duì)照。
1.3 免疫組織化學(xué) 兔抗人TKTL-1多克隆抗體(1∶400,產(chǎn)品編號(hào):ab155662,Abcam Trade Co.Ltd,上海);PV-9000兩步免疫組化測(cè)試試劑盒(中國杉木公司,北京)。磷酸鹽緩沖液(PBS)用作陰性對(duì)照,陽性切片用作陽性對(duì)照。
1.4 免疫組織化學(xué)評(píng)估 使用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同病理等級(jí)的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的TKTL-1蛋白。
1.5 細(xì)胞免疫組織化學(xué) TKTL-1蛋白可視化處理(綠色),抗TKTL-1抗體和二抗(紅色)顯示細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記(藍(lán)色)。放大1 000倍對(duì)照處理。
1.6 免疫印跡 分別從標(biāo)本和細(xì)胞系制備組織切片裂解物和蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上分離。抗TKTL-1(CalBioreagents,M214)和β-肌動(dòng)蛋白抗體(Sigma-Aldrich,上海)4°C下過夜孵育,二抗在含有2%BSA的PBS-T中室溫孵育30 min。通過ImageJ軟件(NIH,美國)進(jìn)行信號(hào)定量分析。
1.7 RNA制備和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用RNeasy提取試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)從70個(gè)組織樣品中分離出總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG試劑盒(Invitrogen)在Rotor-Gene 3000實(shí)時(shí)機(jī)器(澳大利亞Corbett Research)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-actin用作標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)源對(duì)照。使用解鏈曲線分析驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。通過2-△△T公式計(jì)算方法進(jìn)行TKTL-1mRNA表達(dá)的計(jì)量分析。所有結(jié)果均至少進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
1.8 RNA干擾及慢病毒載體的制備 對(duì)應(yīng)于TKTL-1的SiRNA干擾靶序列選自基因庫序號(hào)BC025382(GCAGTCAGATCCAGAGAAT,GTTGGCATGCAAAGCCAAT和CAACAGAGTCGTTGTGCTG)。將寡核苷酸插入pGCSIL-GFP慢病毒載體(美國,Invitrogen)。對(duì)U87和U251細(xì)胞系進(jìn)行高感染率評(píng)估和確認(rèn)。使用SiRNA干擾序列作為陰性對(duì)照。
1.9 免疫熒光 將用TKTL-1過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的LM-MEL-44孵育72 h,4%多聚甲醛固定,用抗TKTL-1兔多克隆抗體(ab87187,Abcam)染色,將其以3 μg/mL濃度4℃下過夜,再在室溫下用Alexa flour 555染料結(jié)合二抗染色45 min(Molecular probes,USA)。DAPI將細(xì)胞反向染色10 min。
1.10 克隆形成試驗(yàn) 用以評(píng)估單個(gè)腫瘤細(xì)胞形成集落的能力,在六孔板中制備0.8%瓊脂培養(yǎng)基的底層。將受SiRNA干擾TKTL-1靶基因(RNA干擾組)或TKTL-1靶基因空白對(duì)照組感染的U251和U87細(xì)胞消化,離心,重懸于0.4%瓊脂培養(yǎng)基中,鋪在瓊脂最底層。在37℃下生長14 d。使用Giemsa染色法觀察菌落,在顯微鏡下計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)以對(duì)照組的百分比匯總。
1.11 體外細(xì)胞遷移和侵襲分析 將被TKTL-1 OE或TKTL-1 Scr感染后呈對(duì)數(shù)周期生長的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化重懸后制成單細(xì)胞懸液。將含有1×105個(gè)細(xì)胞的0.5 mL的無血清DMEM或EMEM接種到8 μm孔隙聚碳酸酯膜上,再插入到具有基質(zhì)凝膠涂層的Transwell裝置(Costar,Cambridge,MA)中。將含有10%胎牛血清的600μL DMEM或EMEM加入下層。細(xì)胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育12~24 h后,棉簽擦拭去除頂層的細(xì)胞。遷移到底面的細(xì)胞在100%甲醇中固定2 min,用0.5%結(jié)晶紫染色2 min,PBS漂洗,顯微鏡下放大200倍觀察和計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
1.12 流式細(xì)胞儀分析 用以評(píng)估細(xì)胞周期分布。將5×105個(gè)細(xì)胞接種在100 mm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)基加入10%胎牛血清,過夜生長。將細(xì)胞用SiTKTL-1或?qū)φ詹《靖腥?天。隨后,將培養(yǎng)基替換為無血清培養(yǎng)基24 h,并用10 mg/mL的銅藍(lán)蛋白或載體處理細(xì)胞24 h。然后將細(xì)胞用胰蛋白酶消化,收集到冰冷的PBS中,并在4℃下用冰冷的70%乙醇的PBS溶液固定至少24 h。然后將細(xì)胞用1 mL碘化丙錠(PI)溶液(含20 mg/mL PI和20 mg/mL RNase的PBS)染色3 h,使用流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter,F(xiàn)ullerton,CA)進(jìn)行分析。使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒(Bender Med System,CA)測(cè)量細(xì)胞凋亡。用胰蛋白酶消化在6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞,并在室溫黑暗條件下用FITC偶聯(lián)的抗-膜聯(lián)蛋白V抗體染色15 min再用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,BD Biosciences)分析。
2.1 TKTL-1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá) 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析TKTL-1 mRNA在65個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣品和5個(gè)正常腦組織樣品中的表達(dá)。結(jié)果顯示:正常腦組織、低級(jí)別和高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中TKTL-1 mRNA的表達(dá)水平分別為1.00±0.28、21.46±3.17和41.58±3.06。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中TKTL-1 mRNA的表達(dá)水平高于正常腦組織(P<0.05),高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中TKTL-1 mRNA的表達(dá)水平高于低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織(P<0.05,圖1)。TKTL-1蛋白主要在星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),而在正常腦組織中未見TKTL-1蛋白陽性表達(dá)。在高、低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中TKTL-1蛋白的陽性表達(dá)率分別為97.67%(42/43)和63.64%(14/22),高于正常腦組織(P<0.05),如圖2所示。
F=321.700,P<0.01;與N組比較,*P<0.05;與WHO低級(jí)別組比較,#P<0.05。
A.正常腦組織;B.WHO Ⅰ級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤;C.WHO Ⅱ級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤;D.WHO Ⅲ級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤;E.WHO Ⅳ級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤;F.WHO Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)照。
2.2 TKTL-1在U87/U251細(xì)胞株中的表達(dá) 在U87和U251細(xì)胞中檢測(cè)到TKTL-1 mRNA的表達(dá)。通過細(xì)胞免疫熒光(ISH)染色鑒定TKTL-1在U87/251細(xì)胞系中的亞細(xì)胞定位,TKTL-1 mRNA在細(xì)胞中可見(綠色),細(xì)胞核用DAPI標(biāo)記(藍(lán)色)(圖3A、3B)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,與對(duì)照細(xì)胞相比,U87和U251細(xì)胞中TKTL-1 mRNA的表達(dá)增加(P<0.01)(圖3C)。Western blot結(jié)果顯示,惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TKTL-1蛋白表達(dá)較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞增加(圖4)。因此,TKTL-1表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖活性相關(guān)。用TKTL-1或?qū)φ战M慢病毒顆粒感染并培養(yǎng)U87和U251細(xì)胞48h后分離RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TKTL-1 mRNA的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)顯示,干擾TKTL-1后,mRNA的表達(dá)下降(P<0.01)(圖3D)。而Western blot結(jié)果也表明,干擾mRNA后惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TKTL-1蛋白表達(dá)降低(圖4)。
A、B.免疫熒光顯示TKTL-1在U251和U87細(xì)胞系中表達(dá)升高;C、D.當(dāng)TKTL-1被干擾后,其表達(dá)量下降(F=236.700,P<0.01;tU87=3.862,PU87=0.018;tU251=3.674,PU251=0.021)。
圖4 SiRNA干擾后U87和U251細(xì)胞系中的TKTL-1蛋白表達(dá)
2.3 SiTKTL-1對(duì)U87和U251細(xì)胞株表型變化的調(diào)節(jié)作用 流式細(xì)胞儀分析表明,TKTL-1基因的干擾可導(dǎo)致U87和U251細(xì)胞株早期凋亡,而對(duì)照組細(xì)胞(Scrambled組)未見明顯變化(P<0.05,圖5A)。細(xì)胞周期分析表明,在U87和U251細(xì)胞中,與Scrambled組相比,TKTL-1 SiRNA組中的G1期細(xì)胞減少,而S期中細(xì)胞的比例增加(P<0.05,圖5B)。此外,克隆形成分析表明,抑制TKTL-1的表達(dá)降低了U251和U87細(xì)胞中腫瘤細(xì)胞克隆的形成(P<0.01,圖6A)。此外,Transwell分析顯示,與Scrambled組相比,TKTL-1被干擾后U251和U87細(xì)胞中侵襲的腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.01,圖6B)。此外,蛋白質(zhì)印跡分析顯示使用RNA干擾TKTL-1后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251/U87)HIF-1α蛋白表達(dá)降低(P<0.01,圖7)。這些數(shù)據(jù)均支持了TKTL-1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)中的調(diào)節(jié)作用。
A.與對(duì)照組(Scrambled)相比U251/U87細(xì)胞凋亡增加(t=9.610,P=0.011);B.在G1期發(fā)生阻滯,S期延長(U87:t1=7.348,P<0.01;t2=1.224,P=0.288;t3=10.392,P<0.01。U251:t1=5.284,P<0.01,t2=2.771,P=0.080,t3=4.849,P<0.01)。
A.t1=8.355,P<0.01;t2=8.464,P<0.01;B.t1=6.911,P<0.01,t2=5.530,P<0.01。
圖7 TKTL-1被SiRNA干擾后U87和U251細(xì)胞系中TKTL-1和HIF-1蛋白的表達(dá)情況
本研究發(fā)現(xiàn),與正常腦組織相比,神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中TKTL-1 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加。并且本研究還明確了干擾TKTL-1基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的影響。TKTL-1被SiRNA干擾后,神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性顯著降低,細(xì)胞凋亡增加。TKTL-1基因的干擾使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞停滯在G0/G1期,S期的細(xì)胞比例明顯下降。同時(shí),TKTL-1基因的干擾還抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和聚集。此外,TKTL-1基因的干擾也抑制了HIF-1α的蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)還表明,TKTL-1基因的表達(dá)可能促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。Millares等[5]研究發(fā)現(xiàn)PPP是癌細(xì)胞通過葡萄糖合成核酸的重要途徑。核酸在生物代謝,尤其是細(xì)胞生長和分裂中起著重要作用。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞生長所需的5-磷酸核糖直接或間接通過未氧化的PPP,而TKTL-1是PPP非氧化分解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。Dong[6]發(fā)現(xiàn)TKTL-1可以通過PPP調(diào)節(jié)葡萄糖的代謝。在TKTL-1過表達(dá)后,PPP的活性增強(qiáng),導(dǎo)致更多的戊糖-5-磷酸和減少的輔酶Ⅱ,并通過甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生乳酸,而這對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長和增殖是必需的。乳酸可使周圍的組織酸化,并產(chǎn)生CO2以進(jìn)一步增強(qiáng)酸度,從而導(dǎo)致組織的pH降低。酸性環(huán)境可促進(jìn)腫瘤血管生成,降解基質(zhì)蛋白并抑制免疫反應(yīng),從而確保腫瘤細(xì)胞存活和腫瘤浸潤,而正常的外周細(xì)胞則無法耐受這種酸性微環(huán)境并死亡。研究表明,TKTL-1表達(dá)在許多惡性腫瘤中顯著上調(diào),例如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、甲狀腺癌、轉(zhuǎn)移性和進(jìn)行性腎細(xì)胞癌、直腸癌[7-11]。TKTL-1的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。另外,Diazmoralli等[4]發(fā)現(xiàn)TKTL-1在人肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)。在通過干擾RNA抑制TKTL-1的表達(dá)后,癌細(xì)胞的生長和增殖被顯著抑制。在人類結(jié)腸癌細(xì)胞的研究中也獲得了類似的結(jié)果。然而,TKTL-1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展及其機(jī)制之間的關(guān)系仍然不是很清楚。為了進(jìn)一步研究TKTL-1的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖之間的關(guān)系,本研究通過干擾RNA抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TKTL-1的表達(dá),使得神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖被顯著抑制,并且被轉(zhuǎn)染了抗TKTL-1 SiRNA的U87和U251系細(xì)胞也出現(xiàn)了G0/G1期阻滯。這表明TKTL-1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖中起著重要的作用。另外,將過表達(dá)的TKTL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖加速,HIF-1α mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)水平顯著增加[11-12]。因此,我們推測(cè)TKTL-1可以為腫瘤細(xì)胞的生長和增殖提供原材料,而且還可刺激HIF-1α的表達(dá)并促進(jìn)血管生成以適應(yīng)低氧的微環(huán)境。這兩個(gè)基因協(xié)同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究證實(shí)TKTL-1基因的干擾也可以減少HIF-1α的表達(dá)。提示TKTL-1靶向治療可能成為減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā),延長患者生存時(shí)間,提高患者生活質(zhì)量的一種新方法。然而,哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是TKTL-1和HIF-1α促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展的機(jī)制,并且TKTL-1是否為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的起始因子有待進(jìn)一步研究考證。
皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2021年1期