黎重陽(yáng)，謝盛莉，馬良,，侯勇，付余，張宇昊,*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶， 400715)2(西南大學(xué) 前沿交叉學(xué)科研究院，生物學(xué)研究中心，重慶， 400715)

蠶蛹(silkworm pupa，SP)是蠶蛾科家蠶蛾的蛹，屬于蠶繭抽絲后的副產(chǎn)物，其于1998年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為“可作為普通食品管理的新資源食品”，是第一個(gè)被認(rèn)定的昆蟲(chóng)類(lèi)食品。我國(guó)作為養(yǎng)蠶大國(guó)，近年來(lái)全國(guó)年產(chǎn)蠶蛹量在30萬(wàn)t以上，約占全世界總產(chǎn)量的80%[1]。蠶蛹蛋白在蠶蛹中占比極高，幾乎是蠶蛹干基中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此大多研究以蠶蛹蛋白為主體研究對(duì)象。呂汶駿等[2]研究發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白中8種必需氨基酸含量占比為49.09%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比為96.43%，高于WHO/FAO提出的參考蛋白模式(8種必需氨基酸含量占比為40%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比為60%)；由此可見(jiàn)，蠶蛹蛋白是一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白資源，但由于其含有潛在過(guò)敏原，如30K家族蛋白、幾丁質(zhì)酶、卵黃原蛋白、丙糖磷酸異構(gòu)酶等[3]，部分人食用蠶蛹相關(guān)產(chǎn)品后會(huì)出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐等過(guò)敏反應(yīng)，從而限制了蠶蛹在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用。因此，在食品安全的前提下充分開(kāi)發(fā)利用蠶蛹資源，必須解決蠶蛹蛋白過(guò)敏問(wèn)題。謝盛莉等[4]按照溶解性對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行分級(jí)提取，包括水溶性、醇溶性、鹽溶性、堿溶性蛋白和不溶性蛋白，并檢測(cè)其中存在的潛在過(guò)敏原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白中不溶性蛋白含量高達(dá)53%，在不同種類(lèi)蠶蛹蛋白中所占比例最高，且過(guò)敏原分布顯示，其中僅檢測(cè)出3種過(guò)敏原，僅占不溶性蛋白9.87%，含量較低，且經(jīng)過(guò)多次堿洗處理后理論上可以降低其致敏性，使不溶性蠶蛹蛋白有直接開(kāi)發(fā)為蛋白產(chǎn)品或者作為改善食品功能性質(zhì)的添加物的可能。

蛋白質(zhì)的功能特性在食品原料的加工利用或儲(chǔ)存過(guò)程中起著極其重要的作用，穆利霞等[5]研究表明繅絲后蠶蛹蛋白的乳化活性(25.52 m2/g)和溶解性(氮溶解指數(shù)60.17%)最好；練釗等[6]使用Osborn法分級(jí)提取繅絲后的蠶蛹水溶性、鹽溶性、醇溶性以及堿溶性蛋白，并對(duì)其功能特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明水溶性蛋白的溶解性和保水性最強(qiáng)，鹽溶性蛋白具有良好的持油性，醇溶性蛋白具有良好的乳化活性。由此可見(jiàn)，蠶蛹蛋白具備一定功能特性，且按照溶解性對(duì)其進(jìn)行分級(jí)提取后可根據(jù)不同功能特性而應(yīng)用于更加廣泛的食品加工領(lǐng)域。

一般動(dòng)物性不溶性蛋白研究較多集中在凝膠特性方面，在食品加工過(guò)程中常見(jiàn)的條件如pH、離子強(qiáng)度、添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG酶)等會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生一定影響，但目前關(guān)于蠶蛹中不溶性蛋白的研究報(bào)道較少，且其凝膠特性尚無(wú)報(bào)道。因此，為明確典型食品加工條件對(duì)蠶蛹蛋白凝膠特性的影響規(guī)律，實(shí)驗(yàn)以鮮蠶蛹為原料提取不溶性蛋白，對(duì)其氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，采用不同的pH、離子強(qiáng)度處理蛋白，并添加TG酶，進(jìn)行流變學(xué)以及拉曼光譜學(xué)的分析，以期為進(jìn)一步的蠶蛹蛋白產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮蠶蛹(家蠶實(shí)驗(yàn)品種“夏芳”，25 ℃，桑葉飼養(yǎng)，化蛹后第3天放置于-20 ℃凍存?zhèn)溆?、無(wú)水乙醇(99.9%)、HCl、NaCl、十二烷基硫酸鈉、二甲基硅油。所有試劑均為分析純，所有水均為二次蒸餾水。

JA3003B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DW-3型數(shù)顯電動(dòng)攪拌器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?，上海新諾儀器設(shè)備有限公司；Multifuge X3R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；L8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司；DHR-1流變儀，美國(guó)TA公司；DXR2拉曼光譜儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹不溶性蛋白提取

蠶蛹預(yù)處理：蠶蛹解凍，沸水漂洗5 min，料理機(jī)粉碎。70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫脂，除醇溶蛋白(2 h，2次)，10 g/L NaOH除去堿溶性蛋白(2 h，3次)，200目濾布過(guò)濾除蛹?xì)?，濾液離心(10 000 r/min，10 min)，用純水多次洗滌蛋白至離心液中性，得到不溶性蛋白。

1.2.2 氨基酸分析

參照國(guó)標(biāo)GB 5009.124—2016測(cè)定氨基酸。

1.2.3 不同條件處理對(duì)蠶蛹不溶性蛋白流變性能以及結(jié)構(gòu)的影響

1.2.3.1 流變性能測(cè)定

不同的前處理方式：(1)不同pH處理對(duì)蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響(頻率及溫度掃描)：取10 g不溶性蛋白分別置于pH 5.0～8.0的溶液中，4 ℃過(guò)夜，離心，室溫平衡30 min后進(jìn)行流變測(cè)試。(2)不同鹽濃度對(duì)蠶蛹不溶性蛋白流變性能影響(頻率及溫度掃描)：取10 g不溶性蛋白分別加入NaCl，使得鹽質(zhì)量濃度分別為0、10、20、25、35 g/L，攪拌均勻，4 ℃過(guò)夜，室溫平衡30 min后進(jìn)行流變測(cè)試。(3)TG酶添加對(duì)蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響(頻率及溫度掃描)：取10 g不溶性蛋白，加入5% TG酶40 ℃反應(yīng)2 h，4 ℃過(guò)夜，次日取出室溫平衡30 min后進(jìn)行流變測(cè)試。

參照文獻(xiàn)[7]方法測(cè)定蛋白流變性能，并略做修改。測(cè)定指標(biāo)為儲(chǔ)能模量(G′)、損失模量(G″)和tanδ值。頻率掃描參數(shù)：溫度25 ℃，應(yīng)變?yōu)?%，頻率范圍為0.01～10 Hz。溫度掃描參數(shù)：將樣品從25 ℃開(kāi)始以2 ℃/min的升溫速率升溫至80 ℃，5 ℃/min的降溫速率降溫至25 ℃。頻率為0.1 Hz，應(yīng)變1%。

1.2.3.2 拉曼光譜分析

不同前處理方式：(1)不同pH前處理：取10 g不溶性蛋白分別置于pH 5.0～8.0的溶液中，4 ℃過(guò)夜，離心，室溫平衡30 min后進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試。(2)不同鹽濃度前處理：取10 g不溶性蛋白分別加入NaCl，使得鹽質(zhì)量濃度分別為0、10、20、25、35 g/L，攪拌均勻，4 ℃過(guò)夜，室溫平衡30 min后進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試。使用拉曼光譜儀記錄凝膠樣品400～3 050 cm-1的拉曼光譜。測(cè)量參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)785 nm；物鏡20×焦距；光闌50 μm狹縫；曝光時(shí)間10 s；樣品曝光15次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析，使用單因素方差分析(ANOVA)方法分析數(shù)據(jù)，當(dāng)P<0.05時(shí)判定組間存在顯著差異，并使用Origin 9.0軟件作圖。拉曼圖譜處理：拉曼圖譜基線校正、歸屬采用OMINIC軟件，歸一化處理以苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)，譜圖的擬合采用Peakfit軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸分析

由表1可以得出，不溶性蛋白質(zhì)氨基酸種類(lèi)齊全，必需氨基酸/總氨基酸(essential amino acids/total amino acids，E/T)達(dá)到40.27%，符合FAO/WHO推薦模式40%，也符合高質(zhì)量的蛋白質(zhì)E/T比值36%；谷物[8]中的限制性氨基酸賴(lài)氨酸含量約為2.5～3.7 g/100g，大豆等[9]油料作物蛋白的限制性氨基酸蛋氨酸含量約為5.5 g/100g。因此，不溶性蠶蛹蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白資源，可作為一種重要的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，添加到谷物制品、大豆蛋白制品中，彌補(bǔ)其限制性氨基酸造成的營(yíng)養(yǎng)缺陷。

蛋白凝膠作用與本身的氨基酸分布有關(guān)，蛋白凝膠的形成與疏水性氨基酸有關(guān)，氨基酸中的非極性片段之間的疏水相互作用可以讓蛋白之間結(jié)合緊密。蛋白質(zhì)中疏水氨基酸的比率會(huì)影響凝膠的形成，當(dāng)?shù)鞍字械氖杷园被岢^(guò)31.5%時(shí)，有可能形成不透明的凝結(jié)型凝膠，非極性氨基酸殘基低于31.5%時(shí)的蛋白質(zhì)則形成半透明或透明型凝膠。疏水相互作用對(duì)凝膠形成有重要作用。由表1可得蠶蛹不溶性蛋白中的疏水性氨基酸比例約為40%，理論上在一定條件下有可能形成不透明的凝結(jié)凝膠[10-11]。

表1 不溶性蛋白氨基酸分析

2.2 不同pH處理對(duì)蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響

儲(chǔ)能模量G′也稱(chēng)彈性模量，反映蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成情況，代表樣品的彈性特征；耗能模量G″也稱(chēng)黏性模量，代表樣品的黏性特征[12]。損耗角正切tanδ是G″與G′模量的比值，黏性模量(G″)小于彈性模量(G′)，tanδ<1，表明凝膠體系中彈性占主導(dǎo)地位[13]，反之則表示黏性占主導(dǎo)地位。tanδ值越高則表明樣品組分越黏稠或彈性越低，tanδ值越小，表明樣品彈性越高[14]；當(dāng)G′值明顯大于G″值時(shí)，tanδ越小，表明該體系屬于弱凝膠體系[15]。

蛋白在加工過(guò)程中其凝膠特性受外界條件溫度、pH、離子強(qiáng)度等影響，pH的變化會(huì)引起蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)及分子間作用力發(fā)生變化。食品中體系一般為弱酸性或弱堿性，故選擇pH 5.0～8.0為模擬加工體系，對(duì)蠶蛹蛋白處理后對(duì)其流變性能進(jìn)行測(cè)定。由圖1-a、圖1-b可以看出，在pH 5.0～8.0，隨著頻率的增加，G′和G″模量出現(xiàn)上升趨勢(shì)，這表明頻率的增加導(dǎo)致了蛋白分子內(nèi)作用力增強(qiáng)。在相同的振蕩頻率下，pH 6.0時(shí)G′和G″值相對(duì)最高，表明pH 6.0時(shí)蛋白分子間的相互作用較強(qiáng)，有利于蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，凝膠性能較好；pH 8.0時(shí)G′和G″值相對(duì)最低，表明此條件下蛋白相互作用相對(duì)較弱，凝膠性能較差。與WESTPHALEN等[16]研究結(jié)果類(lèi)似，隨著pH值的增加豬肉肌球蛋白的G′值逐漸減小，其原因可能是隨著pH的變化，蛋白質(zhì)分子間的作用力發(fā)生了變化，導(dǎo)致凝膠性能發(fā)生變化。圖1-c顯示，隨著頻率的增加，tanδ值出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這表明蛋白凝膠體系彈性進(jìn)一步增強(qiáng)，tanδ值的變化與蛋白鍵間的弛豫行為有關(guān)[17]，在頻率0～1 Hz tanδ出現(xiàn)極大值可能是與初始凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的部分松散[10]以及蛋白鍵持續(xù)作用時(shí)間相對(duì)較短有關(guān)[18]。在1～10 Hz頻率范圍內(nèi)，pH 8.0時(shí)tanδ最小，此時(shí)體系彈性最好，但在該掃描模式下蛋白樣品的tanδ<1，蛋白的彈性模量(G′)明顯大于黏性模量(G″)，表明蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系在pH 5.0～8.0是一種弱凝膠。

a-G′;b-G″;c-tanδ

由圖2-a、圖2-b可以看出，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的G′和G″值總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。溫度升高導(dǎo)致蛋白模量急劇下降，可能是由以下原因引起的[19]：(1)隨著溫度的升高，部分蛋白分子間作用受到破壞，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)缺少支撐而變得松散；(2)蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變可能使得凝膠網(wǎng)絡(luò)的完整性受到破壞，導(dǎo)致蛋白的黏彈性下降。而出現(xiàn)平臺(tái)期的原因可能是高溫下的蛋白凝膠之間的作用力達(dá)到了短暫的平衡。tanδ值下降，說(shuō)明總體而言高溫下更有利于體現(xiàn)蠶蛹蛋白的彈性，原因是高溫下構(gòu)象轉(zhuǎn)變，蛋白分子黏性受到的破壞更強(qiáng)。tanδ值出現(xiàn)快速下降趨勢(shì)，表明隨著溫度升高固體性質(zhì)增強(qiáng)以及流體性質(zhì)減弱。整個(gè)凝膠體系tanδ<1，表明該模式下蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系仍為弱凝膠體系。

G′和G″值在不同pH下發(fā)生變化的原因是pH變化會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力受到了影響，從而引起了蛋白凝膠性能發(fā)生變化?？梢愿鶕?jù)在不同的pH下蛋白結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化來(lái)推測(cè)流變學(xué)特性發(fā)生改變的原因。

a-G′;b-G″;c-tanδ

2.3 不同pH處理對(duì)蠶蛹不溶性蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖3 不同pH條件下的拉曼譜圖

酰胺I帶拉曼特征峰的結(jié)構(gòu)普遍歸屬[23]分為：α-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)范圍為1 645～1 658 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)范圍為1 665～1 680 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)范圍為1 640～1 644 cm-1與1 681～1 690 cm-1；無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)范圍為1 659～1 664 cm-1。通常利用酰胺Ⅰ帶或者酰胺Ⅲ帶檢測(cè)蛋白質(zhì)的主鏈結(jié)構(gòu)，根據(jù)拉曼原始數(shù)據(jù)擬合蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，本研究利用酰胺Ⅰ帶并根據(jù)ALIX等[24]的方法分析不同pH處理后蛋白質(zhì)樣品中的α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量。

如圖4所示，α-螺旋相對(duì)含量在pH 5.0～8.0隨著pH的增大而增大，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則狀態(tài)的相對(duì)含量在此范圍內(nèi)減少，表明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)隨著pH的增大有序化度增加[25]。根據(jù)以上流變學(xué)結(jié)果顯示，無(wú)論是頻率掃描還是溫度掃描，pH 8.0時(shí)樣品的G′和G″模量相對(duì)較低，可能說(shuō)明不溶性蠶蛹蛋白結(jié)構(gòu)有序化不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成和蛋白質(zhì)間的相互作用有關(guān)，進(jìn)一步通過(guò)微環(huán)境分析蛋白質(zhì)間相互作用變化趨勢(shì)。

圖4 不同pH條件下的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量

760 cm-1附近的拉曼光譜帶歸屬為色氨酸側(cè)鏈，可用于研究色氨酸殘基的疏水性微環(huán)境的變化，當(dāng)色氨酸殘基從被包埋態(tài)疏水微環(huán)境變成被暴露態(tài)極性環(huán)境時(shí)，760 cm-1附近的峰強(qiáng)度可能下降[26]。如圖5所示，在pH 6.0時(shí)的I760歸一化強(qiáng)度達(dá)到一個(gè)極大值，說(shuō)明更多的色氨酸殘基沒(méi)有暴露在表面，可能是蛋白質(zhì)內(nèi)部更多的疏水作用形成而導(dǎo)致的疏水基團(tuán)包埋，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，pH 6.0時(shí)G′和G″模量較高，可能說(shuō)明分子內(nèi)部疏水作用的形成，更有利于蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。當(dāng)色氨酸殘基趨于暴露時(shí)，可能導(dǎo)致蛋白內(nèi)部疏水相互作用降低，不利于蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，G′和G″值出現(xiàn)降低趨勢(shì)。

酪氨酸的特征雙峰(850/830)是酪氨酸殘基上對(duì)位取代苯環(huán)的振動(dòng)引起的[27]，其雙峰比值(I850/I830)可作為微環(huán)境及酚羥基上氫鍵的探針以及酪氨酸組分埋藏和暴露的程度[28]，當(dāng)I850/I830的比值為1.25～1.40時(shí)，表明此時(shí)酪氨酸殘基完全暴露于分子表面；當(dāng)比值為0.3～0.5時(shí)，酪氨酸殘基完全包埋而藏于分子內(nèi)部；當(dāng)比值為0.7時(shí)，酪氨酸殘基此時(shí)處于電離狀態(tài)[29]。由圖5可得，在pH 5.0～6.0,I850/I830比值均大于1，pH 6.0時(shí)I850/I830比值相對(duì)最低，此時(shí)酪氨酸暴露最少。酪氨酸作為氫鍵的供體[30]，酪氨酸暴露減少說(shuō)明分子間氫鍵作用減少，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，pH 6.0時(shí)G′和G″模量較高，此時(shí)氫鍵作用較弱，因此推測(cè)過(guò)多的氫鍵形成可能不利于不溶性蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成。

在動(dòng)物性蛋白中，肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠過(guò)程中疏水作用和二硫鍵的形成起到重要作用[15]，而膠原蛋白類(lèi)凝膠形成過(guò)程中氫鍵起到更重要的作用[31]，維系不溶性蠶蛹蛋白凝膠特性的可能主要是疏水作用，由此可見(jiàn)，其凝膠維系方式可能與肌原纖維蛋白更加接近。

圖5 不同pH條件下的歸一化強(qiáng)度

2.4 不同鹽濃度處理對(duì)蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響

除了pH的影響外，離子強(qiáng)度會(huì)引起蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)及分子間作用力發(fā)生變化，從而引起蛋白凝膠性質(zhì)發(fā)生變化。依據(jù)肉糜蛋白類(lèi)制品加工過(guò)程中常用鹽濃度，探究不同鹽濃度處理后蛋白質(zhì)的G′、G″值和tanδ值的變化情況，進(jìn)行頻率掃描后的變化如上圖所示。由圖6-a、圖6-b可以看出，隨著頻率的增加，不同鹽濃度條件下的G′和G″值呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在相同的振蕩頻率下，低鹽質(zhì)量濃度(10～20 g/L)的G′值小于對(duì)照組，與BERGROS等[32]類(lèi)似，鹽的加入影響了羅非魚(yú)蛋白凝膠的G′值，鹽處理后的蛋白G′值明顯低于未加鹽處理的蛋白；中高鹽濃度(25～35 g/L)的G′值高于對(duì)照組，可能是鹽影響了蛋白分子間的作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性發(fā)生變化。在鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)，體系的G′和G″值相對(duì)最高，表明此條件下蛋白質(zhì)分子間的相互作用較強(qiáng)，此時(shí)有利于蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，流變性能較好。由圖6-c可以看出，tanδ值隨著頻率的增加出現(xiàn)下降趨勢(shì)，tanδ值的下降表明樣品彈性增強(qiáng)。在1～10 Hz，對(duì)照組的tanδ最小，此時(shí)體系彈性最好，經(jīng)過(guò)鹽處理后蛋白體系彈性下降。在鹽質(zhì)量濃度為0～35 g/L時(shí)，所有體系的G′值明顯大于G″值，tanδ值分布在0.12～0.24，表明蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系屬于弱凝膠體系。

由圖7-a、圖7-b可以看出，隨著溫度的升高，不同鹽質(zhì)量濃度(0～35 g/L)處理后蛋白的G′和G″值總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，G′值在25～70 ℃出現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)，70 ℃后出現(xiàn)一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的平臺(tái)期；G″值在25～70 ℃出現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)，70 ℃后出現(xiàn)一個(gè)較小的下降趨勢(shì)；在相同掃描溫度下，在鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)的G′和G″值最高，此條件下蛋白質(zhì)分子間的相互作用較強(qiáng)，有利于蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，流變性能較好；由圖7-c可以看出，tanδ值總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著溫度的升高，tanδ值在25～40 ℃時(shí)呈現(xiàn)先緩慢下降趨勢(shì)，40 ℃之后出現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)。該掃描模式下tanδ值曲線分布密集，tanδ值總體分布范圍在0.12～0.24，G′明顯大于G″值，表明蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系屬于弱凝膠體系。

G′和G″值在不同鹽濃度下發(fā)生變化的原因是離子濃度的變化可能會(huì)引起蛋白結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致蛋白內(nèi)部分子間維持凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力受到影響，從而引起了蛋白凝膠性能發(fā)生變化。可以根據(jù)在不同的鹽濃度下蛋白結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化來(lái)推測(cè)流變學(xué)特性發(fā)生改變的原因。

a-G′;b-G″;c-tanδ

2.5 不同鹽濃度處理對(duì)蠶蛹不溶性蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖8為不同鹽質(zhì)量濃度(0～35 g/L)處理后蛋白樣品的拉曼光譜曲線。不同鹽濃度處理后的拉曼光譜圖基本一致，利用酰胺Ⅰ帶并根據(jù)ALIX等[24]的方法分析不同鹽濃度處理后蛋白樣品中的α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量。

圖8 不同鹽濃度條件下的拉曼譜圖

如圖9所示，在鹽質(zhì)量濃度為0～35 g/L時(shí)，α-螺旋和β-折疊的相對(duì)含量變化不明顯，α-螺旋和β-折疊的相對(duì)含量均分布在65%～75%，表明此條件下的蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定有序。

圖9 不同鹽濃度條件下的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量

如圖10所示，在鹽質(zhì)量濃度范圍為0～35 g/L，鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)，I760強(qiáng)度達(dá)到一個(gè)極大值，色氨酸趨于包埋，說(shuō)明此時(shí)更多的色氨酸殘基沒(méi)有暴露在表面，可能是蛋白內(nèi)部更多的疏水作用形成而導(dǎo)致的疏水基團(tuán)包埋，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，鹽質(zhì)量濃度35 g/L時(shí)G′和G″模量較高，可能說(shuō)明分子內(nèi)部疏水作用的形成，更有利于蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。當(dāng)色氨酸殘基趨于暴露時(shí)，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水相互作用降低，不利于蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，G′和G″值出現(xiàn)降低趨勢(shì)。

由圖10可得，在鹽質(zhì)量濃度范圍0～35 g/L內(nèi)，鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)I850/I830比值最小，此時(shí)酪氨酸暴露最少，酪氨酸作為氫鍵的供體，酪氨酸暴露減少說(shuō)明分子間氫鍵作用減少，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，此時(shí)G′和G″模量較高，氫鍵作用較弱，因此推測(cè)過(guò)多的氫鍵形成可能不利于不溶性蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成。當(dāng)酪氨酸暴露增多時(shí)，不利于蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成，可能導(dǎo)致流變學(xué)特性變差，G′和G″值出現(xiàn)降低趨勢(shì)。

圖10 不同鹽濃度條件下的歸一化強(qiáng)度

2.6 TG酶處理對(duì)蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響

TG酶是一種催化蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈中谷氨胺殘基與賴(lài)氨酸之間形成ε-(γ-谷氨?；?賴(lài)氨酸共價(jià)鍵的蛋白酶，通常用于蛋白質(zhì)凝膠特性的改善[33]。由圖11-a～圖11-c可以看出，隨著頻率增大，蛋白體系的G′和G″值總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；由圖11-d～圖11-f可以看出，隨著溫度的升高，蛋白體系的G′和G″值總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。無(wú)論是頻率掃描還是溫度掃描，蛋白凝膠體系的黏性模量(G″)始終小于彈性模量(G′)，tanδ值<1，表明蠶蛹不溶性蛋白質(zhì)凝膠仍是彈性占主導(dǎo)地位的弱凝膠體系。加入TG酶處理后的蛋白體系的G′和G″模量明顯增大，黏彈性增強(qiáng)，表明TG酶的添加可有效改善蠶蛹不溶性蛋白的凝膠特性。

在典型加工條件下，不溶性蠶蛹蛋白呈現(xiàn)弱凝膠特性，而TG酶可以顯著增強(qiáng)其凝膠特性，這表明在TG酶交聯(lián)條件下，不溶性蠶蛹蛋白具有開(kāi)發(fā)凝膠類(lèi)蛋白質(zhì)制品或作為在其中添加使用的可行性。

a-G′;b-G″;c-tanδ

3 結(jié)論

(1)不溶性蠶蛹蛋白中必需氨基酸含量40%，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)資源，且疏水性氨基酸比例達(dá)到40%，有蛋白質(zhì)分子間通過(guò)疏水作用力形成不透明凝膠的可能。

(2)不溶性蠶蛹蛋白經(jīng)過(guò)不同的pH和不同鹽濃度處理后，經(jīng)過(guò)流變學(xué)頻率掃描和溫度掃描顯示，在pH 6.0、鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)，不溶性蛋白體系的G′值和G″值最高，黏彈性最好；在pH 5.0～8.0、鹽質(zhì)量濃度為0～35 g/L時(shí)，不溶性蛋白質(zhì)凝膠體系的G′值明顯大于G″值，tanδ<1，表明不溶性蛋白質(zhì)凝膠是一種弱凝膠。拉曼光譜學(xué)顯示，pH增大會(huì)引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有序化增多，但不利于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的形成，不溶性蛋白體系的G′值和G″值在pH 8.0時(shí)最低。色氨酸的暴露與疏水相互作用有關(guān)，色氨酸在pH 6.0及鹽質(zhì)量濃度35 g/L時(shí)趨于包埋態(tài)，分子內(nèi)部疏水作用的形成，更有利于蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，此時(shí)G′值和G″值最高。當(dāng)色氨酸殘基趨于暴露時(shí)，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水相互作用降低，不利于蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。酪氨酸的暴露與氫鍵作用力有關(guān)，酪氨酸在pH 6.0時(shí)及鹽質(zhì)量濃度35 g/L暴露最少，說(shuō)明分子間氫鍵作用減少，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，推測(cè)過(guò)多的氫鍵形成可能不利于不溶性蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成。疏水相互作用和氫鍵可能是影響蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的的關(guān)鍵作用力，蛋白微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，維持蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力也會(huì)發(fā)生變化，流變學(xué)特征的G′值和G″值發(fā)生變化。

(3)加入TG酶處理后的蛋白體系的G′和G″模量明顯增大，黏彈性增強(qiáng)，表明TG酶的添加可改善不溶性蛋白的凝膠特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為不溶性蠶蛹蛋白質(zhì)的加工提供一定的理論參考。