陸益鋇，呂春霞，廖慧琦，胡遠(yuǎn)輝，雷葉斯，曹少謙，楊華

(浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波，315100)

魚肉中普遍含有絲氨酸蛋白酶，該酶可以引起肌原纖維蛋白降解，導(dǎo)致魚糜凝膠發(fā)生凝膠劣化現(xiàn)象[1]。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶大部分位于肌原纖維部位，少量位于肌漿部分，絲氨酸蛋白酶可以與肌原纖維蛋白緊密結(jié)合、難以分離，并具有強(qiáng)活性[2-6]。OSATOMI等[7]首次用高鹽溶液酸處理分離純化鯉魚肉中的絲氨酸蛋白酶。部分學(xué)者在狗母魚[5]、鰱魚[3]、鯽魚[8]等中相繼發(fā)現(xiàn)并分離出絲氨酸蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，55 ℃下，將純化后的絲氨酸蛋白酶添加到鯉魚肌原纖維中，反應(yīng)1 h后，肌動(dòng)蛋白被降解成不同的片段，而肌球蛋白重鏈、α-輔肌動(dòng)蛋白幾乎完全被降解了。相同條件下，蛇鯔的肌球蛋白重鏈同樣被降解了，但其他蛋白幾乎不變，故絲氨酸蛋白酶參與凝膠劣化現(xiàn)象，但不同的物種具有差異[2]。為了抑制內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的活性，添加抑制劑是一種較為有效的手段。

在魚糜制品生產(chǎn)過程中，為了保證魚糜制品具有良好的風(fēng)味、口感及凝膠性能，經(jīng)常會(huì)添加一些外源添加劑。魚肉加工中經(jīng)常會(huì)添加一些食鹽，首要目的是調(diào)節(jié)魚肉制品的味道，還可以使鹽溶性蛋白溶解，提高魚糜制品的凝膠特性。文獻(xiàn)表明NaCl對(duì)肌原纖維蛋白凝膠性能起著重要的作用，可以改變環(huán)境中的離子強(qiáng)度，提高肌原纖維蛋白的溶解性，在加熱過程中，肌原纖維蛋白發(fā)生變性，將水分包裹在內(nèi)，提高肌原纖維蛋白凝膠的持水性，改善魚糜的質(zhì)構(gòu)特性[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，離子強(qiáng)度會(huì)影響蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，在低離子強(qiáng)度下(0.2～0.4 mol/L NaCl)，形成較細(xì)的鏈狀結(jié)構(gòu)，在高離子強(qiáng)度下則形成粗絲狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[10-11]。且NaCl具有較強(qiáng)的防腐功能，可以抑制一些腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[12-13]。有研究證實(shí)，在肌原纖維蛋白中添加NaCl，可以引起其膨脹、斷裂，使蛋白的持水性增強(qiáng)，黏度增大[14]。本文以養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白和絲氨酸蛋白酶為對(duì)象，由于魚糜凝膠需加熱制備，因此首先探討絲氨酸蛋白酶的最適溫度及pH，可避免長(zhǎng)時(shí)間在此溫度附近逗留以致破壞凝膠特性，并進(jìn)一步研討NaCl對(duì)絲氨酸蛋白酶活性的影響。在此基礎(chǔ)上再探究NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，為后期控制魚糜凝膠劣化，提高魚糜凝膠特性提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖大黃魚，購(gòu)于寧波路林市場(chǎng)；NaCl、乙醇、叔丁醇、Na2HPO4、NaH2PO4、HCl,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris，Solarbio有限公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，Peptide Institute；戊二醛、7-氨基-4-甲基香豆素，麥克林試劑有限公司；DEAE-Sephacel，上?；巧锟萍加邢薰荆籔henyl-Sepharose，北京博爾西科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT Plus 物性分析儀，美國(guó)FTC公司；Avanti J-26XP冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；KTA pure LI 蛋白純化層析儀，GE Healthcare Uppsala Sweden；色差計(jì)，上海源琦檢測(cè)儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ALPHA2-4冷凍干燥儀，上海繼譜電子科技有限公司；In Via-Reflex拉曼光譜儀，法國(guó)Renishaw公司；F-380內(nèi)源熒光分光光度計(jì)，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

養(yǎng)殖大黃魚去頭、去尾、去鱗、去內(nèi)臟等，淋洗干凈，瀝干取肉，-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照CHIN等[15]和JIANG等[16]的研究，稍作修改，取適量魚糜，加入4倍體積冰提取液(20 mmol/L，pH 7.5磷酸鹽緩沖液)，高速勻漿機(jī)均漿60 s(7 500 r/min)，將所得的勻漿液冷凍離心10 min(7 000 r/min，4 ℃)，除去上清液。重復(fù)3次。得到粗肌原纖維蛋白再加入4倍體積冰洗液(0.1 mol/L NaCl)，均漿60 s(7 500 r/min)，離心10 min，取沉淀。重復(fù)1次上述實(shí)驗(yàn)，最后一次勻漿液用3層紗布過濾，以7 000 r/min冷凍離心10 min，取沉淀，-40 ℃冷凍保藏。

1.3.3 絲氨酸蛋白酶的分離純化

(1)絲氨酸蛋白酶粗提取

參照鮑曉瑾[17]的方法，并略做修改。將冷凍魚糜解凍完全后取適量于離心管中，加入4倍體積的pH 7.5，25 mmol/L磷酸鹽緩沖液，高速勻漿機(jī)8 000 r/min勻漿30 s，4 ℃、8 000×g離心10 min，去上清液，取沉淀，重復(fù)上述方法4次，最后得到無腥味、半透明狀的沉淀。沉淀中加入pH 7.5，25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含0.5 mol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，5 mmol/L Na3PO3)，高速勻漿后靜置30 min，紗布過濾，收集濾液，加入15倍體積的冷蒸餾水，4 ℃下靜置過夜，離心后取沉淀，即為肌原纖維[7]。所得肌原纖維與2 mol/L的KCl混合，調(diào)整pH至4.0，靜置2 h，離心取沉淀。將所得沉淀以1∶5加入2 mol/L的KCl，混合離心去上清液，即絲氨酸蛋白酶粗酶液。透析48 h，冷凍干燥，-40 ℃貯藏，待用[18]。

(2)DEAE-Sephacel離子交換層析

參照翁凌等[19]的方法，將粗酶溶于少量pH 7.5， 20 mmol/L的Tris-HCl溶液，10 000 r/min 4 ℃下離心10 min，取上清液。將上清液上樣于平衡后的DEAE-Sephacel柱子(2.5 cm×11 cm)，用含0～0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，收集各組分并測(cè)定A280值。對(duì)收集溶液進(jìn)行酶活測(cè)定，選取活性部分。

(3)Sephacryl S-100凝膠層析

參照蔡秋鳳等[20]的方法，將收集的活性部分樣品上樣于平衡后的Sephacryl S-100凝膠柱(1.5 cm×60 cm)，用含1 mol/L (NH4)2SO4的20 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，測(cè)定各組分A280值及酶活，收集高活性部分的溶液。

1.3.4 絲氨酸蛋白酶的活性測(cè)定

絲氨酸蛋白酶酶活測(cè)定參照CAO等[21]、鮑曉瑾[17]的方法進(jìn)行測(cè)定，并略作修改。以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物檢測(cè)絲氨酸蛋白酶的酶活，取850 μL的50 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液于10 mL的離心管中，加入100 μL 100 mmol/L的熒光底物，再加入50 μL的絲氨酸蛋白酶液，55 ℃下反應(yīng)10 min，立即加入終止液[V(甲醇)∶V(正丁醇)∶V(蒸餾水)=35∶30∶35]，室溫下靜置15 min，內(nèi)源熒光光度計(jì)測(cè)量其熒光強(qiáng)度，設(shè)置發(fā)射波長(zhǎng)為380 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為470 nm。Tris-HCl緩沖液作為空白對(duì)照，絲氨酸蛋白酶酶活以1 min生產(chǎn)1 μmol Boc-cys(AMC)所需的絲氨酸蛋白酶來表示一個(gè)酶活單位。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，配制標(biāo)準(zhǔn)品AMC為10 μmol/L，將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、3、4、5 μmol/L配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定熒光值，每個(gè)濃度測(cè)3次[22]。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.016 1x+0.390 6。

1.3.5 絲氨酸蛋白酶最適溫度測(cè)定

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，取100 μL底物，50 μL酶于離心管中，分別置于20～70 ℃水浴鍋內(nèi)，參照2.4方法測(cè)定酶活。

1.3.6 絲氨酸蛋白酶最適pH測(cè)定

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，取100 μL底物，50 μL酶于離心管中，以pH為5、6、7、8、9、10的Tris-HCl緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)，參照2.4方法測(cè)定酶活。

1.3.7 不同NaCl添加量對(duì)絲氨酸蛋白酶活性影響

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，取100 μL底物，50 μL酶于離心管中，分別添加0、10、20、30、40 g/L NaCl后，參照2.4方法測(cè)定酶活。

1.3.8 添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠制備

取5 g肌原纖維蛋白于離心管中，分別加入含0、10、20、30、40 g/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5，20 mmol/L)，再加入上述提取的絲氨酸蛋白酶100 μL，均質(zhì)5 min，置于水浴鍋中大約以1 ℃/min的升溫速度從20 ℃升到70 ℃，加熱30 min后立即取出，置于4 ℃冰箱冷藏過夜，測(cè)定肌原纖維蛋白凝膠特性前先將樣品至于室溫下平衡1 h[6]。

1.3.9 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

取養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠樣品于質(zhì)構(gòu)儀載物臺(tái)上，參照許艷順等[23]的方法，將養(yǎng)殖大黃魚魚糜凝膠的腸衣剝?nèi)?，切? cm左右的厚度，置于質(zhì)構(gòu)儀載物臺(tái)上，采用P/25探頭，應(yīng)變力為0.1 N，測(cè)試速度為60 mm/min，形變量為50%，室溫下完成測(cè)定。

1.3.10 持水性測(cè)定

肌原纖維蛋白凝膠的持水性測(cè)定參照顏偉華等[24]的方法并略做修改，取養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠于離心管內(nèi)離心10 min(4 ℃、8 000 r/min)，離心前樣品質(zhì)量為W1，離心后樣品質(zhì)量為W2，凝膠持水性計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.11 白度測(cè)定

將養(yǎng)殖大黃魚魚糜凝膠樣品切成5 mm左右的薄片，在室溫下用色差計(jì)測(cè)定凝膠白度，白度計(jì)算公式參照PARRARAVIVAT等[25]的方法，如公式(2)所示：

(2)

式中：L*，亮度；+a*，偏紅，-a*，偏綠；+b*，偏黃，-b*,偏藍(lán)。

1.3.12 拉曼光譜測(cè)定

養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠樣品采用拉曼光譜分析，參考張自業(yè)[26]的方法。將制備好的肌原纖維蛋白凝膠樣品置于載玻片上，選擇50倍長(zhǎng)聚焦鏡頭對(duì)肌原纖維蛋白樣品進(jìn)行聚焦。檢測(cè)參數(shù)為所用功率為100 mW，532 nm氬離子激光器，分辨率為1 cm-1，獲取的拉曼光譜范圍在400～4 000 cm-1。

1.3.13 內(nèi)源熒光測(cè)定

將肌原纖維蛋白凝膠溶于pH 7.5，20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，配制成0.2 mg/mL的肌原纖維蛋白凝膠溶液，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～450 nm，狹縫寬度為5 nm[27]。

1.3.14 微觀結(jié)構(gòu)觀察

參照許艷順[28]的方法，并略做修改。將養(yǎng)殖大黃魚魚糜凝膠切成整齊的塊狀置于塑料培養(yǎng)皿中，加入一定量的戊二醛，于4 ℃下固定24 h，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3～5次，再用不同含量的乙醇及無水乙醇叔丁醇混合溶液(3∶1、1∶1、1∶3)、乙醇、叔丁醇漂洗，最后冷凍干燥，噴金，掃描觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均平行3次，數(shù)據(jù)采用Excel軟件作圖，SPSS Statistics軟件進(jìn)行單樣本T檢驗(yàn)(n=3)、顯著性分析及組間相關(guān)性分析，不同小寫字母表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲氨酸蛋白酶的分離純化

研究發(fā)現(xiàn)，魚肉中存在的內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶會(huì)使肌原纖維蛋白凝膠重鏈發(fā)生降解[7]。養(yǎng)殖大黃魚肉經(jīng)過提取、透析、凍干得到的粗酶，再經(jīng)過DEAE-Sephace分離純化結(jié)果如圖1-a所示，從圖中可以看出，有許多無活性的雜蛋白。在NaCl濃度為0.2～0.25 mol/L，有活性的絲氨酸蛋白酶被洗脫下來，收集活性部分進(jìn)行下一步純化。取活性部分收集液上樣于Sephacryl S-100凝膠層析柱，這一步主要是根據(jù)樣品分子質(zhì)量大小而達(dá)到分離目的。樣品經(jīng)過Sephacryl S-100凝膠柱分離純化結(jié)果如圖1-b所示，Sephacryl S-100凝膠柱有效的除去了大部分雜蛋白，使目標(biāo)蛋白的純度增加。選擇高吸光值的酶活性峰，收集活性組分。

2.2 絲氨酸蛋白酶的最適溫度

由圖2可知絲氨酸蛋白酶的最適溫度在20～70 ℃，絲氨酸蛋白酶的相對(duì)活力隨溫度的上升呈先顯著增大后顯著減小的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，酶活最大。這與魚糜凝膠在50～55 ℃發(fā)生凝膠劣化的溫度一致，當(dāng)溫度升到70 ℃時(shí)，絲氨酸蛋白酶的酶活顯著降低，僅為最大活性的59.98%(P<0.05)。

2.3 絲氨酸蛋白酶的最適pH值

由圖3可知，當(dāng)pH增大時(shí)，絲氨酸蛋白酶的相對(duì)活力先隨之增大，pH為7時(shí)相對(duì)酶活最大(P<0.05)，繼續(xù)增大pH，相對(duì)酶活減小。當(dāng)pH為5時(shí)，絲氨酸蛋白酶的相對(duì)酶活為最大酶活的60.86%，當(dāng)pH達(dá)到10時(shí)，絲氨酸蛋白酶的相對(duì)活性僅為最大酶活的51.51%。過高或過低的pH都不利于絲氨酸蛋白酶的活性，可能是由于酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象發(fā)生變化，影響活性區(qū)域，使酶活降低[29]。

a-DEAE-Sephace；b-Sephacryl S-100；

圖2 絲氨酸蛋白酶的最適溫度

圖3 絲氨酸蛋白酶的最適pH值

2.4 不同NaCl添加量對(duì)絲氨酸蛋白酶活性的影響

不同NaCl添加量對(duì)絲氨酸蛋白酶的活性影響如圖4所示，由圖4可知，隨著NaCl添加量(質(zhì)量濃度)的增大，絲氨酸蛋白酶的相對(duì)活性顯著下降(P<0.05)，空白組的絲氨酸蛋白酶活性最大，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增多，絲氨酸蛋白酶的相對(duì)活性逐漸降低，40 g/L NaCl組的活性相對(duì)最小，為72.03%(P<0.05)。

圖4 不同NaCl添加量(質(zhì)量濃度)對(duì)絲氨酸蛋白酶活性的影響

2.5 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

為了研究NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響，利用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行分析，由表1可知，NaCl組的養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于空白組，隨著NaCl添加量的增多，凝膠硬度先顯著上升后顯著下降(P<0.05)，20 g/L NaCl添加量組凝膠硬度最大，之后隨著NaCl添加量的增多，硬度又略有下降(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，鹽濃度可以改變環(huán)境中的離子強(qiáng)度，蛋白的電荷分布及蛋白在溶液中的狀態(tài)，使蛋白之間的相互作用發(fā)生變化，影響到蛋白的凝膠特性[30]。并且NaCl降低絲氨酸蛋白酶的活性，減弱其對(duì)肌原纖維蛋白的降解，從而使肌原纖維蛋白凝膠的硬度增大。在NaCl添加量為0～20 g/L時(shí)，蛋白凝膠的黏附性不斷增大(P<0.05)，繼續(xù)增大NaCl的質(zhì)量濃度，凝膠黏附性又顯著減小(P<0.05)，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，凝膠的黏附性最大，為0.065 mJ。隨著NaCl質(zhì)量濃度的增多，養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠的內(nèi)聚性先顯著增大(P<0.05)，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，凝膠的內(nèi)聚性最大(P<0.05)，繼續(xù)增大NaCl的質(zhì)量濃度，凝膠的內(nèi)聚性又略有減小(P<0.05)。在NaCl質(zhì)量濃度為0～20 g/L，凝膠彈性不斷顯著增大(P<0.05)，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為30、40 g/L時(shí)，肌原纖維蛋白凝膠的彈性增大不明顯(P>0.05)。在NaCl質(zhì)量濃度為0～20 g/L，肌原纖維蛋白凝膠的膠黏性、咀嚼性不斷上升(P<0.05)，20 g/L NaCl質(zhì)量濃度組凝膠膠黏性、咀嚼性最大，繼續(xù)增多NaCl的添加量，蛋白凝膠的膠黏性、咀嚼性又略有下降(P>0.05)。

表1 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.6 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

圖5是NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響。由圖5可知，隨著NaCl添加量的增多，凝膠持水性顯著增大(P<0.05)。與空白組相比，NaCl組凝膠持水性顯著增大(P<0.05)，在NaCl質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，肌原纖維蛋白凝膠的持水性最好。研究表明，適量的NaCl會(huì)提高溶液環(huán)境里的離子強(qiáng)度，使凝膠形成更加均勻的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，凝膠孔徑小，更容易保留住凝膠中的水分[31]。韓敏義[32]在研究肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)與熱誘導(dǎo)凝膠功能特性的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，凝膠持水性不斷增加。絲氨酸蛋白酶會(huì)對(duì)肌球蛋白重鏈造成降解，而NaCl抑制了酶活性，減輕其對(duì)肌原纖維蛋白凝膠的破壞，故添加了NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠的持水性大于空白組。

圖5 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

2.7 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

由表2可知，NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠白度的影響。空白組中凝膠白度值最小，隨著NaCl添加量的增多，凝膠白度不斷上升，20 g/L NaCl添加量的凝膠白度最大，為54.35。而30 g/L NaCl添加量的白度值下降，40 g/L NaCl添加量組的凝膠白度略小于20 g/L NaCl添加量組，為53.19。研究發(fā)現(xiàn)，白度變化與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變、變性，展開或聚集等情況有關(guān)[33]。若魚糜凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，其表面可以反射出更多的光，以此提高養(yǎng)殖大黃魚魚糜的白度[34-35]。由此可見，NaCl的添加可能導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變、凝膠空間結(jié)構(gòu)更加致密，從而導(dǎo)致白度上升。

表2 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

2.8 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)添加了絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠進(jìn)行拉曼測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠拉曼光譜的影響

2.9 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠構(gòu)象的影響

NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響如圖7所示。由圖7可知，空白組中肌原纖維蛋白凝膠的熒光強(qiáng)度最大，10 g/L NaCl組的凝膠熒光強(qiáng)度與空白組之間幾乎無差別，30、40 g/L組與空白組相差較小。20 g/L NaCl組的熒光強(qiáng)度最低，說明在添加20 g/L NaCl后，可能使肌原纖維蛋白凝膠體系的蛋白結(jié)構(gòu)有所改變，蛋白展開，使內(nèi)部的色氨酸殘基暴露于表面，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。賈娜等[37]研究表明，豬肉糜中肌原纖維蛋白凝膠的熒光強(qiáng)度與NaCl質(zhì)量濃度的增加未曾體現(xiàn)規(guī)律性變化。但當(dāng)NaCl與迷迭香提取物協(xié)同作用，肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度明顯下降。

2.10 NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖8是NaCl對(duì)添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，由圖8可知，空白組中肌原纖維蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)雜亂無序，凝膠斷裂嚴(yán)重。添加了10 g/L NaCl后，凝膠的結(jié)構(gòu)聚集程度稍微增強(qiáng)，空隙較小。且隨著NaCl添加比例的增大，蛋白凝膠結(jié)構(gòu)越來越緊密穩(wěn)定，孔徑越來越小，且致密有序、平整，凝聚度較高，致密有序的結(jié)構(gòu)有助于持水能力的增強(qiáng)。研究表明，原肌纖維蛋白溶解度隨著離子強(qiáng)度的升高而增大，肌原纖維蛋白變性展開更充分，這有利于形成更為致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以吸附包裹更多的水分[26]。賈丹[38]研究發(fā)現(xiàn)，CaCl2的添加對(duì)魚糜凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也有一定的改良效果。未添加 CaCl2的青魚和鰱魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔隙較大，添加40 mmol/kg CaCl2的魚糜凝膠的孔隙較小，結(jié)構(gòu)均較致密。

a-空白組;b-10 g/L NaCl組;c-20 g/L NaCl組;d-30 g/L NaCl組;e-40 g/L NaCl組

2.11 添加與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠相關(guān)性分析

將肌原纖維蛋白凝膠及添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性、白度、持水性的參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，得到的結(jié)果如表3所示。由表3可知，肌原纖維蛋白凝膠與添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠具有一定的相關(guān)性，運(yùn)用皮爾森相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性與添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性具有極強(qiáng)的相關(guān)性且二者之間的相關(guān)性系數(shù)分別為0.984、0.977、0.850、0.900、0.944、0.852；而在添加相同含量NaCl中，肌原纖維蛋白凝膠、添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠持水性的相關(guān)性系數(shù)為0.723，具有中度相關(guān)性；此外二者之間的白度值相關(guān)性較低，為0.449。研究結(jié)果表明，絲氨酸蛋白酶會(huì)破壞肌原纖維蛋白凝膠特性，添加絲氨酸蛋白酶與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠經(jīng)過不同含量NaCl處理后，未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)較好，說明絲氨酸蛋白酶會(huì)造成肌原纖維蛋白凝膠劣化，而NaCl在一定程度上抑制了絲氨酸蛋白酶的活性，減輕肌原纖維蛋白凝膠劣化，因此，在不同NaCl添加量組中，NaCl不僅可以促進(jìn)魚糜發(fā)生凝膠化，還可以抑制魚糜中內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的活性。

表3 添加與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠的皮爾森相關(guān)性檢驗(yàn)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同NaCl添加量(質(zhì)量濃度)對(duì)絲氨酸蛋白酶及含有絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，研究發(fā)現(xiàn)：

(1)通過對(duì)絲氨酸蛋白酶的最適溫度、pH值的研究，發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶的最適溫度為50 ℃，最適pH值為7。NaCl組的絲氨酸蛋白酶的活性相較與空白組的酶活性低，隨著NaCl添加量的增多，絲氨酸蛋白酶的活性顯著下降。

(2)隨著NaCl添加量的增多，含有絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性有所改善，20 g/L NaCl添加量組的硬度、膠黏性、咀嚼性最大，40 g/L添加量組的黏附性、彈性較好。添加NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠持水性有顯著性提高，NaCl添加量為40 g/L時(shí)，蛋白凝膠的持水性最大，為44.58%。添加NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠的白度值總體上升，NaCl添加量為20 g/L時(shí)，凝膠白度最大。

(3)添加NaCl后，含有絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋減少，β-折疊、無規(guī)則卷曲增多，通過內(nèi)源熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，蛋白凝膠三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白空間結(jié)構(gòu)展開。隨著NaCl添加量的增多，肌原纖維蛋白凝膠的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越來越緊密。

(4)通過皮爾森相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)添加與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠經(jīng)不同含量NaCl處理后的凝膠特性具有一定的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)，NaCl本身可以改善肌原纖維蛋白凝膠特性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NaCl降低了絲氨酸蛋白酶的活性，一定程度上阻止了酶對(duì)肌原纖維蛋白凝膠的破壞。