白勝超 陳圣菊 尚畫雨 李俊平 周越 王瑞元

1 南京理工大學體育部（江蘇南京210094）

2 北京體育大學運動人體科學學院（北京100084）

3 成都體育學院運動醫(yī)學與健康學院（四川成都610041）

長時間進行大負荷或不習慣的離心運動后，骨骼肌會出現(xiàn)僵硬酸痛、肌力下降、超微結(jié)構(gòu)改變等現(xiàn)象，造成運動性骨骼肌損傷，導(dǎo)致運動能力降低，影響正常的生活或運動訓(xùn)練[1]。在運動以及恢復(fù)過程中，線粒體作為重要的能量代謝細胞器發(fā)揮著重要作用，因此，本課題組前期對線粒體的損傷進行了研究，發(fā)現(xiàn)運動會引起骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)大小不一、嵴稀少或空泡化、肌膜下聚集等現(xiàn)象[2]；大負荷離心運動后會出現(xiàn)線粒體自噬和細胞凋亡現(xiàn)象[3-4]。有研究指出，線粒體損傷會引起線粒體分裂，而線粒體分裂是導(dǎo)致線粒體自噬和細胞凋亡的重要原因[5-7]，同時粒體分裂增強會使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，片段化線粒體增多，活性氧類物質(zhì)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體功能降低。因此，本研究推測，在進行大負荷離心運動后，骨骼肌線粒體可能會出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，隨后引起線粒體自噬和細胞凋亡，導(dǎo)致線粒體功能下降。

針刺作為傳統(tǒng)治療方法，能夠明顯降低運動性骨骼肌損傷程度[8]，促進機能恢復(fù)且治療效果顯著[9]，有效降低運動后升高的肌張力并改善肌肉疲勞，緩解延遲性肌肉酸痛等運動后的不良反應(yīng)，促進恢復(fù)[10-11]。針刺能夠降低運動后骨骼肌線粒體損傷程度，并對線粒體自噬和細胞凋亡現(xiàn)象起到明顯的改善作用[3-4]。這提示：運動后進行針刺干預(yù)可能影響線粒體的分裂，進而降低線粒體自噬和細胞凋亡，從而促進骨骼肌功能的快速恢復(fù)。

運動后的針刺干預(yù)已有相關(guān)研究，但從骨骼肌線粒體分裂角度進行的探討和研究還相對較少，另外，由于線粒體在運動后一直處在較高的活動水平，有必要進行多時相的檢測，而目前還缺少對離心運動后線粒體多時間點的連續(xù)監(jiān)測。線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（trans?locase of outer membrane 20，TOMM20）為線粒體膜的標志蛋白，可以定位線粒體位置；線粒體分裂動力相關(guān)蛋白1（dynamin-relatedprotein1，DRP1）為線粒體分裂相關(guān)的重要蛋白；FUNDC1 蛋白（FUN14 domain con?taining 1，F(xiàn)UNDC1）為線粒體分裂過程中的關(guān)鍵作用蛋白。因此，本實驗對大鼠進行一次性大負荷離心運動并針刺干預(yù)，觀察比目魚肌線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化，檢測TOMM20 與DRP1 的共定位、FUNDC1 與DRP1 的相互作用，共同確定線粒體分裂情況，以及檢測DRP1蛋白表達水平確定分裂程度，從而探究大負荷離心運動后骨骼肌線粒體的分裂情況及針刺作用效果。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

8周齡雄性SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（使用許可證號：SCXK 京2012-0001），SPF 級別，共計176 只，體重220 ± 9.3g。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度23.5℃± 3.5℃，相對濕度45%～65%，燈光照射為12 h 明暗交替，所有大鼠均為自由進食、飲水。大鼠在北京體育大學標準動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)。本研究獲得倫理委員會批準。

所有大鼠在標準動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天，之后隨機分為安靜對照組（C 組）、單純針刺組（A 組）、單純運動組（E 組）、運動針刺組（EA 組），E、EA 組進行一次性下坡跑離心運動，A、EA 組進行針刺干預(yù)。其中A、E、EA 組根據(jù)實驗要求又分為0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時相亞組，每小組8只，詳見表1。

表1 實驗動物分組（n=8）

1.2 運動方案

模型的預(yù)適應(yīng)期參照趙曉琴的方案進行[4]，為期3天，方式為：單純運動組大鼠在小動物電動跑臺上進行規(guī)定速度的運動，第1 天跑臺坡度為0°，速度為16 m/min，訓(xùn)練5 min；第2 天跑臺坡度為0°，速度為16 m/min，訓(xùn)練10 min；第3 天休息。正式實驗運動方案參照Armstrong[12]經(jīng)典離心運動方式，并參照文獻[13]，構(gòu)建大鼠比目魚肌運動性骨骼肌損傷模型，參數(shù)為：坡度－16°，速度16 m/min，時間90 min。

1.3 針刺方案

具體方案采用丁海麗方法進行[14]，單純針刺組、運動針刺組進行比目魚肌斜刺，其中單純針刺組不進行運動，直接在安靜狀態(tài)下針刺。將大鼠固定好后，小腿三頭肌位置進行消毒，用0.25 mm針灸針[漢醫(yī)牌，津食藥監(jiān)械（準）字2009第2270002號]從遠端進針，沿比目魚肌的位置走向進行30°斜刺，并在肌腹部位留針2 min。

1.4 樣本采集

在每組相應(yīng)的時間點進行比目魚肌取材，每只大鼠電鏡、免疫共沉淀、免疫熒光的樣本均取自同一塊骨骼肌。電鏡樣本：取體積約為1 mm3的比目魚肌，置于4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中備用。免疫共沉淀樣本：取比目魚肌錫紙包裹，轉(zhuǎn)移到－80℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。免疫熒光樣本：取體積約為16 mm3的比目魚肌，OCT 包埋后存于－80℃冰箱備用。線粒體樣本：取100 mg比目魚肌，根據(jù)線粒體分離試劑盒（中國，碧云天公司）的說明書進行提取操作，之后加入儲存液轉(zhuǎn)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測試指標與方法

1.5.1 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

磷酸鹽緩沖液沖洗樣品。鋨酸固定后梯度酒精脫水。環(huán)氧樹脂包埋后切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液染色。樣本充分干燥后通過透射電子顯微鏡進行結(jié)構(gòu)觀察，電鏡（×2000～8000）隨機進行拍攝，采集圖像。

1.5.2 免疫熒光檢測骨骼肌線粒體TOMM20/DRP1的共定位

冰凍切片機進行切片。丙酮液固定。PBS 清洗后滴加5%的羊血清封閉，37℃孵育30 min。滴加5%羊血清稀釋的一抗TOMM20（英國，Abcam 公司）與DRP1（英國，Abcam公司），稀釋比例1︰400，4℃冰箱孵育過夜。移除一抗，PBS 清洗后滴加5%羊血清配制的二抗（中國，伊萊瑞特生物科技股份有限公司），比例1︰250，室溫避光孵育2 h。移除二抗，PBS 清洗后滴加DAPI 封片。激光共聚焦設(shè)置波長為488 和555 兩種，隨機采集視野，IPP6.0軟件進行分析，統(tǒng)計兩種蛋白的共定位百分數(shù)。

1.5.3 免疫共沉淀測定骨骼肌FUNDC1/DRP1 等蛋白的相互結(jié)合作用

比目魚肌加入IP 裂解液，進行剪碎勻漿并離心（12000 g、4℃、10 min）。蛋白稀釋至1 μg/μl，將1 ml樣品中加入1 μl的兔IgG抗體，再加入20 μl珠子，4℃環(huán)境下緩慢混勻2 h，使其進行均勻結(jié)合。離心（14000 g、4℃、10 min），取上清，棄沉淀。加入FUNDC1 抗體（美國，Millipore 公司），并設(shè)置陰性對照組，4℃過夜。加入30 μl 的protein A/G-beads，4℃冰箱孵育2 h，之后離心（14000 g、4℃、10 min），將離心后的沉淀保留，并進行清洗，再加入蛋白上樣緩沖液，95℃煮5 min，保存待測。Western Blot 檢測DRP1 蛋白量。

1.5.4 Western Blot測定線粒體DRP1

比目魚肌剪碎勻漿并離心（12000 g、4℃、10 min），上清液和線粒體樣品分別用BCA 試劑盒進行蛋白定量，加入樣品緩沖液，煮沸5 min 保存。加入樣品。電泳80 V恒壓。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。5%BSA室溫搖床封閉2.5 h。滴加封閉液稀釋的一抗，稀釋比例為DRP1（1︰800）（英國，Abcam 公司），線粒體內(nèi)參COXⅣ（1︰2000），4℃過夜。TBST 清洗后滴加對應(yīng)的二抗（中國，中衫金橋），濃度均為1︰6000，孵育2 h。TBST清洗后滴加發(fā)光液放入成像系統(tǒng)采集圖片。Gel-pro軟件進行分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行分析，所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)± 標準差（±s）表示。對處理方式（運動、針刺）和時相因素（0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）采用雙因素方差分析進行檢驗，若處理方式的主效應(yīng)顯著則進一步執(zhí)行安靜對照組、單純針刺組、單純運動組、運動針刺組等組間的事后多重檢驗。各因素內(nèi)的各個亞組比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 運動及針刺干預(yù)后不同時相骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

骨骼肌線粒體微觀結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果詳見圖1。安靜對照組（圖a、b）骨骼肌線粒體均勻分布于“Z”線兩側(cè)，通過電子密度體銜接，呈串狀分布于肌原纖維之間，線粒體形態(tài)標準，未見明顯的損傷情況和線粒體片段。單純針刺組（圖A0～A72）線粒體在針刺后的0～72 h 并未見明顯變化，形態(tài)完整。單純運動組（圖E0～E72）線粒體在E2組和E6組中結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹，已有少量的線粒體細小片段；E12組明顯增多，存在較多大小不一的線粒體片段，部分線粒體膜結(jié)構(gòu)模糊，并出現(xiàn)大量積聚；E24組細小線粒體數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)不清晰且腫脹；E48 組線粒體細小片段數(shù)量減少；E72 組略有缺失，但結(jié)構(gòu)已趨于完整。運動針刺組（圖EA0～EA72）線粒體EA2、EA6組分別與E2、E6組的變化類似，EA12組線粒體同樣出現(xiàn)較多細小片段，但程度明顯要小于E12組，EA24 組線粒體片段化數(shù)量要少于E24 組，EA48 組僅有少量的線粒體片段存在，且結(jié)構(gòu)已逐漸恢復(fù)，EA72組與安靜對照組相似。

圖1 運動及針刺后不同時相線粒體變化情況

2.2 運動及針刺干預(yù)后不同時相下TOMM20/DRP1共定位變化

見圖2。使用激光共聚焦顯微鏡采集圖像，TOMM20為線粒體膜的標志蛋白，DRP1為線粒體分裂的標志蛋白，TOMM20 和DRP1 發(fā)生共定位呈黃色，說明DRP1 蛋白從胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體。安靜對照組（圖C）未見明顯的黃色熒光。單純針刺組（圖A0～A72）與安靜對照組相比，未見明顯區(qū)別，在A12組偶見黃色熒光顆粒。單純運動組（圖E0～E72）運動后黃色熒光逐漸增多增亮，并在12～24 h 達到峰值，之后開始減少，在E72 組尚能見到黃色熒光。運動針刺組（圖EA0～EA72）變化趨勢與單純運動組相似，但在峰值12～24 h 能明顯發(fā)現(xiàn)黃色熒光弱于單純運動組的12～24 h，在EA72組幾乎未見明顯的黃色熒光結(jié)合點。

采用IPP6.0 軟件對圖像進行分析，統(tǒng)計兩種蛋白的共定位百分數(shù)（表2）。通過雙因素方差分析對處理因素（運動、針刺）進行主效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示存在顯著影響（P<0.01）。事后多重檢驗結(jié)果顯示，安靜對照組和單純針刺組無顯著性差異（P>0.05）；單純運動組高于安靜對照組（P<0.05）；運動針刺組高于安靜對照組和單純針刺組（P<0.05），但顯著低于單純運動組（P<0.05）。

單純針刺組組內(nèi)各時相點之間相比無顯著性差異（P>0.05）；組間相比，各時相點與安靜對照組相比未見顯著性差異（P>0.05）。

單純運動組組內(nèi)各時相比較：運動后0 h、2 h 分別與6 h、12 h、24 h、48 h 等相比，具有顯著性差異（P<0.01）。運動后6 h、12 h、24 h、48 h 分別與72 h相比，具有顯著性差異（P<0.01），其余時相間相比均無顯著性差異（P>0.05）；組間比較：與安靜對照組相比，運動后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 均具有顯著性差異（P<0.01）。

運動針刺組組內(nèi)各時相比較：運動后0 h 與6 h、12 h、24 h、48 h，2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，6 h 與12 h、72 h，24 h 與48 h、72 h，以及48 h 與72 h等相比均具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；組間比較：與安靜對照組相比，運動后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 等時相比值均有顯著性差異（P<0.05），與單純針刺組相比除72 h 外其余所有時相均具有顯著性差異（P<0.05），與單純運動組相比各時相無顯著性差異（P>0.05）。

表2 運動及針刺后不同時相線粒體TOMM20/DRP1共定位比值（n=8）

2.3 運動及針刺干預(yù)后不同時相FUNDC1/DRP1 結(jié)合的變化

FUNDC1 為線粒體蛋白，能夠與胞漿中的線粒體分裂蛋白DRP1 發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致線粒體分裂，采用Gelpro分析軟件對蛋白圖像進行分析，兩者出現(xiàn)共沉淀說明轉(zhuǎn)位到線粒體上的DRP1 蛋白發(fā)揮了分裂作用。不同時相FUNDC1與DRP1結(jié)合的比值變化見表3。

通過雙因素方差分析對處理因素（運動、針刺）進行主效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示存在顯著影響（P<0.01）。事后多重檢驗表明，單純針刺組與安靜對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；單純運動組高于安靜對照組（P<0.05）；運動針刺組明顯高于安靜對照組和單純針刺組（P<0.05），但顯著低于運動組（P<0.05）。

圖2 各組不同時相下骨骼肌TOMM20/DRP1共定位

單純針刺組組內(nèi)各時相比較，2 h 和12 h 具有顯著性差異（P<0.05），其余均無顯著性差異；組間比較，各時相與安靜對照組相比也未表現(xiàn)出差異（P>0.05）。

單純運動組組內(nèi)各時相比較：運動后0 h、2 h 分別與6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相比具有顯著性差異（P<0.05 或P<0.01），運動后6 h 分別與12 h、24 h、48 h、72 h 相比具有顯著性差異（P<0.01），運動后12 h、24 h、48 h、72 h 相互比較均具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），其余時相間相比均無顯著性差異（P>0.05）；組間比較，運動后6 h、12 h、48 h、72 h 顯著高于安靜對照組（P<0.05或P<0.01）。

運動針刺組組內(nèi)各時相比較：運動后0 h、2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h相比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），6 h與12 h、24 h，12 h、24 h與48 h、72 h以及48 h 與72 h 相比也均有顯著性差異（P<0.05 或P<0.01）；組間比較：6 h、12 h、24 h、48 h、72 h比值均顯著高于安靜對照組（P<0.05），2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 比值均顯著高于單純針刺組（P<0.01），2 h、6 h、12 h、24 h、72 時相比值與單純運動組相比具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。

表3 不同時相FUNDC1與DRP1結(jié)合的比值變化（n=8）

2.4 運動及針刺干預(yù)后不同時相線粒體DRP1的變化

采用Gel-pro分析軟件對蛋白圖像進行分析統(tǒng)計，線粒體DRP1 蛋白的表達量是檢測線粒體分裂程度的重要指標。不同時相線粒體DRP1的變化見表4。

通過雙因素方差分析對處理因素（運動、針刺）進行主效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示存在顯著影響（P<0.01）。事后多重檢驗表明，單純針刺組與安靜對照組相比無顯著性差異（P>0.05）；單純運動組高于安靜對照組（P<0.05）；運動針刺組明顯高于安靜對照組和單純針刺組（P<0.05），但與單純運動組相比明顯較低（P<0.05）。

單純針刺組組內(nèi)各時相比較，運動后12 h與0 h、2 h、6 h、48 h、72 h有顯著性差異（P<0.05），其余未見明顯差異（P>0.05）；組間比較，運動后12 h與安靜對照組有顯著性差異（P<0.05）。

單純運動組組內(nèi)各時相比較：運動后0 h 與6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h，6 h與12 h、24 h，12 h、24 h與48 h、72 h相比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；組間比較：運動后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 比值均顯著高于安靜對照組（P<0.05或P<0.01）。

運動針刺組組內(nèi)各時相比較：運動后0 h、2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h相比有顯著性差異（P<0.05），6 h與12 h、24 h、72 h，12 h、24 h與48 h、72 h以及48 h與72 h相比也均有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；組間比較：運動后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h比值均顯著高于安靜對照組（P<0.05 或P<0.01），所有時相均顯著高于單純針刺組（P<0.05或P<0.01），24 h、72 h顯著低于單純運動組（P<0.05）。

表4 不同時相線粒體DRP1蛋白表達量（相對于C組）（n=8）

3 討論

線粒體是重要的細胞器，具有外膜、內(nèi)膜雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠合成ATP為細胞提供能量[15]，并且與生物體的發(fā)育、凋亡、能量代謝等許多生命活動都具有重要關(guān)系[16]，維持著生物體眾多的生理活動。線粒體作為一種動態(tài)變化的細胞器，不斷通過分裂和融合進行信息交流，保持自身結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，以此來實現(xiàn)質(zhì)量控制，維持自身動力學的平衡[17]，其中線粒體分裂決定線粒體形態(tài)、數(shù)量及分布，是影響其功能的重要原因[18]。在大負荷離心運動過程中以及運動后的恢復(fù)期，骨骼肌線粒體會出現(xiàn)不同程度的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，運動后骨骼肌肌漿網(wǎng)腫脹，誘導(dǎo)微管解聚，影響線粒體形態(tài)，表現(xiàn)為出現(xiàn)嚴重的線粒體損傷，隨后經(jīng)初步檢測DRP1的表達，發(fā)現(xiàn)DRP1 蛋白在運動后出現(xiàn)時相性變化[19]，提示骨骼肌線粒體可能發(fā)生分裂現(xiàn)象。本研究從線粒體分裂的角度進一步探究大負荷運動后針刺干預(yù)的作用機制，能夠?qū)ξ⒂^層面有更為全面的了解，并對針刺在離心運動后骨骼肌線粒體損傷、分裂、自噬以及細胞凋亡方面的研究進行補充，形成系統(tǒng)的修復(fù)理論，提高對骨骼肌線粒體功能恢復(fù)和針刺作用機制的深層認識。

透射電鏡能夠觀察到骨骼肌線粒體的超微形態(tài)，線粒體具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在透射電鏡下呈長條狀或卵圓形[20]，長條狀結(jié)構(gòu)完整均勻，粗細一致，膜結(jié)構(gòu)清晰完整；卵圓形則飽滿規(guī)則，對稱分布在“Z”線兩側(cè)。若在肌原纖維間出現(xiàn)大量的細小點狀線粒體，為線粒體完整網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中分裂下來的片段，說明線粒體已發(fā)生分裂現(xiàn)象，可以作為線粒體分裂的直觀證據(jù)[21，22]。在運動后骨骼肌線粒體的透射電鏡研究中，孫良[23]對大鼠進行一次性力竭運動干預(yù)，并在不同時刻觀察肱三頭肌的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)骨骼肌線粒體發(fā)生了不同程度的病理學變化，出現(xiàn)腫脹、空泡化、嵴模糊甚至消失等現(xiàn)象，但該研究未對運動后線粒體片段化進行觀察。

本研究首先通過透射電鏡對運動及針刺后的比目魚肌線粒體進行超微結(jié)構(gòu)觀察，驗證是否存在片段化現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，單純針刺并未引起線粒體數(shù)量明顯的變化，而大負荷離心運動能夠造成線粒體片段化，出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，細小線粒體數(shù)目明顯增多，12 h、24 h 達到峰值，并持續(xù)到運動后48 h，表明離心運動對線粒體形態(tài)和數(shù)量的影響至少持續(xù)至48 h；在運動后72 h出現(xiàn)明顯恢復(fù)，但線粒體略有缺失，可能是由于后續(xù)線粒體自噬或線粒體的融合過程高于分裂過程所致。為了進一步驗證透射電鏡結(jié)果，本研究采用蛋白TOMM20與DRP1 進行免疫熒光雙標實驗，蛋白FUNDC1 與DRP1 進行免疫共沉淀實驗進行驗證。TOMM20 是典型的線粒體定位標志蛋白，DRP1是引起線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白[24]，也是評價線粒體分裂的重要指標[25]，兩種蛋白的共定位百分比增多表明線粒體分裂加強。FUNDC1 是一種在哺乳動物中高度保守的跨膜蛋白，定位于線粒體[26]，磷酸化的FUNDC1與DRP1結(jié)合介導(dǎo)了線粒體分裂和自噬的發(fā)生[27]，兩種蛋白共沉淀增多說明線粒體分裂加強。兩種實驗結(jié)果的變化趨勢均表明，單純進行針刺組未發(fā)現(xiàn)骨骼肌線粒體明顯分裂，單純進行運動組可見分裂現(xiàn)象在運動后0 h 即逐漸增多，在運動后12 h 達到峰值，并持續(xù)至24 h，在48 h、72 h 明顯降低。為了確定各組分裂程度，本研究對線粒體DRP1蛋白進行了檢測。DRP1蛋白作為線粒體分裂的重要蛋白，大量存在于胞漿，通過與其他蛋白的相互作用轉(zhuǎn)運至線粒體外膜上并聚集成點，在三磷酸鳥苷驅(qū)動下形成螺旋狀結(jié)構(gòu)，最終收縮線粒體進行切割，導(dǎo)致線粒體分裂，出現(xiàn)片段化[28]。Jamart 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在禁食狀態(tài)下令小鼠以10 m/min速度進行90 min的低強度運動，在腓腸肌中發(fā)現(xiàn)ULK1、AMPK 磷酸化均未在運動后禁食和喂養(yǎng)兩種條件下出現(xiàn)變化，由于ULK1、AMPK 為DRP1 上游蛋白，其磷酸化影響DRP1的表達，該研究也發(fā)現(xiàn)線粒體分裂標記蛋白DRP1在運動后出現(xiàn)明顯增加。Ding 等[30]令大鼠進行150 min 的劇烈運動，發(fā)現(xiàn)在運動后即刻或恢復(fù)期，骨骼肌細胞中線粒體融合蛋白mRNA 的表達顯著降低，線粒體分裂相關(guān)蛋白表達顯著增加。劉慧君[31]令小鼠進行一次性中等負荷運動，發(fā)現(xiàn)蛋白DRP1 在運動后的60 min、90 min，其mRNA 水平以及蛋白的最終表達水平都升高，提示運動以及運動后骨骼肌線粒體有分裂趨勢。以上研究皆表明，進行一定程度的運動可導(dǎo)致線粒體分裂。本研究提取了骨骼肌線粒體，并進行了蛋白表達水平的檢測。DRP1變化趨勢與透射電鏡、免疫熒光共定位、免疫共沉淀結(jié)果一致，單純進行針刺未引起線粒體明顯分裂，進行大負荷離心運動后骨骼肌線粒體出現(xiàn)分裂現(xiàn)象；在12 h、24 h達到峰值，之后逐漸降低并持續(xù)到48 h，72 h已顯著降低。

大負荷離心運動后針刺骨骼肌進行干預(yù)會對線粒體產(chǎn)生一定的影響。尚畫雨[3]令大鼠進行一次性離心運動，并在運動后進行針刺干預(yù)，透射電鏡下可明顯觀察到運動后線粒體損傷嚴重，自噬體增多，而進行針刺干預(yù)后自噬體顯著降低，損傷較輕，并促進了線粒體的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。在本研究的透射電鏡結(jié)果中，離心運動后進行針刺干預(yù)能夠降低峰值時相線粒體的分裂程度，細小線粒體數(shù)量減少，且在12 h、24 h 峰值時相更為明顯；同時在運動針刺后72 h 恢復(fù)效果更為顯著，形態(tài)上與正常狀態(tài)無異，說明針刺干預(yù)可促進線粒體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，能夠直接反映在微觀結(jié)構(gòu)上。TOMM20 與DRP1 的免疫熒光雙標實驗，蛋白FUNDC1 與DRP1 的免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示，大負荷離心運動后進行針刺干預(yù)，總體變化趨勢與單純運動組基本一致，同樣在12 h、24 h達到峰值，但整體來看線粒體的分裂現(xiàn)象得到明顯改善，尤其是在峰值的時相點分裂明顯降低。兩部分實驗結(jié)果與透射電鏡下的觀察結(jié)果一致，說明針刺干預(yù)可以改善運動所致的線粒體分裂現(xiàn)象。但需要指出的是，在單純運動組和運動針刺組的結(jié)果統(tǒng)計上兩種實驗方法并不完全相同，免疫熒光共定位反映蛋白位置共存，而免疫共沉淀反映的是兩蛋白有無相互結(jié)合，二者所針對問題不同，但均不能進行準確的半定量分析。從本研究中蛋白定量檢測線粒體分裂程度的結(jié)果看，針刺干預(yù)能夠降低線粒體分裂程度，尤其在12 h、24 h 的峰值量更為明顯，在72 h 已接近正常狀態(tài)，并且分裂程度已經(jīng)顯著低于單純運動組，二者共同說明針刺能夠改善離心運動所致的線粒體分裂現(xiàn)象，有利于線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

線粒體通過分裂和融合過程來實現(xiàn)質(zhì)量控制，而大負荷離心運動后0 h～72 h 是骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的關(guān)鍵時間。作為重要的供能細胞器，線粒體在此期間也不斷進行分裂、融合、自噬，甚至引起細胞凋亡。尚畫雨[3]、于瀅[2]、趙曉琴[4]等通過對大鼠進行一次性的大負荷運動，并進行針刺干預(yù)研究，發(fā)現(xiàn)大負荷運動會導(dǎo)致骨骼肌線粒體出現(xiàn)損傷，也會引起線粒體自噬，并導(dǎo)致細胞凋亡，而在運動后進行針刺干預(yù)能夠明顯緩解以上情況。許多研究均指出，線粒體損傷會引起線粒體分裂，而線粒體分裂是導(dǎo)致線粒體自噬和細胞凋亡的重要原因[5，6]。本研究透射電鏡、免疫熒光共定位、免疫共沉淀、DRP1蛋白表達結(jié)果均顯示，運動及針刺后0 h～48 h線粒體均發(fā)生明顯分裂，形成了不同大小的線粒體片段；在峰值變化點上，12 h、24 h 等時相更是變化的關(guān)鍵時相點。綜合本研究的結(jié)果以及以往研究，可見：大負荷離心運動后骨骼肌線粒體出現(xiàn)損傷，之后線粒體發(fā)生分裂，并通過線粒體自噬清除分裂下的損傷線粒體；對于損傷較為嚴重的線粒體，通過分裂直接導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生；而在離心運動后對骨骼肌進行針刺干預(yù)，在一定程度上可降低線粒體損傷，緩解線粒體分裂程度，最終降低線粒體的過度自噬和細胞凋亡，促進線粒體形態(tài)、功能以及骨骼肌機能的恢復(fù)。在離心運動及針刺干預(yù)后的整個過程中，骨骼肌線粒體并不是靜止不變的，而是處在高度活躍中，結(jié)合以往研究可見，大負荷離心運動后線粒體損傷最嚴重的時相點出現(xiàn)在12～24 h[2，3]，而此時間段也是骨骼肌清除碎片的關(guān)鍵時間點，需要線粒體將受損部位分裂下來用于后續(xù)修復(fù)，因此離心運動后及針刺干預(yù)下線粒體分裂的峰值也同樣出現(xiàn)在12～24 h時間段。

需要指出的是，由于離心運動及針刺干預(yù)后線粒體的動態(tài)變化較為明顯，進行前后多時間點的連續(xù)研究顯得尤為重要，建議后續(xù)進行線粒體分裂方面的相關(guān)研究時，若只能取單一時間點時，最好選在運動后12 h，可能會更為準確。本研究還存在一定不足，線粒體分裂-融合是其動力學的重要過程，線粒體的融合與線粒體功能恢復(fù)密不可分，因此檢測線粒體的融合現(xiàn)象也是非常重要的，本課題組將進行相關(guān)后續(xù)研究。

4 結(jié)論

單純針刺未引起線粒體明顯分裂，大負荷離心運動后骨骼肌線粒體出現(xiàn)明顯的分裂現(xiàn)象，并在12 h、24 h 達到峰值，針刺干預(yù)可有效改善運動所致的線粒體片段化，降低了線粒體分裂程度，有利于線粒體的功能恢復(fù)。