張澤鑫，李 攀，馬曉瑞，謝 芳，魏洪帥，朱艷娟，冀蘆沙

(1.聊城大學(xué) 藥學(xué)院,山東 聊城250059；2.銀川市疾病預(yù)防控制中心，寧夏 銀川750000)

0 引言

根據(jù)影像學(xué)和病理學(xué)分類，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌又可以分為肉瘤樣癌、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞未分化癌等，其發(fā)生概率占總肺癌患者的80%-85%[1]?，F(xiàn)階段對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的治療主要以西醫(yī)為主，其中I，II，III A期治療以手術(shù)切除為主，如果沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移，那么切除后就不考慮術(shù)后輔助治療；如果發(fā)生轉(zhuǎn)移，則會(huì)采取術(shù)后輔助治療，比如化療輔助。對(duì)于高危的III B期和IV期，主要采取全身治療，目的是為了減輕患者痛苦，提高其生活質(zhì)量，延長(zhǎng)其生存期[2]。近年來(lái)，隨著中醫(yī)的發(fā)展，越來(lái)越多的患者傾向于采取中西醫(yī)結(jié)合治療的策略。患者手術(shù)后會(huì)通過服用一些補(bǔ)氣益血的中醫(yī)藥來(lái)恢復(fù)機(jī)體正氣，增加機(jī)體免疫力，減少術(shù)后癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。患者在進(jìn)行放療、化療或者分子間靶向治療以及免疫療法時(shí)，也可以服用一些中醫(yī)藥。一是，可以減輕其毒副作用對(duì)機(jī)體的傷害；二是,一些中醫(yī)藥有增強(qiáng)敏感性作用，能夠提高治療效果。對(duì)于一些肺癌晚期患者，手術(shù)治療和輔助治療已經(jīng)沒有意義，此時(shí)也可以采取中醫(yī)藥治療。一是減輕患者疼痛感；二是提高患者生存質(zhì)量；三是延長(zhǎng)患者生命[3]。肺癌是一種常見性的惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。根據(jù)預(yù)測(cè)，到2025年，我國(guó)每年將會(huì)有100萬(wàn)新發(fā)肺癌患者，每年高達(dá)90萬(wàn)人會(huì)死于肺癌，那時(shí)我國(guó)將成為肺癌大國(guó)[4]。因此，尋找治療肺癌的有效方法顯得格外重要。本研究中，我們通過從“聊紅椿”中提取有效成分，作用于非小細(xì)胞肺癌A459細(xì)胞系和肺癌腫瘤模型小鼠，發(fā)現(xiàn)其對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有顯著活性，這為將來(lái)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療提供了新思路。

1 材料

1.1 藥物

“聊紅椿”提取物由本實(shí)驗(yàn)室通過有機(jī)溶劑萃取法提取，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干濃縮，再用常規(guī)水煎，濃縮至0.20 mg/mL，分裝到EP管中，置于4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)研究。非小細(xì)胞肺癌治療藥物順鉑(Cisplatin，DDP)，購(gòu)買于齊魯制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為：411016CE，含量為20 mg/瓶，用細(xì)胞等滲濃度生理鹽水稀釋為0.367 mg/mL。

1.2 動(dòng)物

選取60只SPF級(jí)雄性小鼠，鼠齡6-8 w，重量20 ± 2 g，購(gòu)買于江蘇省常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為：SCXK(蘇)2011-0003，飼養(yǎng)于聊城大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，室溫控制在25 ℃，空氣濕度保持為70%，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中小鼠采取自由飲食和飲水。

1.3 細(xì)胞株

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，編號(hào) CCL-185，培養(yǎng)于含有100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于溫度設(shè)定為37 ℃，CO2含量為50 mL/L的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試劑

臭椿酮，購(gòu)買于上海喬羽生物科技有限公司，分析純；MTT(四甲基偶氮唑鹽)，購(gòu)買于上海Sigma公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)買于Gibco公司；RNA提取液Trizol，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)買于大連TaKaRa公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC購(gòu)買于江蘇碧云天公司；β-actin、 Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved PARP基因引物由上海生工公司合成；裂解 DNA 修復(fù)酶(cleaved PARP)購(gòu)買于美國(guó)Abcam公司；兔抗人β肌動(dòng)蛋白 (β-actin) 抗體、兔抗人 Bcl-2 抗體、兔抗人裂解型caspase-3 (cleaved-caspase-3) 抗體和兔抗人 Bax 抗體均購(gòu)買于萬(wàn)類生物科技公司；甲醇、甲酸等有機(jī)試劑購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.5 儀器

液相色譜LC-20A購(gòu)買于日本島津；熒光定量PCR Prism 7300購(gòu)買于美國(guó)ABI公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱FormaSeries和酶標(biāo)儀Multiskan FC均購(gòu)買于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡CKX-41購(gòu)買于日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀FACS CaliburTMFlow Cytometer REF 34295購(gòu)買于美國(guó)BD公司；低溫高速離心機(jī)Eppendorf Centrifuge5810R購(gòu)買于德國(guó)Eppendorf公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀Mini PROTEAN 3 Cell購(gòu)買于美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)Tanon NIM2045購(gòu)買于中國(guó)Tanon公司。

2 方法

2.1 “聊紅椿”有效成分提取

(1) 稱取新鮮“聊紅椿”和野生型臭椿翅果150 g；(2) 液氮冷凍后研磨成粉末，加入少許無(wú)水乙醇使其充分溶解；(3) 加入200 ml蒸餾水，超聲處理20 min；(4) 將其轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成粉末狀;(5) 稱取0.1 g粉末將其置于1.5 mL EP管中，加入1 mL 75%乙醇，室溫下旋轉(zhuǎn)震蕩抽提12 h；(6) 室溫，12000 rpm，離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中；(7) 用0.22 μm 微孔濾膜過濾，將其轉(zhuǎn)移到HPLC上樣小瓶中，制備成待測(cè)樣品，用于后續(xù)HPLC檢測(cè)。

2.2 HPLC檢測(cè)

色譜儀為島津LC-20A儀器；色譜柱為XTerra (2.1 X 150 mm，C18)；流動(dòng)相 A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240-600 nm；柱溫：常溫；進(jìn)樣量：20 μL；洗脫梯度：0 min A相 10%，B相 90%；20 min A相65%，B相 35%；22 min A相10%，B相 90%；35 min 停止。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞株系用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于5% CO2的培養(yǎng)箱中,37 ℃靜置培養(yǎng)。取A549對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，采用0.25 %胰蛋白酶消化后進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.4 MTT檢測(cè)

將上述培養(yǎng)和處理后的細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100 μL，細(xì)胞密度保持5000個(gè)左右。將不同濃度的“聊紅椿”提取物加入到96孔板中，培養(yǎng)不同時(shí)間，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每孔中加入10 μL 5 g·L-1的MTT溶液(PBS緩沖液配制)，孵育4 h，倒掉上清液。每孔中加入100 μL DMSO，震蕩反應(yīng)10 min。測(cè)定其吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)A549細(xì)胞增殖抑制率。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，將不同濃度的“聊紅椿”提取物加入到96孔板中，培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。具體步驟按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)說(shuō)明書進(jìn)行操作[5]。

2.6 Real-Time PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

(1) 總RNA提取：采用有機(jī)試劑Trizol萃取法，具體步驟參考Trizol提取試劑盒；(2) cDNA反轉(zhuǎn)錄：具體步驟參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒；(3) Real-Time PCR：具體步驟參考TaKaRa 熒光定量PCR試劑盒。

2.7 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，將不同濃度的“聊紅椿”提取物加入到96孔板中，培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。提取各組細(xì)胞總蛋白后，按照相關(guān)方法和步驟檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2.8 肺癌裸小鼠皮下移植瘤模型建立

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，將0.25 %胰蛋白酶消化后，將其制成1×108/mL的細(xì)胞懸浮液。將其通過注射方式接種0.2 mL到裸小鼠右側(cè)頸背交界處皮下，待裸小鼠皮下腫瘤長(zhǎng)成即為模型構(gòu)建成功[6]。

2.9 分組及給藥

裸小鼠模型構(gòu)建過程中，選取60只小鼠，將其分為6組，每組10只，模型對(duì)照組(MC group)，裸小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.5 mL；陽(yáng)性藥物治療組(DDP組)，裸小鼠注射0.5 mL DDP稀釋液；低劑量提取物組(L group)，注射1.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物；中劑量提取物組(M group)，注射2.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物；高劑量提取物組(H group)，注射4.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物；聯(lián)合組(LC group)，注射0.5 mL DDP稀釋液和2.0 mg/kg的“聊紅椿”提取物。注射方式為腹腔注射，每3天注射1次，共注射14次，總計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6 w。6 w后，處死腫瘤小鼠，摘下腫瘤，測(cè)量小鼠體質(zhì)量和腫瘤直徑。

表1 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制影響

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均需要通過SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)。各組數(shù)據(jù)之間采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P< 0.05時(shí)，表示差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。

3 結(jié)果

3.1 “聊紅椿”有效成分HPLC檢測(cè)

結(jié)果如圖1所示，與野生型相比，“聊紅椿”中有效成分臭椿酮含量顯著高于野生型。鑒于之前的報(bào)道，臭椿酮具有很好的抗癌活性。接下來(lái)的研究中，我們重點(diǎn)將“聊紅椿”提取物作用于非小細(xì)胞肺癌，研究其作用效果和分子機(jī)制。

圖1 “聊紅椿”有效成分HPLC檢測(cè)

3.2 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制影響

結(jié)果如表1所示，不同劑量“聊紅椿”提取物組作用A549細(xì)胞株系后，A549細(xì)胞生長(zhǎng)受到非常顯著的抑制，且作用時(shí)間越長(zhǎng)，劑量越高，其抑制效果越好。

3.3 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果如圖2和表2所示，與對(duì)照組相比，不同劑量“聊紅椿”提取物作用A549細(xì)胞株系后，A549細(xì)胞凋亡率明顯增加，且具有顯著的劑量依賴性。

圖2 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

表2 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

3.4 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)的影響

結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，“聊紅椿”提取物處理后，A549中細(xì)胞凋亡因子Caspase-3，Bax，cleaved PARP的mRNA含量顯著下降，抗凋亡因子Bcl-2 mRNA含量顯著增加。

圖3 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.5 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖4所示，“聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞中細(xì)胞凋亡因子蛋白水平表達(dá)的影響與mRNA水平一致。與對(duì)照組相比，Caspase-3，Bax，cleaved PARP的蛋白水平顯著下降，抗凋亡因子Bcl-2的蛋白水平顯著增加。

圖4 “聊紅椿”提取物對(duì)A549細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.6 “聊紅椿”提取物對(duì)裸小鼠體質(zhì)量及腫瘤直徑的影響

結(jié)果如表3所示，“聊紅椿”提取物對(duì)各組小鼠體質(zhì)量影響不顯著，但是顯著影響裸小鼠腫瘤直徑，且具有劑量依賴性。

表3 “聊紅椿”提取物對(duì)裸小鼠體質(zhì)量及腫瘤直徑的影響

4 討論

臭椿Ailanthus altissima(Mill.)Swingle，屬于落葉喬木，也叫椿樹或木礱樹。因其葉基部有腺點(diǎn)，易發(fā)散出臭味而得“臭”字。中醫(yī)研究表明，臭椿樹皮、根皮和莢果等都是中藥材，具有止瀉、止血、清熱燥濕等功效[8]。“聊紅椿”從聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院臭椿培養(yǎng)基地中發(fā)現(xiàn)的一株穩(wěn)定遺傳的臭椿株系，其莢果呈現(xiàn)紅色。臭椿酮(Ailanthone)是從臭椿中提取分離出來(lái)的一種苦味素類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其有多種生物活性，如抗過敏、抗HIV、抗炎癥、抗瘧疾、抗微生物和抗?jié)兊萚9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮還具有抗癌癥、抗病毒和抗結(jié)核病等生物活性[10]。近年來(lái)關(guān)于臭椿酮抗癌活性的報(bào)道越來(lái)越多，如Zhou Z等研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白和CDKs的表達(dá)，誘導(dǎo)p21和p27的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而使得肝癌細(xì)胞處于G0/G1期阻滯，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[11]。He Y等研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮還具有克服藥物治療前列腺癌所產(chǎn)生的耐藥性，同時(shí)還具有抑制前列腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制主要是通過直接結(jié)合p23，進(jìn)而抑制AR(雄激素受體)與HSP90(熱休克蛋白90)的互作，使得AR蛋白發(fā)生不可逆降解，抑制下游基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療前列腺癌的目的[12]。本研究中，我們通過有機(jī)試劑萃取法，HPLC分析發(fā)現(xiàn)“聊紅椿”中主要有效成分為臭椿酮，且其含量遠(yuǎn)高于野生型臭椿，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明“聊紅椿”提取物可能比野生型臭椿株系中醫(yī)藥活性更好。

研究發(fā)現(xiàn)臭椿酮及其衍生物還具有很好的抗肺癌功效，其在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平抗肺癌主要是通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)，抑制下游相關(guān)基因表達(dá)[13]。當(dāng)UPP生物學(xué)行為發(fā)生異常時(shí)，會(huì)造成惡性腫瘤的發(fā)生，這主要是由于當(dāng)UPP蛋白異常時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)與UPP相關(guān)的重要功能蛋白發(fā)生降解，進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂[14]。Ni Z等研究發(fā)現(xiàn)，臭椿酮可以在體外抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，體內(nèi)抑制皮下移植瘤的生長(zhǎng)，能夠顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存質(zhì)量和生存期。對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)臭椿酮主要是通過下調(diào)RPA1(復(fù)制蛋白A1)的蛋白表達(dá)，抑制DNA復(fù)制的發(fā)生，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。本研究中，我們將“聊紅椿”提取物作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)“聊紅椿”提取物能夠顯著抑制A549細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生，具有劑量依賴性。熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“聊紅椿”提取物能夠降低細(xì)胞凋亡因子Caspase-3，Bax，cleaved PARP的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，增加抗凋亡因子Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，具有劑量依賴性。體外成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，“聊紅椿”提取物能夠明顯降低腫瘤細(xì)胞直徑，抑制效果與濃度呈正比。

總之，本研究從一個(gè)新的突變株系“聊紅椿”中提取出有效成分，發(fā)現(xiàn)其中有高含量的臭椿酮，且對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。對(duì)其機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，其通過細(xì)胞凋亡因子起作用。但是本研究仍有不足之處，如“聊紅椿”中提取物如何起作用，后續(xù)仍需要大量研究去確定。