陸 娟，毛旖旎，楊 駿

(西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 北碚 400715)

0 引言

如今，癌癥已經(jīng)成為全世界人們健康的重大威脅之一，每年有無數(shù)人因癌癥失去生命。而傳統(tǒng)的化療、放射性治療、手術(shù)治療等治療方式存在著副作用較大、治療效率低等問題，因此開發(fā)一些新穎有效的癌癥治療方式刻不容緩[1-5]。近年來，光熱治療(photothermal therapy，PTT)因其較低的侵入性在癌癥治療領(lǐng)域引發(fā)了越來越多科學(xué)家的關(guān)注[6-8]。其治療原理是光熱材料在吸收外界的光能之后可以將其有效地轉(zhuǎn)換為熱能，進(jìn)而引發(fā)癌細(xì)胞的凋零或死亡?；诖?，一批又一批優(yōu)良的光熱材料不斷地被挖掘出來，其中包括具有獨(dú)特物理和化學(xué)性能的二元硫?qū)倩衔颷9]。同時(shí)，近紅外光由于其相比于紫外光有更深的生物組織穿透深度，也與癌癥治療緊密地聯(lián)系了起來[10-12]。

利用硒化物Cu2-xSe的光熱效應(yīng)并將其與其他治療試劑結(jié)合。采用了經(jīng)典的高溫?zé)峤夥ê铣闪肆椒植紴?0-40 nm的Cu2-xSe納米粒子，經(jīng)由氨基修飾后負(fù)載上化合物2,2′-偶氮二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(AIPH)，一種能在加熱過程中迅速分解產(chǎn)生有毒烷基的偶氮化合物。由于腫瘤細(xì)胞間隙較大導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境具有高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)，抗腫瘤納米材料會(huì)被動(dòng)、靶向地聚集到腫瘤位點(diǎn)發(fā)揮治療作用；人體正常組織在沒有額外光熱的條件下，其37 ℃左右的體溫是不會(huì)使AIPH分解產(chǎn)生自由基的。因此AIPH本身不會(huì)對(duì)生物體正常組織造成損害。由于銅原子的缺失，Cu2-xSe納米粒子在生物組織穿透力較強(qiáng)的近紅外區(qū)域具有強(qiáng)烈的等離子體激元共振吸收(LSPR)和優(yōu)異的光熱性能，已經(jīng)被越來越多地應(yīng)用于光熱治療領(lǐng)域。本體系合成的Cu2-xSe-AIPH納米粒子在吸收了808 nm的近紅外光后，產(chǎn)生的光熱溫度可以達(dá)到48 ℃，足夠用于光熱治療。在近紅外光的作用下，Cu2-xSe納米粒子的光熱效應(yīng)與AIPH自由基可以發(fā)揮協(xié)同作用殺死腫瘤細(xì)胞，通過體外系列實(shí)驗(yàn)初步證明了Cu2-xSe-AIPH材料的抗癌性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)所用試劑氯化亞銅(CuCl)、氨基化聚乙二醇(NH2-PEG(2000)-NH2)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)以及油胺、十八烯、無水乙醇(C2H5OH)均為分析級(jí)，未進(jìn)一步純化而直接用于實(shí)驗(yàn)過程。所有化學(xué)品均購自Sigma-Aldrich公司。除了從國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司購買的硒粉(Se)。

1.2 制備過程

Cu2-xSe納米粒子是根據(jù)以前的文獻(xiàn)稍作改變，通過典型的溶劑注入法合成的[13]。制備過程主要分為兩個(gè)階段，首先合成Se-OAm(硒-油胺)的前驅(qū)體。稱取10 mmol的硒粉和10 mL的油胺于三口瓶中，搭建好熱解裝置，通氮?dú)猓眉訜崽讓⑵浼訜嶂?40 ℃，保持10 min即可，以除去水分和些許低沸點(diǎn)雜質(zhì)。隨即升溫至320 ℃保持一段時(shí)間，得到的褐色溶液即為前驅(qū)體Se-OAm。第一步恒溫反應(yīng)的同時(shí)，拿取另一個(gè)四口瓶，稱量0.5 mmol CuCl、8 mL十八烯(ODE)與2 mL油胺于其中，同樣在氮?dú)猸h(huán)境下保持10 min，然后升溫至200 ℃時(shí)立即注入上一步制備的Se-OAm溶液，再繼續(xù)升溫至220 ℃反應(yīng)一段時(shí)間。得到的黑棕色溶液用乙醇、環(huán)己烷、乙醇交替洗滌三次即得到Cu2-xSe納米粒子，其中每次洗滌溶劑的用量與反應(yīng)溶液等體積，約為10 mL。接著將合成的Cu2-xSe納米粒子進(jìn)行氨基修飾，提高其親水性以便后面的化合物負(fù)載和測(cè)試應(yīng)用。將制備的納米粒子與10 mg EDS和20 mg NHS于甲醇溶劑中混合，在黑暗環(huán)境中攪拌1.5 h。然后將40 mg的NH2-PEG(2000)-NH2加入上述溶液中，繼續(xù)反應(yīng)12 h后將所得溶液用甲醇和去離子水洗滌離心。隨后，將0.2 g AIPH與氨基化的產(chǎn)物在70 ℃水浴下保持4 h。最后，將反應(yīng)物用乙醇洗滌幾次以除去過量的AIPH，收集沉淀物即可[14]。

1.3 性質(zhì)表征

使用Rigaku D/max-TTR-Ⅲ衍射儀(Cu-Kα輻射λ=0.15405 nm)進(jìn)行物相分析，掃描范圍2θ=10°-90°，掃描速度為10°/min；使用FEI Tecnai G2S-Twin透射電子顯微鏡進(jìn)行形貌觀察(樣品先分散在環(huán)己烷或者乙醇溶劑中，然后滴在碳支持膜上待溶劑揮發(fā)后進(jìn)行觀察)；在Leica SP8設(shè)備上進(jìn)行共聚焦激光掃描顯微觀察(CLSM)；使用表面分析系統(tǒng)(Thermofisher Escalab Xi+)進(jìn)行X光電子能譜(XPS)測(cè)試，測(cè)試時(shí)使用來自單色X射線源的AlKα輻射(hν=1486.6 eV)和500μm的光斑大小。以上表征均在室溫下完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌、物相和元素分析

圖1(a)是第一步高溫?zé)峤夥ê铣傻漠a(chǎn)物的XRD衍射圖譜，可以看到，產(chǎn)物的XRD圖譜展示出了主要特征峰的位置和相對(duì)強(qiáng)度，且與Cu2-xSe的標(biāo)準(zhǔn)圖譜(JCPDS No.06-0680)匹配得很好，這證明了結(jié)晶性良好的Cu2-xSe晶體的成功合成。

圖1 (a) Cu2-xSe納米粒子的XRD衍射圖；(b) Cu2-xSe、Cu2-xSe-AIPH納米粒子的動(dòng)力學(xué)光散射粒徑分布圖

圖2展示了Cu2-xSe與Cu2-xSe-AIPH納米粒子的形貌。從圖2(a)中可以清楚地看到，高溫?zé)峤庵苽涞腃u2-xSe納米粒子的粒徑分布為20-40 nm，形貌大多為四方形或球形，輪廓清晰可見。而經(jīng)過轉(zhuǎn)水和負(fù)載AIPH之后，從圖2(b)可以看到，粒子的粒徑增大到80 nm左右，且形貌轉(zhuǎn)變?yōu)閱我坏那蛐巍＝?jīng)過分析可知，納米粒子前后粒徑的增加可能是由于油性的Cu2-xSe納米粒子在后續(xù)水溶液反應(yīng)過程中發(fā)生了一定程度的聚沉。圖3的Cu、Se、C、N、O元素的映射圖也進(jìn)一步驗(yàn)證了產(chǎn)物的成功合成。圖1(b)是Cu2-xSe和Cu2-xSe-AIPH的動(dòng)力學(xué)光散射粒徑分布圖，從圖中可以看到粒子的粒徑與之前透射圖中的數(shù)值基本一致。

圖2 (a) Cu2-xSe納米粒子的TEM；(b) Cu2-xSe-AIPH納米粒子的TEM

圖4 (a)Cu2-xSe-AIPH納米粒子中Cu 2p；(b)Se 3d的XPS譜圖

圖5 反應(yīng)過程中每一步產(chǎn)物的(a)Zeta電位變化圖；(b)AIPH的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線

圖4是Cu2-xSe-AIPH納米粒子中Cu、Se元素的XPS分譜譜圖。特定地，圖4(a)中Cu 2p特征峰的結(jié)合能為952.2、932.4 eV，證明了材料中一價(jià)銅的存在；圖4(b)中Se 3d特征峰的結(jié)合能為54.7 eV，證明了材料中硒元素的價(jià)態(tài)是負(fù)二價(jià)。反應(yīng)過程中Zeta電位的變化也佐證了每一步反應(yīng)的進(jìn)行。圖5(a)是每一步反應(yīng)產(chǎn)物水溶液(Cu2-xSe、NH2-Cu2-xSe、Cu2-xSe-AIPH)的Zeta電位變化圖?？梢钥吹?，初始Cu2-xSe粒子溶液的電勢(shì)為-10.35 mV，引入氨基后材料的電勢(shì)有了明顯的增大(-1.3 mV)，最后擔(dān)載完AIPH材料的Cu2-xSe-AIPH的電勢(shì)進(jìn)一步增大至16 mV。而Zeta電位的數(shù)值在某種程度上可以反映體系的穩(wěn)定性，Zeta電位值(正或負(fù))越低，吸引力超過了排斥力，體系中納米粒子越傾向于凝聚。因此結(jié)合Zeta電位數(shù)值的變化可以從一定程度上解釋透射圖中粒子粒徑與形貌的變化。剛開始Cu2-xSe粒子溶液的電勢(shì)為-10.35 mV，粒子開始有聚沉傾向，但還較為穩(wěn)定；在水溶液中修飾氨基后材料的電勢(shì)變?yōu)?1.3 mV，Zeta電位負(fù)值變低了，體系開始變得不穩(wěn)定，粒子會(huì)發(fā)生一定程度的聚沉；最終Cu2-xSe-AIPH材料的Zeta電位變?yōu)?6 mV，Zeta電位正值較高，體系又逐漸趨于穩(wěn)定。四方形或球形的Cu2-xSe粒子在溶液中發(fā)生聚沉后，導(dǎo)致最終材料的粒徑增大，形貌轉(zhuǎn)變?yōu)閱我坏那蛐巍?/p>

圖6 Cu2-xSe、Cu2-xSe-AIPH和AIPH的紫外-可見吸收曲線(a);45 ℃加熱時(shí)AIPH與ABTS的反應(yīng)曲線(b)

圖5(b)是擔(dān)載的化合物AIPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖可以得到AIPH的濃度(X)與其紫外-可見吸光度(Y)的線性關(guān)系為：Y=0.01207X-0.05899。圖6(a)是Cu2-xSe材料擔(dān)載AIPH前后的紫外-可見吸收曲線，可以看到，相比于Cu2-xSe納米粒子的吸收曲線，Cu2-xSe-AIPH的吸收曲線在360 nm處出現(xiàn)了AIPH的特征吸收峰，證明了AIPH的成功擔(dān)載。結(jié)合由AIPH標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的線性關(guān)系，可以計(jì)算出AIPH的擔(dān)載量為8.1%。為了驗(yàn)證AIPH自由基的生成，將1 mg/mL 2,2′-偶氮二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)和相同濃度的Cu2-xSe-AIPH在45 ℃的水浴條件下反應(yīng)了2 h，測(cè)定了反應(yīng)溶液的紫外-可見吸收光譜。如圖6(b)是反應(yīng)產(chǎn)物ABTS的特征吸收曲線，證明在45 ℃的加熱條件下AIPH分解生成了自由基，其進(jìn)一步與ABTS反應(yīng)從而生成了ABTS自由基。

2.2 光熱轉(zhuǎn)換性能

由于納米粒子的光熱效應(yīng)對(duì)后續(xù)的腫瘤細(xì)胞的治療起到關(guān)鍵作用，首先在水溶液中探究了合成材料的相關(guān)光熱性質(zhì)[15-17]。在近紅外光(808 nm)照射下，使用紅外熱成像儀記錄的Cu2-xSe、Cu2-xSe-AIPH溶液和溶劑水的溫度變化曲線展示在圖7(a)中?？梢悦黠@地看出，溶劑水的溫度基本在室溫上下浮動(dòng)，而Cu2-xSe、Cu2-xSe-AIPH材料在808 nm激光的照射下溶液溫度有了明顯的升高，這初步證明了材料的光熱轉(zhuǎn)換能力。而且在較短的5 min時(shí)間內(nèi)，材料的溫度均可以達(dá)到48 ℃或以上，滿足了體內(nèi)外癌細(xì)胞治療的溫度要求。后續(xù)氨基的連接和AIPH的負(fù)載可能會(huì)在一定程度上阻擋光熱劑Cu2-xSe對(duì)近紅外光的吸收，但令人高興的是，相比于光熱劑Cu2-xSe，Cu2-xSe-AIPH納米粒子每隔50 s的溫度上升速度以及最終的穩(wěn)定溫度值也只有輕微程度的下降，并不影響材料的性能及應(yīng)用[18]。

圖7 (a) 808 nm激光照射時(shí)Cu2-xSe、Cu2-xSe-AIPH溶液和水的升溫曲線；(b) 不同濃度的Cu2-xSe-AIPH溶液的溫度隨808 nm輻射時(shí)間的變化曲線。所有激光功率均為1 W/cm2

接著進(jìn)一步探究了不同濃度(31.25、62.5、125、250、500μg/mL)的Cu2-xSe-AIPH溶液在500 s的輻射時(shí)間內(nèi)的溫度變化。由圖7(b)可知，每組溶液的溫度都隨著紅外光照射時(shí)間的延長而有規(guī)律地升高，并且溶液的濃度越大，升溫的速度越快。當(dāng)材料濃度為31.25 μg/mL時(shí)，升溫速度最小，最終的穩(wěn)定溫度只有33 ℃左右，不及人體正常體溫；而當(dāng)材料濃度為500μg/mL時(shí)，升溫速度最大，最終的穩(wěn)定溫度可達(dá)48 ℃左右，足夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋零死亡[19,20]。

圖8 Cu2-xSe-AIPH材料(500 μg/mL) 的紅外熱成像圖

為了更加直觀地觀察Cu2-xSe-AIPH材料的光熱效應(yīng)，我們使用紅外熱成像儀記錄了500μg/mL的材料在808 nm激光照射5 min的時(shí)間內(nèi)每一分鐘的紅外熱成像圖片。由圖8可知，隨著時(shí)間的延長，材料熱成像圖片的顏色逐漸由淺黃轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t直至白熱化的顏色狀態(tài)，由此可以確定材料在吸收了近紅外光之后能產(chǎn)生大量的熱量致使溶液溫度有顯著的提高。與標(biāo)準(zhǔn)溫度條對(duì)比之后可以大致判斷出材料最終的光熱溫度可達(dá)48 ℃左右。由以上測(cè)試可知，Cu2-xSe-AIPH納米材料可以有效地將近紅外光轉(zhuǎn)換為熱能，因而具有光熱治療的潛力。

2.3 體外抗癌性能研究

在進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)之前，必須要對(duì)材料的生物相容性進(jìn)行有效的評(píng)估，以免對(duì)生物體造成不必要的副作用[21]。將不同濃度(15.6、31.3、62.5、125、250、500μg/mL)的Cu2-xSe-AIPH材料與L929成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，通過MTT分析評(píng)估了細(xì)胞的生物相容性。如圖9(a)是與不同濃度的Cu2-xSe-AIPH納米材料培養(yǎng)后細(xì)胞的狀態(tài)，可以看到，即使材料濃度高達(dá)500μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率仍然高達(dá)85%，這初步證明了Cu2-xSe-AIPH納米材料有著良好的生物相容性。

緊接著，用類似的MTT法分析了納米粒子對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性，圖9(b)是不同條件下培養(yǎng)相同時(shí)間后的HeLa細(xì)胞的存活率柱狀圖。如圖所示，將細(xì)胞分成了四組，分別是：AIPH、NIR、Cu2-xSe+NIR、Cu2-xSe-AIPH+NIR。由圖可知，所有AIPH、NIR組的細(xì)胞的存活率均可達(dá)到95%以上，證明單獨(dú)的AIPH培養(yǎng)或者紅外光照射對(duì)細(xì)胞基本沒有影響。Cu2-xSe+NIR組的細(xì)胞存活率降至50%左右(濃度為500μg/mL時(shí))，這歸因于Cu2-xSe納米粒子在近紅外光作用下良好的光熱性能；而Cu2-xSe-AIPH+NIR組的細(xì)胞存活率可降至20%(濃度為500μg/mL時(shí))。由分析可知，這是由于相對(duì)于Cu2-xSe+NIR而言，Cu2-xSe-AIPH材料中的AIPH在Cu2-xSe的光熱作用下還可以分解成自由基，二者的協(xié)同作用進(jìn)一步增強(qiáng)了體系殺死癌細(xì)胞的能力[22,23]。

圖9 (a) 不同濃度的Cu2-xSe-AIPH納米材料的生物相容性；(b) 不同濃度的Cu2-xSe和Cu2-xSe-AIPH納米粒子對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性

為了更直觀地說明以上細(xì)胞毒性的結(jié)果，使用碘化丙啶(PI)進(jìn)行了染色實(shí)驗(yàn)(該染色法只能用紅色標(biāo)記死細(xì)胞)[24,25]。如圖10是不同培育條件下HeLa細(xì)胞的CLSM圖像，同細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行類似的培養(yǎng)后，染色實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果，即：AIPH、NIR分組中，死亡的紅色細(xì)胞數(shù)最少；Cu2-xSe-AIPH+NIR死亡的紅色細(xì)胞數(shù)最多即治療效果最好，Cu2-xSe+NIR次之。綜上所述，以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以初步證明Cu2-xSe-AIPH材料有著良好的生物相容性和抗癌性能[26]。

圖10 不同條件培育下的HeLa細(xì)胞的CLSM圖像(所有圖像的比例尺均為100 μm)

3 結(jié)論

總而言之，一系列實(shí)驗(yàn)探究證明了構(gòu)建的Cu2-xSe-AIPH體系光熱轉(zhuǎn)換溫度高達(dá)48 ℃，可用于光熱治療；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明材料的生物相容性較好，材料濃度為500μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率高達(dá)85%；材料濃度為500μg/mL時(shí)，Cu2-xSe-AIPH+NIR組癌細(xì)胞存活率可降至20%。以上這些工作表明Cu2-xSe-AIPH材料具有腫瘤治療的潛力，可進(jìn)一步發(fā)展生物應(yīng)用。