任敏 李琳 梁向清

(綿陽市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，四川 綿陽 621000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD，簡稱慢阻肺)是一種以持續(xù)呼吸癥狀、氣道和(或)肺泡異常所致的進行性氣流受限為特征的常見疾病，通常由于肺部對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應引起[1-2]。慢阻肺可增加罹患心血管疾病風險，已成為導致全球人類死亡的第四大原因[3-4]。目前，β2激動劑和長效抗膽堿能藥物對慢阻肺具有一定治療作用，但其效果并不理想。因此，探索慢阻肺發(fā)展的分子機制、尋找有效的治療策略是臨床亟待解決的重大課題。微小RNA(miRNA)是一種進化較保守的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過調(diào)控靶基因表達在多種人類疾病中發(fā)揮重要作用。大量研究證實，miRNA表達失調(diào)與慢阻肺發(fā)生發(fā)展密不可分[5-6]。Conickx G等[7]證實miR-218-5p在慢阻肺患者支氣管上皮細胞中表達降低，其表達水平與氣道阻塞密切相關(guān)，高表達miR-218-5p對香煙煙霧所致炎癥和慢阻肺具有保護作用。然而miR-218-5p的直接靶點及其在慢阻肺中的作用機制仍有待進一步研究。生物信息學分析預測miR-218-5p可直接與lin28b的3′非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)結(jié)合，該基因常在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中過度表達，并與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[8-9]。因此，本研究探討miR-218-5p在香煙煙霧提取物(Cigarette smoke extract，CSE)誘導的氣道上皮細胞凋亡和炎癥反應的作用和分子機制，以期為慢阻肺的靶向分子治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肺支氣管上皮細胞BEAS-2B購于南京科佰生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶購于美國Life Technologies公司；芙蓉王香煙(烤煙型10 mg)購于湖南中煙工業(yè)有限責任公司；人白細胞介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司；miR-218-5p模擬物(miR-218-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、LIN28B小干擾RNA(si-LIN28B)及其陰性對照(si-NC)、LIN28B過表達質(zhì)粒(pcDNA-LIN28B)及其陰性對照(pcDNA-NC)、實驗引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供；放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液、聚偏氟乙烯膜購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔源LIN28B、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)、β連環(huán)蛋白(β-actin)單抗以及山羊抗兔二抗購于美國Abcam公司。

1.2 香煙煙霧提取物(CSE)制備 采用30 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液對10根卷煙進行冒煙實驗。將得到的懸浮液經(jīng)過濾滅菌，并確定為100%的CSE溶液。利用RPMI-1640培養(yǎng)液將CSE溶液稀釋至2.5%，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗分組和處理 BEAS-2B細胞復蘇后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，制成細胞懸液后，置于37 ℃、含5% CO2、濕潤的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng),每隔2～3 d換培養(yǎng)液1次，當細胞生長達到80%～90%融合時進行實驗干預。將BEAS-2B細胞分為正常對照組(NC組即正常培養(yǎng)的細胞)、CSE組(采用2.5% CSE溶液處理BEAS-2B細胞)、miR-NC+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-218-5p+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics)、si-NC+CSE組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-LIN28B+CSE組(轉(zhuǎn)染si-LIN28B)、miR-218-5p+pcDNA-NC+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics+pcDNA-NC)和miR-218-5p+pcDNA-LIN28B+CSE組(轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimics+pcDNA-LIN28B)，進行2.5%CSE溶液干預處理。細胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000說明書進行。

1.4 RNA提取和實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 采用TRIzol試劑從各組BEAS-2B細胞中提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶將其轉(zhuǎn)化為cDNA，在ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)上進行RT-qPCR。分別以U6和β-actin為內(nèi)源性對照，2-ΔΔCT法計算miR-218-5p和LIN28B的相對表達水平。miR-218-5p上游引物：5′-CGAGTGCATTTGTGCTTGATCTA-3′,下游引物：5′-TAATGGTCGAACGCCTAACGTC-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.5 Western blot檢測LIN28B和Cleaved-caspase-3的表達 用RIPA緩沖液制備總蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h；用抗LIN28B抗體、抗Cleaved-caspase-3抗體4 ℃條件下孵育過夜；在室溫下與相應的二抗孵育1 h；用增強型化學發(fā)光試劑盒進行顯影；以目標蛋白和β-actin蛋白灰度值比值表示目標蛋白表達水平。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 采用0.25%的胰酶消化后，室溫下離心收集各組BEAS-2B細胞。預冷1×PBS洗滌細胞。加入300 μL的1×結(jié)合緩沖液懸浮細胞。加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光室溫孵育15 min；加入5 μL的PI染色5 min，補加200 μL的1×結(jié)合緩沖液，混勻后上機檢測。

1.7 ELISA法檢測IL-6和TGF-β1表達水平 BEAS-2B細胞按照上述分組進行處理后，收集細胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和TGF-β1的表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 含有miR-218-5p相關(guān)結(jié)合位點的野生型熒光素酶報告質(zhì)粒(WT-LIN28B)、含有miR-218-5p相關(guān)結(jié)合位點突變序列的突變型熒光素酶報告質(zhì)粒(MUT-LIN28B)構(gòu)建由上海吉瑪制藥有限公司提供。將MUT-LIN28B或WT-LIN28B分別與miR-218-5p mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染BEAS-2B，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 CSE對氣道上皮細胞BEAS-2B中miR-218-5p和LIN28B表達的影響 與NC組比較，CSE組氣道上皮細胞BEAS-2B中miR-218-5p(0.40±0.04 vs 1.00±0.10)的表達顯著降低，LIN28B在mRNA(2.76±0.28 vs 1.01±0.10)和蛋白(0.86±0.09 vs 0.34±0.03)水平的表達顯著升高(P<0.05)，見圖1、圖2。

圖1 Western blot檢測LIN28B的蛋白表達量Figure 1 Western blot detects the expression of LIN28B protein

圖2 RT-qPCR檢測miR-218-5p和LIN28B mRNA表達水平Figure 2 RT-qPCR detects expression levels of miR-218-5p and LIN28B mRNA注：1.NC組；2.CSE組。miR-218-5p 140bp；LIN28B mRNA 180bp

2.2 過表達miR-218-5p對CSE誘導的氣道上皮細胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響 與NC組比較，CSE組BEAS-2B細胞凋亡率顯著增加，Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著增加，IL-6和TGF-β1表達顯著增加，miR-218-5p表達顯著降低(P<0.05)；與miR-NC+CSE組比較，miR-218-5p+CSE組BEAS-2B細胞miR-218-5p表達顯著增加，細胞凋亡率顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低，IL-6和TGF-β1表達顯著降低(P<0.05)，見表1、圖3、圖4。

圖3 過表達miR-218-5p對CSE誘導的氣道上皮細胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Figure 3 Effect of overexpressing miR-218-5p on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors注：A.流式細胞儀檢測細胞凋亡;B.Western Blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達

圖4 RT-qPCR檢測miR-218-5p表達水平Figure 4 RT-qPCR detects the expression level of miR-218-5p注：1.NC組；2.CSE組；3.miR-NC+CSE組；4.miR-218-5p+CSE組

表1 過表達miR-218-5p對CSE誘導的氣道上皮細胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Table 1 Effect of overexpressing miR-218-5p on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors

2.3 低表達LIN28B對CSE誘導的氣道上皮細胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響 與si-NC+CSE組比較，si-LIN28B+CSE組BEAS-2B細胞LIN28B表達顯著降低，細胞凋亡率顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低，IL-6和TGF-β1表達顯著降低(均P<0.05)，見表2、圖5。

表2 低表達LIN28B對CSE誘導的氣道上皮細胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Table 2 Effect of low expression of LIN28B on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors

圖5 Western Blot檢測LIN28B、Cleaved-caspase-3表達Figure 5 Western Blot detects the expression of LIN28B,Cleaved-caspase-3

2.4 miR-218-5p靶向LIN28B starbase預測顯示miR-218-5p與LIN28B之間存在部分連續(xù)互補結(jié)合位點(見圖6A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與miR-NC和WT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組比較，miR-218-5p mimics和WT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組BEAS-2B細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組比較，miR-218-5p mimics和MUTT-LIN28B共轉(zhuǎn)染組BEAS-2B細胞的熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)(見表3)。Western blot檢測顯示，與miR-NC比較，miR-218-5p BEAS-2B細胞LIN28B蛋白(0.18±0.02 vs 0.39±0.04)表達顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC比較，anti-miR-218-5p BEAS-2B細胞LIN28B蛋白(0.68±0.07 vs 0.35±0.03)表達顯著升高(P<0.05)(見圖6B)。以上結(jié)果表明miR-218-5p靶向LIN28B并負調(diào)控其表達。

圖6 miR-218-5p靶向調(diào)控LIN28B表達Figure 6 miR-218-5p targets to regulate LIN28B expression注：A.starbase對miR-218-5p和LIN28B結(jié)合進行預測示意圖;B.Western Blot檢測LIN28B蛋白表達量

表3 miR-NC或miR-218-5p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BEAS-2B細胞后雙熒光素酶活性檢測Table 3 Dual luciferase activity detection after co-transfection of BEAR-2B cells with miR-NC or miR-218-5p and reporter plasmid

2.5 高表達LIN28B可以逆轉(zhuǎn)miR-218-5p對CSE誘導氣道上皮細胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響 與miR-218-5p+pcDNA-NC+CSE組比較，miR-218-5p+pcDNA-LIN28B+CSE組BEAS-2B細胞LIN28B蛋白表達顯著增加，細胞凋亡率顯著增加，Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著增加，IL-6和TGF-β1表達顯著增加(均P<0.05)，見表4、圖7。

表4 高表達LIN28B可以逆轉(zhuǎn)miR-218-5p對CSE誘導氣道上皮細胞BEAS-2B凋亡和炎癥因子的影響Table 4 High expression of LIN28B reverses the effect of miR-218-5p on CSE-induced apoptosis of airway epithelial cells BEAS-2B and inflammatory factors

圖7 Western Blot檢測LIN28B、Cleaved-caspase-3表達Figure 7 Western Blot detects the expression of LIN28B,Cleaned-caspase-3

3 討論

目前，全球慢阻肺發(fā)病率呈上漲態(tài)勢，尤其在發(fā)展中國家。有報道指出，我國40歲以上人群慢阻肺發(fā)病率高達13.7%，嚴重危害人民生命健康和生活質(zhì)量[10]。因此，研究慢阻肺發(fā)展機制，優(yōu)化治療方案迫在眉睫。近年來，新的證據(jù)表明miRNA在慢阻肺中起著至關(guān)重要的作用[11-14]。Du等[15]研究顯示miR-181c在慢阻肺患者肺組織中明顯降低，高表達miR-181c表達可抑制中性粒細胞浸潤、活性氧生成和炎性因子分泌，降低CSE誘導的炎癥反應，而抑制miR-181c表達則產(chǎn)生相反作用。Gu等[16]報道m(xù)iR-145-5p高表達可抑制慢阻肺患者氣道重塑和炎癥反應。本研究發(fā)現(xiàn)CSE誘導后BEAS-2B細胞中miR-218-5p表達顯著降低，過表達miR-218-5p可減輕CSE誘導的BEAS-2B細胞凋亡。CSE干預后BEAS-2B細胞上清液中IL-6和TGF-β1水平升高，而過表達miR-218-5p可降低炎性因子IL-6和TGF-β1水平，與miR-218-5p對慢阻肺的保護作用一致[7,17]。此外，在納米SiO2誘導的肺損傷中也發(fā)現(xiàn)miR-145-5p表達譜改變[18]。Cleaved-caspase-3是細胞凋亡發(fā)生的最終效應因子，CSE誘導后BEAS-2B細胞Cleaved-caspase-3表達顯著增加，而過表達miR-218-5p可降低Cleaved-caspase-3表達水平，提示miR-218-5p可能通過調(diào)控Cleaved-caspase-3表達引起B(yǎng)EAS-2B細胞增殖和凋亡失衡進而參與慢阻肺進展。

Lin28b是一種進化高度保守的RNA結(jié)合蛋白，其與Lin28蛋白家族成員Lin28a具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。然而Lin28b主要存在于細胞核中，而Lin28a只存在于細胞質(zhì)中。自從在肝癌中發(fā)現(xiàn)Lin28b過表達后，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)Lin28b也存在過表達現(xiàn)象，且與神經(jīng)母細胞瘤的誘導有關(guān)，通過let-7依賴性和非依賴性機制促進腫瘤進展[19-23]。此外，有研究報道通過下調(diào)Lin28b還可有效抑制肺部炎性損傷[24]。于是本研究推測Lin28b可能與慢阻肺相關(guān)。CSE誘導后BEAS-2B細胞中Lin28b的表達顯著增加，與miR-218-5p表達趨勢相反。抑制Lin28b可減輕CSE誘導的BEAS-2B細胞凋亡，并降低Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1水平。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-218-5p通過直接靶向Lin28b mRNA的3′-UTR來調(diào)控Lin28b的表達。miR-218-5p的下調(diào)促進Lin28b的表達，而miR-218-5p上調(diào)則抑制Lin28b表達。此外，恢復實驗顯示過表達Lin28b可逆轉(zhuǎn)miR-218-5p過表達對CSE誘導的BEAS-2B細胞凋亡和炎性因子的影響。

4 結(jié)論

miR-218-5p通過靶向Lin28b可減輕CSE誘導的氣道上皮細胞凋亡，降低炎性因子IL-6和TGF-β1的表達水平。因此，靶向miR-218-5p/Lin28b軸的調(diào)節(jié)有望為慢阻肺的治療提供新的方向。