宋建剛 高永偉 劉慶 賈鯤鵬 龐隨軍 李元霞

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科,陜西 延安 716000)

哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病，其特征在于可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性[1]。炎癥細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)引起持續(xù)的氣道慢性炎癥，從而在哮喘過程中觸發(fā)支氣管收縮和氣道結(jié)構(gòu)變化[2]，后者最初是作為響應(yīng)炎癥引起的氣道壁損傷而啟動(dòng)的修復(fù)過程，然而，這種修復(fù)過程的失調(diào)導(dǎo)致氣道重塑[3]。近年來我國(guó)小兒哮喘的患病率顯著增加，為個(gè)人、家庭、社會(huì)均帶來了巨大的負(fù)擔(dān)[4-5]。因此，研究新的哮喘診斷和預(yù)后靶點(diǎn)以及開發(fā)新的治療策略以逆轉(zhuǎn)氣道重塑至關(guān)重要。

MicroRNA(微小RNA，miRNA)是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的一大家族，其長(zhǎng)度約為21個(gè)核苷酸，可控制真核生物中的許多細(xì)胞和發(fā)育過程[6]。新的研究表明，多種miRNA的表達(dá)水平與哮喘和氣道炎癥有關(guān)，包括miR-21、miR-223和miR-142-3p[7]。miR-22是多種細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的抑制因子。研究[8]表明，miR-22可以抑制RASF滑膜成纖維細(xì)胞增殖和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-22前提的3p臂成熟體miR-22-3p可抑制肝癌[9]、結(jié)腸癌[10]、胃癌細(xì)胞的增殖[11]。研究表明miR-22-3p能夠調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，該過程是通過負(fù)調(diào)節(jié)神經(jīng)激肽受體1(neurokinin receptor 1,NK1R)發(fā)揮作用[12]。研究表明，感覺神經(jīng)肽NK1R與小兒哮喘的發(fā)作及緩解關(guān)系極為密切[13]，例如豚鼠哮喘模型急性期的支氣管中NK1R的表達(dá)增多，而且在藥物作用下可以抑制哮喘大鼠模型中的NK1R表達(dá)[14-15]。但其在哮喘氣道重塑中是否受到miRNA調(diào)節(jié)仍不明確。因此，本研究探討miR-22-3p在幼年哮喘大鼠氣道重塑過程中是否靶向調(diào)節(jié)NK1R，為確定新的幼小兒哮喘預(yù)后和治療靶標(biāo)提供前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 OVA購(gòu)買于上海生工生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：A003056-0100)；氫氧化鋁購(gòu)買于北京Solarbio科學(xué)技術(shù)公司(貨號(hào)：A7130)；TRIzol試劑盒購(gòu)買于美國(guó)的英杰公司(貨號(hào)：15596018)；大鼠氣道平滑肌細(xì)胞(Rat airway smooth muscle cells,RASMCs)購(gòu)買于美國(guó)培養(yǎng)物保藏中心(貨號(hào)：#AC340472)；TIANamp基因組DNA試劑盒購(gòu)于北京天根生物技術(shù)公司(貨號(hào)：DP348)；熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒購(gòu)買于美國(guó)普洛麥格公司(貨號(hào)：E1310)；NK1R，β-actin的抗體和第二抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab183713，ab115777)。

1.2 動(dòng)物分組 48只體重62 ～79 g的5周齡的無特定病原體(SPF)等級(jí)幼年雌性Wistar大鼠(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心提供)，飼養(yǎng)、飲水、光照和溫度均保持在恒定水平，所有動(dòng)物均在SPF條件下飼養(yǎng)。設(shè)施中的環(huán)境條件符合“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)環(huán)境和住房設(shè)施的要求(GB14925-2001)”中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隔離設(shè)施的相關(guān)準(zhǔn)則。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、模型+mimic組、模型+mimic-NC組、模型+inhibitor組、模型+inhibitor-NC組，每組各8只。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建和治療 大鼠接受適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。適應(yīng)后第1 d開始，給大鼠1 mL誘導(dǎo)劑(包含100 mg卵白蛋白和200 mg 氫氧化鋁，腹腔注射)。15 d開始暴露。將大鼠置于一個(gè)特殊的密閉玻璃容器中(20 cm×20 cm×20 cm)，將含有1%中的OVA的50 mL 生理鹽水注入進(jìn)行霧化激發(fā)，將大鼠每周3次暴露于這種治療30 min，連續(xù)8周。對(duì)照組僅接受生理鹽水注射。在暴露期后24 h內(nèi)處死大鼠[16]。另外，模型+mimic組、模型+mimic-NC組、模型+inhibitor組、模型+inhibitor-NC組對(duì)大鼠的處理為大鼠每次激發(fā)前1 h內(nèi)分別尾靜脈注射1 mL的mimic、mimic-NC、inhibitor、inhibitor-NC，濃度均為(10 μg/mL)[17-18]。分離氣管、支氣管和肺組織，結(jié)扎后取出右中肺。將肺標(biāo)本保存在4%多聚甲醛中，隨后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片和蘇木精-伊紅(H&E)染色。在顯微鏡下評(píng)估氣道病理。

1.4 病理圖像分析 用顯微鏡對(duì)完整的肺橫截面成像，并使用Leica Application Suite V4.3圖像分析軟件測(cè)量肺壁的內(nèi)周(Pi)、面積(WA)和外周(Pe)，支氣管平滑肌面積(S)和支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)(N)。使用Pi和S對(duì)這三個(gè)測(cè)量值進(jìn)行歸一化，并表示為WA/Pi2、S/Pi2和N/S。

1.5 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用TRIzol一步法從RASMCs細(xì)胞和氣道組織中提取總RNA。用少量液氮將組織研磨成均勻的粉末，隨后加入Trizol試劑提取RNA。將焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水加到混合物中以溶解RNA。使用ND-1000紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量260 nm和280 nm的光密度(OD)。測(cè)定總RNA的質(zhì)量，并相調(diào)節(jié)RNA濃度。采用兩步法對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用以下反應(yīng)條件：70 ℃ 10 min，冰浴2 min，42 ℃ 60 min和70 ℃10 min。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA暫時(shí)置于-80 ℃。RT-qPCR使用TaqMan探針法進(jìn)行。反應(yīng)條件如下：在95 ℃下預(yù)變性30 s的一個(gè)循環(huán)，隨后在95 ℃下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的10 s變性，在60 ℃下退火10 s。并在70 ℃下延伸10 s。U6用于miR-22-3p的內(nèi)參基因，β-actin用于NK1R基因的內(nèi)參基因。使用相對(duì)定量方法，將每個(gè)靶基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)表示為2-ΔΔCt。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot 從RASMCs細(xì)胞和氣道組織中獲得總蛋白樣品，使用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將不同大小的蛋白分離開。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在室溫下使用含有5%牛血清白蛋白(BSA)的Tris緩沖鹽水-Tween(TBS-T)封閉1 h。將膜與抗NK1R和β-actin的一抗進(jìn)行孵育，過夜。然后將膜在TBS-T中沖洗(每次3次×10 min)。然后，膜與二抗進(jìn)行孵育。6 h后，將膜用TBS-T洗滌(每次3次×15 min)?；瘜W(xué)發(fā)光試劑A溶液和B溶液以1∶1的比例混合，最后將混合物均勻滴在膜上，使膜顯影，并對(duì)所有免疫印跡帶進(jìn)行相對(duì)密度分析。

1.7 RASMCs培養(yǎng) RASMCs在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)。每2 d換液一次，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化并傳代細(xì)胞。用含有10%FBS的DMEM代替培養(yǎng)基。

1.8 雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn) 利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站microRNA.org預(yù)測(cè)miR-22-3p靶基因，并精確預(yù)測(cè)miRNA可識(shí)別得潛在靶位點(diǎn)。使用TIANamp基因組DNA試劑盒提取RASMCs的DNA。利用含有miR-22-3p結(jié)合位點(diǎn)的NK1R 3′UTR野生型序列(NK1R-3′-UTR-wt)和突變的NK1R的3′-UTR序列(NK1R-3′-UTR-mut)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體，并將其轉(zhuǎn)染到RASMCs中。使用熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 模型組與對(duì)照組幼年大鼠氣道壁結(jié)構(gòu)的病理變化 每次OVA暴露后，模型組中的所有幼年大鼠均表現(xiàn)出煩躁、咳嗽、頻繁抓撓、呼吸急促等癥狀。大鼠連續(xù)暴露幾天后，模型組幼年大鼠的反應(yīng)較對(duì)照組慢。老鼠皮毛的顏色變暗。在大鼠肺組織切片中，HE染色顯示藍(lán)黑色核和淡紅色細(xì)胞質(zhì)(見圖1)。模型組表現(xiàn)出更多氣道壁和氣道平滑肌增厚和不均勻的細(xì)胞排列。對(duì)照組氣道壁結(jié)構(gòu)未見病理變化。模型組支氣管壁厚度(WA/Pi2)、支氣管壁平滑肌厚度(S/Pi2)及支氣管壁中平滑肌細(xì)胞的數(shù)量(N/S)高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 對(duì)照組與模型組WA/Pi2、S/Pi2、N/S比較Table 1 Comparison of WA/Pi2,S/Pi2,N/S between control group and model group

2.2 哮喘大鼠中miR-22-3p表達(dá)變化 與對(duì)照組比較，模型組的miR-22-3p的表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 對(duì)照組和模型組大鼠氣道組織中miR-22-3p的表達(dá)水平Figure 2 The expression level of miR-22-3p in the airway tissues of control group and model group注：A.miR-22-3p的表達(dá)水平變化點(diǎn)狀圖;B.miR-22-3p的表達(dá)水平變化熱圖。與對(duì)照組相比，①P<0.01

2.3 NK1R是miR-22-3p的靶基因 NK1R mRNA 3′-UTR區(qū)域和miR-22-3p的序列具有結(jié)合位點(diǎn)(見圖3A)。mimic對(duì)Mut-NK1R的熒光素酶活性的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，mimic降低了wt-NK1R的熒光素酶活性強(qiáng)度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3B。

圖3 使用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證NK1R mRNA的3′UTR和miR-22-3p的直接結(jié)合關(guān)系Figure 3 The luciferase reporter gene experiment was used to verify the direct binding relationship between 3′UTR of NK1R mRNA and miR-22-3p注：A.NK1R mRNA的3′UTR和miR-22-3p預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)；B.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)觀察熒光素酶活性變化。與對(duì)照組比較，①P<0.01

2.4 NK1R在幼年哮喘大鼠氣道組織中的表達(dá)變化 通過RT-qPCR、Western blot分析每組大鼠氣道組織中NK1R的表達(dá)變化。與對(duì)照組相比，模型組的NK1R的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見圖4A～D。

圖4 對(duì)照組和模型組大鼠氣道組織中NK1R的表達(dá)水平Figure 4 The expression level of NK1R in the airway tissue of control group and model group注：A.NK1R mRNA表達(dá)水平變化的點(diǎn)狀圖;B.NK1R mRNA表達(dá)水平變化的熱圖;C.NK1R的蛋白條帶；D.NK1R蛋白表達(dá)水平變化的柱形圖。與對(duì)照組相比，①P<0.01；與對(duì)照組相比，②P<0.05

2.5 miR-22-3p體內(nèi)調(diào)節(jié)NK1R的蛋白表達(dá)水平 明確miR-22-3p對(duì)NK1R表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，mimc下調(diào)模型組中NK1R的mRNA水平，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；inhibitor上調(diào)模型組中NK1RmRNA水平，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖5A)。mimc下調(diào)模型組中NK1R的蛋白水平，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；inhibitor上調(diào)模型組中NK1R的蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5B、圖5C。

圖5 體內(nèi)驗(yàn)證miR-22-3p沉默對(duì)NK1R表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Figure 5 In vivo verification of the regulatory effect of miR-22-3p silencing on NK1R expression注：A.NK1R mRNA表達(dá)水平變化的柱形圖;B.NK1R的蛋白條帶；C.NK1R蛋白表達(dá)水平變化的柱形圖。與模型+mimic-NC組相比，①P<0.05；與模型+inhibitor-NC組相比，②P<0.05

3 討論

小兒哮喘給家庭和社會(huì)造成了巨大精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此需要深入探究小兒哮喘的發(fā)生機(jī)制[19]。最近研究表明，感覺神經(jīng)肽例如SP、NKA、NKB及降鈣素基因相關(guān)肽與肺部疾病和癌癥有關(guān)[20-21]。因此，探索感覺神經(jīng)肽在氣道重塑中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于研究潛在的小兒哮喘治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

通過利用幼年大鼠實(shí)驗(yàn)性慢性哮喘，結(jié)果顯示miR-22-3p的表達(dá)與哮喘之間可能具有關(guān)聯(lián)。目前研究[7]表明，多種miRNA的表達(dá)水平與哮喘和氣道炎癥有關(guān)。包括miR-21、miR-223、miR-22-3p。研究[22]表明，miR-26a在ASMC肥大中起調(diào)節(jié)作用，這是氣道重塑發(fā)展中的關(guān)鍵過程。此外miR-221抑制哮喘患者的ASMC過度增殖[23]。miR-22-3p在維持心肌肥厚和組織重構(gòu)中扮演重要作用[24]。本研究中miR-22-3p的表達(dá)在幼年大鼠哮喘發(fā)生過程中降低，因此可能與哮喘的發(fā)展具有密切關(guān)系。miR-22-3p可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖，包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞[25]、肺腺癌[26]、動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞[27]。但很少有研究調(diào)查miR-22-3p在幼年哮喘模型中的表達(dá)和下游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

本研究中通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出miR-22-3p和NK1R mRNA的3′-UTR區(qū)存在潛在的靶向調(diào)節(jié)位點(diǎn)。以往研究表明，NK1R表達(dá)于呼吸道中的不同部位，包括氣道平滑肌、粘膜下腺、血管內(nèi)皮、炎性細(xì)胞[15,28]。新的研究表明，在哮喘氣道重建過程中，NK1R可通過增加微管蛋白的表達(dá)促進(jìn)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的遷移，表明NK1R可能是預(yù)防和控制哮喘氣道重塑的新靶標(biāo)[28]。本研究進(jìn)一步探究miR-22-3p與神經(jīng)肽NK1R表達(dá)之間的關(guān)系，結(jié)果表明在哮喘大鼠中，miR-22-3p和NK1R的表達(dá)趨勢(shì)相反，而且表明miR-22-3p可直接抑制氣道組織中神經(jīng)肽NK1R的表達(dá)。首先在體外的熒光素酶報(bào)告基因研究結(jié)果表明，在RASMCs細(xì)胞中，miR-22-3p能直接與NK1R mRNA的3′-UTR結(jié)合，通過靶向抑制降低NK1R的蛋白表達(dá)。另外，在幼年哮喘大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們通過注射mimics在氣道組織中過表達(dá)miR-22-3p，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK1R的表達(dá)受到明顯抑制，而通過inhibitor可以明顯抑制miR-22-3p及可以明顯上調(diào)NK1R的表達(dá)。一項(xiàng)研究同樣表明，miR-22能夠靶向抑制NK1R，并且因此負(fù)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移[12]。因此，在幼年哮喘大鼠的氣道組織中miR-22-3p可以靶向抑制NK1R，從而可能通過調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞和炎性細(xì)胞的增殖，以及平滑肌細(xì)胞遷移。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在幼年哮喘大鼠的氣道組織中，miR-22-3p可以靶向抑制NIK1R的表達(dá)，此調(diào)節(jié)機(jī)制在哮喘大鼠氣道重塑過程中可能扮演重要作用。miR-22-3p以及NK1R在肺組織中的表達(dá)特征對(duì)哮喘的早期診斷有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但仍需擴(kuò)大樣本量深入研究，以確定miR-22-3p/NK1R信號(hào)發(fā)揮作用的具體機(jī)制。