曹 秀，韓靜文，吳 妍，李會(huì)婷，馬旖旎，陳衛(wèi)東，史天陸,#

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012； 2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科，安徽 合肥 230036)

蒼耳為菊科蒼耳屬植物，廣布我國(guó)各地區(qū)，《中華人民共和國(guó)藥典：一部》收錄蒼耳子作為藥用，主要用于通鼻竅、祛風(fēng)濕[1-3]。蒼耳亭經(jīng)有機(jī)溶劑提取自蒼耳中[4-5]，屬于倍半萜內(nèi)酯類，α、β-不飽和羰基-γ內(nèi)酯結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮活性的結(jié)構(gòu)[6]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒼耳亭在體內(nèi)外均有較好的促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡和抗腫瘤作用[7-12]；此外，其還具有抑菌、抗過(guò)敏反應(yīng)、抗?jié)兗翱挂钟舻茸饔肹13-18]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒼耳亭體內(nèi)外具有抗肝癌細(xì)胞的作用[19]。藥物的體內(nèi)濃度高低與其藥理作用的相關(guān)性很大，故本課題組擬進(jìn)一步探討蒼耳亭在體內(nèi)的藥物濃度情況。目前，有關(guān)蒼耳亭體內(nèi)外含量測(cè)定方法的研究較少，尚未見有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定蒼耳亭體內(nèi)濃度的研究報(bào)道。故本研究擬嘗試建立HPLC法測(cè)定大鼠血漿中蒼耳亭的濃度，為其體內(nèi)藥物分析和藥動(dòng)學(xué)研究提供方法基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010AHT型島津高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器，四元低壓泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，LabSolutions Version 5.51色譜工作站)；FA2004B型電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；KJ-202型振蕩器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；TGL-16B型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；NDK200型氮吹儀(上海皓莊儀器有限公司)；移液槍[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司，規(guī)格：10、100及1 000 μl]。

1.2 藥品與試劑

蒼耳亭標(biāo)準(zhǔn)品(南京植翠生物科技有限公司，批號(hào)為SZ201911108CET；純度>98%)；內(nèi)標(biāo)物奧硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定院，批號(hào)為100608-201102)；甲醇為色譜純(西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)為1908011)；實(shí)驗(yàn)用水為滅菌注射用水(石家莊四藥有限公司，批號(hào)為1905093202)；二氯甲烷(無(wú)錫市展望化工試劑有限公司，批號(hào)為180701)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS2柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；柱溫為25 ℃；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；流動(dòng)相為甲醇-水(V∶V=52∶48)；進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備：精密稱取蒼耳亭標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中避光儲(chǔ)存。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用適量甲醇溶解成1、2.5、5、10、20、50及100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，置于4 ℃冰箱中避光儲(chǔ)存。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)奧硝唑溶液的配制：精密稱取內(nèi)標(biāo)物奧硝唑10 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用甲醇稀釋成濃度為100 μg/ml的內(nèi)標(biāo)工作液，置于4 ℃冰箱中避光儲(chǔ)存。

2.3 血漿樣品的處理

取大鼠血漿樣品100 μl，置于1.5 ml一次性離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μl充分振搖1 min后，再加入二氯甲烷溶液1 ml，渦旋混勻3 min，離心(4 000 r/min，5 min)，下清液轉(zhuǎn)移至另一干燥的一次性離心管中，45 ℃氮?dú)獯蹈?，殘留物?00 μl甲醇溶解，渦旋1 min，離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液80 μl按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性考察：分別取大鼠空白血漿、空白血漿加奧硝唑溶液(100 μg/ml)、空白血漿加蒼耳亭溶液(15 μg/ml)、空白血漿加奧硝唑溶液(150 μg/ml)和蒼耳亭溶液(2 μg/ml)，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，見圖1。由圖1(B)和圖1(C)可知，奧硝唑、蒼耳亭的保留時(shí)間分別為3.906、6.810 min，在選擇的色譜條件下，兩者分離度較好(R>1.5)，且內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，該方法的專屬性良好。

A.空白血漿；B.空白血漿加100 μg/ml奧硝唑；C.空白血漿加15 μg/ml蒼耳亭；D.空白血漿加150 μg/ml奧硝唑和2 μg/ml蒼耳亭A. blank plasma; B. blank plasma mixed with 100 μg/ml ornidazole; C. blank plasma mixed with 15 μg/ml xanthatin; D. blank plasma mixed with 150 μg/ml ornidazole and 2 μg/ml xanthatin圖1 蒼耳亭HPLC圖Fig 1 HPLC of xanthatin

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限：取大鼠空白血漿90 μl，分別加入蒼耳亭標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μl，制成相當(dāng)于蒼耳亭質(zhì)量濃度為0.1、0.25、0.5、1、2.5、5及10 μg/ml的模擬血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖，以蒼耳亭質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/ml)，蒼耳亭與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程：Y=0.530 1X+0.022 5(R2=0.999 7)。定量下限為0.1 μg/ml，蒼耳亭血漿濃度在0.1～10 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn)：取大鼠空白血漿90 μl，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制成低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度(蒼耳亭終質(zhì)量濃度分別為0.1、1及10 μg/ml)的樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)質(zhì)量濃度5個(gè)樣本，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品溶液的濃度，計(jì)算日內(nèi)與日間精密度，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)表示，見表1。

表1 日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果(n=5)Tab 1 Results of intra-day and inter-day precision test(n=5)

2.4.4 提取回收率：按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備蒼耳亭質(zhì)量濃度為0.25、1及10 μg/ml的模擬血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)質(zhì)量濃度5個(gè)樣本，進(jìn)樣分析測(cè)得蒼耳亭峰面積，將所得的蒼耳亭峰面積與用流動(dòng)相配制的同濃度蒼耳亭峰面積的比值作為提取回收率。低、中及高濃度的提取回收率分別為89.19%、83.56%及96.72%，RSD分別為9.54%、3.47%及8.91%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取大鼠空白血漿90 μl，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，制成質(zhì)量濃度為0.25、1及10 μg/ml的模擬血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度5個(gè)樣本，進(jìn)樣分析，于室溫(25 ℃)放置4 h，-20 ℃冷凍7 d和經(jīng)歷3次反復(fù)性凍融后測(cè)定樣品中蒼耳亭的含量，將測(cè)得結(jié)果分別與0 h對(duì)比，計(jì)算相對(duì)比率和RSD，結(jié)果見表2。

表2 蒼耳亭在大鼠血漿中的穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=5)Tab 2 Investigation of stability of Xanthing in rat plasma(n=5)

3 討論

目前，關(guān)于蒼耳亭體內(nèi)分析方法的研究較少。徐圣秋等[20]通過(guò)HPLC法測(cè)定了不同采收期蒼耳草中蒼耳亭的含量，但其研究中的色譜條件及其樣品前處理方法不適用于血漿樣品。Yan等[21]采用超高效液相色譜與四級(jí)桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)首次測(cè)定了大鼠單次給藥后血漿中蒼耳亭濃度，但該法的精密度和回收率均較低，且測(cè)定濃度范圍內(nèi)的線性相關(guān)性較差。一般常用的體內(nèi)藥物濃度檢測(cè)方法主要有HPLC和液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)等，但LC-MS成本較高，不適于普通實(shí)驗(yàn)室開展課題研究。因此，為提高大鼠血漿中蒼耳亭定量方法的回收率和線性相關(guān)性，本研究在已有實(shí)驗(yàn)室條件下，進(jìn)一步優(yōu)化蒼耳亭體內(nèi)藥物濃度檢測(cè)條件，對(duì)HPLC法測(cè)定大鼠血漿中的蒼耳亭濃度進(jìn)行了相關(guān)探索。

在流動(dòng)相選擇和優(yōu)化方面，對(duì)實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相從甲醇-水(V∶V=60∶40)調(diào)整至甲醇-水(V∶V=52∶48)進(jìn)行篩選，隨著水比例增加，蒼耳亭的保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)；在甲醇-水(V∶V=52∶48)時(shí)內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)內(nèi)標(biāo)和蒼耳亭峰的干擾最小，且兩者分離度較好，最終確定以甲醇-水(V∶V=52∶48)作為流動(dòng)相。

在內(nèi)標(biāo)物選擇方面，研究初期擬用對(duì)氨基苯甲酸(PABA)作內(nèi)標(biāo)，但PABA性質(zhì)不穩(wěn)定，其保留時(shí)間為2.2 min，而血漿中有雜質(zhì)峰干擾，故調(diào)整內(nèi)標(biāo)，選用了奧硝唑，后期實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了該內(nèi)標(biāo)性質(zhì)穩(wěn)定可靠，與蒼耳亭在血漿分析過(guò)程中互不干擾。

在血漿樣本前處理方面，血漿樣品經(jīng)甲醇直接萃取進(jìn)樣，干擾峰較多，且提取回收率低；其他研究中選用乙酸乙酯作萃取劑[21]，但在本研究條件下重現(xiàn)性不佳，且氮?dú)獯蹈蓵r(shí)間較長(zhǎng)，故考慮用性質(zhì)相似的二氯甲烷萃取。

在穩(wěn)定性考察方面，將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4 ℃冰箱中避光儲(chǔ)存，每隔1周檢測(cè)發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液含量均不同程度的降低，故考察藥物穩(wěn)定性時(shí)選用0 h作為參考，以此來(lái)減少因保存過(guò)程中藥物含量下降等干擾。將含有低、中及高濃度的蒼耳亭血漿樣品置于-20 ℃冰箱，于30 d中冷凍和反復(fù)凍融3次后檢測(cè)，血漿樣品中蒼耳亭含量幾近于零?？紤]含有蒼耳亭的血漿樣品不適宜長(zhǎng)時(shí)間放置冰箱冷凍，故將含有低、中及高濃度的蒼耳亭血漿樣品置于-20 ℃冰箱冷凍7 d和7 d內(nèi)反復(fù)凍融3次后，測(cè)得樣品的回收率和精密度均較好；但反復(fù)凍融后樣品檢測(cè)的精密度較冷凍時(shí)低，建議含有蒼耳亭的血漿樣品在短時(shí)間內(nèi)盡快處理，且盡量減少反復(fù)凍融的次數(shù)。由上可見，在實(shí)際操作中需采取更好的避光和密封方式，以更好地保存血漿樣品中的蒼耳亭。

綜上所述，本研究建立了靈敏、快速且簡(jiǎn)單的HPLC方法，可為蒼耳亭藥動(dòng)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。