王偉科，陸 娜，閆 靜，宋吉玲，袁衛(wèi)東，周祖法

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

秀珍菇(Pleurotuspulmonarius)在分類學(xué)上屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬的大型真菌[1]，其口感極好，味道鮮美，纖維含量少，熱量低，肉質(zhì)脆爽，且營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量極高，同時(shí)還含多醣、纖維素、礦物質(zhì)素、氨基酸與多種微量元素等，被驗(yàn)證具有抗腫瘤的功能，是一種價(jià)值極高的珍稀食用菌[2]。秀珍菇抗逆性較強(qiáng)，生產(chǎn)周期較短，出菇整齊，產(chǎn)量可觀，應(yīng)用工廠化設(shè)施進(jìn)行規(guī)?；耘嘁殉蔀槠渖a(chǎn)的主要方式[3]。生產(chǎn)上秀珍菇采用低溫誘導(dǎo)調(diào)控出菇的方法，了解秀珍菇低溫誘導(dǎo)下原基形成的分子機(jī)理，對(duì)秀珍菇工廠化栽培具有重要的指導(dǎo)意義[4]。

課題組前期對(duì)秀珍菇低溫誘導(dǎo)后樣本與原基形成前期的樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并分析了樣本間的差異表達(dá)基因，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后ID為Cluster-6377.69422的基因在秀珍菇菌絲體經(jīng)低溫刺激后原基形成前期樣本中高度表達(dá)，經(jīng)基因注釋與Swissprot描述，其編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶，將其命名為PpSAMS。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶 (S-adenosylmethioninesynthetase， SAMS)是植物代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它催化ATP和甲硫氨酸反應(yīng)生成的S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine， SAM)，是重要的甲基供體，也是生物合成多胺和乙烯等的前體，能夠參與植物的轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)甲基和轉(zhuǎn)硫等多種重要的生化反應(yīng)過(guò)程[5-7]。同時(shí)，SAMS還可以與RNA結(jié)合參與基因的表達(dá)調(diào)控[8]。研究表明，SAMS基因與植物對(duì)干旱、鹽堿和低溫的抗性密切相關(guān)，并協(xié)助植物耐受非生物脅迫，提高植物抗逆性[9-11]。此外，不同植物SAMS基因或同一物種的不同家族成員之間的表達(dá)模式具有明顯的組織和時(shí)間特異性[12-14]，表明不同的SAMS基因可能參與了不同的生理代謝過(guò)程。因此，分析不同物種的SAMS基因，對(duì)深入了解該基因的功能具有重要意義。

目前已經(jīng)在番茄[15]、擬南芥[13]、松樹(shù)[16]等多種生物中克隆了SAMS基因，但還未見(jiàn)秀珍菇SAMS基因(PpSAMS)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)技術(shù)分析篩選出該基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物克隆了該基因，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)分析，為進(jìn)一步深入研究該基因奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為闡明秀珍菇經(jīng)低溫刺激誘導(dǎo)原基與子實(shí)體形成的分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為秀珍菇5766，由臨安鼎新農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.1.2 基質(zhì)配方

基質(zhì)配方為：棉籽殼39%、木屑39%、麩皮18%、石膏1%、石灰1%。

1.1.3 樣本處理

菌包接種后于26～28 ℃條件下避光培養(yǎng)，待菌絲滿袋后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的菌包開(kāi)展試驗(yàn)。分4組取樣，每組10包，分別記為S0、S1、S2、S3。S0，菌絲滿袋后，用鑷子挑取發(fā)菌良好的菌包料面純菌絲體10 g，置于-80 ℃超低溫冰箱保存；S1，菌絲滿袋后，發(fā)菌良好的菌包置于10 ℃條件下12 h，按S0方法取樣保存；S2，菌絲滿袋后，發(fā)菌良好的菌包置于10 ℃ 條件下12 h，再待其恢復(fù)到室溫狀態(tài)后，按S0方法取樣保存；S3，原基形成期取原基10 g，保存方法與S0一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取

樣本總RNA的提取采用Trizol法進(jìn)行[17]，樣本經(jīng)液氮研磨后Trizol裂解，離心棄沉淀，上清加入氯仿/異戊醇抽提，振蕩混勻。離心后上清加入體積比1∶1的異丙醇，沉淀總RNA。沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌后溶于40 μL DEPC水中。

1.2.2 cDNA的合成

總RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳與Nanodrop2000c檢測(cè)純度和濃度后，參考Biorad公司的iScript cDNA Synthesis Kit合成cDNA。

1.2.3 基因克隆

根據(jù)秀珍菇測(cè)序結(jié)果，選取PpSAMS基因。同時(shí)運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)相關(guān)引物如下：上游引物5′-ATGTTCTCCATCCGCATCTCC-3′；下游引物5′-CGCCCATCAAACTCCTCTAA-3′。

以反轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共50 μL反應(yīng)體系：10×Pfx緩沖液5.0 μL，50 mmol·L-1MgSO41.0 μL，25 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 mmol·L-1上游引物2.0 μL，10 mmol·L-1下游引物2.0 μL，cDNA模板5.0 μL，PfxDNA Polymerase1.0 μL，ddH2O 32 μL。

反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒直接純化回收。連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性克隆送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 基因的生物信息學(xué)分析

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast、http://amigo.geneontology.org/、http://www.uniprot.org等相關(guān)網(wǎng)址進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用軟件VectorNTI、MEGA5.0對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[18]。

1.2.5 基因表達(dá)分析

分別提取秀珍菇常溫處理菌絲體、低溫誘導(dǎo)后菌絲體、低溫誘導(dǎo)原基形成前期菌絲體與原基4個(gè)不同處理階段總RNA，參考iScript cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，同時(shí)根據(jù)測(cè)序后的PpSAMS序列設(shè)計(jì)引物，按照SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ使用說(shuō)明，檢測(cè)基因PpSAMS的表達(dá)，以Actin作為內(nèi)參，計(jì)算PpSAMS的相對(duì)表達(dá)量[19]。目的基因和內(nèi)參基因Actin的退火溫度均為53 ℃，樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpSAMS基因克隆與生物信息學(xué)分析

為研究PpSAMS基因信息并探究其功能，通過(guò)利用RT-PCR技術(shù)從秀珍菇中克隆得到1 100 bp左右的DNA片段，克隆測(cè)序后，通過(guò)ORF Finder尋找其開(kāi)放讀碼框，顯示為1個(gè)全長(zhǎng)為1 152 bp的ORF框，推斷其為編碼384個(gè)氨基酸的功能蛋白。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)引物序列

BLAST顯示其與密黏褶菌(Gloeophyllumtrabeum)S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(S-adenosylmethionine adenosyltransferase，GenBank:XM_007864819.1)相似度為83%。

與GenBank中登錄的基因進(jìn)行同源性比較和功能預(yù)測(cè)分析后，獲得序列被驗(yàn)證確認(rèn)為一個(gè)編碼384個(gè)氨基酸的CDS(Coding sequence，圖1)。Vector NTI軟件推算該編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量在41.8 ku左右。

2.2 PpSAMS基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA5.0 軟件對(duì)秀珍菇PpSAMS基因編碼氨基酸序列開(kāi)展進(jìn)化樹(shù)分析，顯示秀珍菇PpSAMS編碼的蛋白與糙皮側(cè)耳同源蛋白親緣關(guān)系最近，與其他真菌同源蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。

2.3 PpSAMS的GO功能分析

GO功能分析顯示，PpSAMS蛋白具有結(jié)合ATP、金屬離子的功能，同時(shí)具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性。GO功能分析顯示，PpSAMS蛋白參與了甲硫氨酸、單碳的代謝過(guò)程，同時(shí)參與了S-腺苷甲硫氨酸的生物合成。S-腺苷甲硫氨酸在甲基轉(zhuǎn)移中是一個(gè)重要的甲基供體，并可以將DNA甲基化，從而調(diào)控基因的表達(dá)?？梢?jiàn)，PpSAMS蛋白在秀珍菇DNA甲基化調(diào)控過(guò)程中起重要作用。

2.4 PpSAMS的KEGG分析

KEGG pathway分析顯示，S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化L-甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸，后者參與了生物體內(nèi)的一系列代謝過(guò)程，包括乙烯合成與丙酸的代謝(圖3)。

2.5 低溫誘導(dǎo)后秀珍菇不同生長(zhǎng)階段PpSAMS的表達(dá)研究

PpSAMS在秀珍菇菌絲體常溫處理(S0)、低溫誘導(dǎo)(S1)、低溫誘導(dǎo)后原基形成前期(S2)、原基期4個(gè)不同生長(zhǎng)階段均有不同程度的表達(dá)。其中S1階段PpSAMS的相對(duì)表達(dá)量高于S0階段,說(shuō)明菌包受到低溫脅迫后，PpSAMS的表達(dá)量有一定程度的升高；而S2階段PpSAMS的相對(duì)表達(dá)量明顯高于S0與S1階段，說(shuō)明PpSAMS在一定程度的低溫誘導(dǎo)后，啟動(dòng)了體內(nèi)某些生理生化反應(yīng)，誘導(dǎo)原基形成(圖4)。

圖1 PpSAMS基因的ORF讀碼框與翻譯結(jié)果Fig.1 ORF and transcription of PpSAMS

圖2 PpSAMS基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequence of PpSAMS between Pleurotus pulmonarius and other fungi

圖3 PpSAMS基因KEGG代謝通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of PpSAMS

圖4 PpSAMS在秀珍菇不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)情況Fig.4 Expression profile of PpSAMS in Pleurotus pulmonarius at different growth stages

3 討論

出菇過(guò)程是大型食用菌整個(gè)生命過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié)，在秀珍菇栽培研究中，低溫誘導(dǎo)刺激相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控能夠?qū)崿F(xiàn)其整齊出菇[20]。因此，研究秀珍菇子實(shí)體發(fā)育分子機(jī)制與發(fā)育相關(guān)基因可為秀珍菇出菇技術(shù)提供指導(dǎo)，也可為發(fā)掘優(yōu)異種質(zhì)資源和雜交親本遺傳背景篩選提供幫助[21]。

擔(dān)子菌子實(shí)體形成的分子機(jī)理研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，目前已分離鑒定得到多個(gè)與食用菌結(jié)實(shí)有關(guān)的基因。香菇priB基因在菌絲體時(shí)期不表達(dá)，在原基和子實(shí)體發(fā)育形成的早期大量表達(dá)，推測(cè)其在香菇子實(shí)體形成中起到重要作用[22]。金針菇原基形成相關(guān)的HMG-box轉(zhuǎn)錄因子基因Fv-hmg在金針菇原基時(shí)期的表達(dá)量顯著高于雙核菌絲時(shí)期，推測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控金針菇的原基形成[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，推測(cè)PpSAMS在誘導(dǎo)秀珍菇原基形成過(guò)程中起到重要作用。

研究表明，植物與大型食用真菌在遭受低溫脅迫時(shí)，能夠利用自身甲基化程度(甲基化和去甲基化)的改變調(diào)控基因表達(dá)[24]。S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化甲硫氨酸和ATP形成S-腺苷甲硫氨酸，而S-腺苷甲硫氨酸在甲基轉(zhuǎn)移中是一個(gè)重要的甲基供體，并可以將DNA甲基化，進(jìn)而影響基因的表達(dá)[25]。本研究中PpSAMS基因在秀珍菇受低溫誘導(dǎo)后表達(dá)量上升，推測(cè)其屬于真菌的應(yīng)激反應(yīng)，提高了秀珍菇菌絲體抗低溫能力；同時(shí)PpSAMS的表達(dá)誘導(dǎo)了S-腺苷甲硫氨酸的生物合成，將相關(guān)基因甲基化，從而影響了秀珍菇的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其在原基形成前期，其表達(dá)量顯著上升，推測(cè)其在秀珍菇菌絲體扭結(jié)進(jìn)而形成原基的過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用，但其具體調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。