何佳琦，翟 瑩，*，張 軍，邱 爽，李銘楊，趙 艷，張梅娟，馬天意

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾161006; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾161005)

Dof(DNA-binding one zinc finger)轉(zhuǎn)錄因子屬于植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物中以家族形式存在[1]，因其N端含有一個(gè)富含Cys殘基的單鋅指DNA結(jié)合域而得名[2]。自從Yanagisawa從玉米中分離第一個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子以來[3]，已經(jīng)從不同植物中鑒定了大量Dof轉(zhuǎn)錄因子[4]。Dof轉(zhuǎn)錄因子通過Dof結(jié)構(gòu)域可以識別啟動子中含有AAAG的DNA核心元件，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)植物的光、激素和防御等反應(yīng)[5]，表明其在植物逆境脅迫響應(yīng)中具有重要功能[6]。

擬南芥AtDof5.8能夠響應(yīng)干旱和鹽脅迫，其過表達(dá)可以增加轉(zhuǎn)基因擬南芥對非生物脅迫的抗性[7]。在水稻的30個(gè)Dof基因中，僅有3個(gè)基因的表達(dá)在PEG處理后受到顯著抑制，而其他基因的表達(dá)則明顯上調(diào)，表明它們可能正向調(diào)控植物的干旱適應(yīng)性[8]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，大多數(shù)大白菜、辣椒和小桐子的Dof轉(zhuǎn)錄因子可以被高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[9-11]。但在小麥的31個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子中，多數(shù)都被干旱誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，表明多數(shù)的小麥Dof基因可能負(fù)向調(diào)控植物的干旱適應(yīng)性。此外，TaDof5、TaDof17和TaDof19的表達(dá)量在熱脅迫下顯著下調(diào)，而TaDof1的表達(dá)量則在鹽脅迫下顯著上調(diào)[12]。由此表明，Dof家族轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)對非生物脅迫過程中具有功能多樣性。盡管Dof轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)非生物脅迫，但其作用機(jī)制仍然不十分明確，應(yīng)用Dof轉(zhuǎn)錄因子改良植物的例子也比較少見。

前人發(fā)現(xiàn)大豆中存在78個(gè)Dof基因，其中，GmDof4和GmDof11通過調(diào)控脂肪酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控大豆種子的油脂含量[13-14]。但大部分基因的功能，尤其是它們與非生物脅迫之間的關(guān)系尚未明確。本實(shí)驗(yàn)對大豆中的1個(gè)功能未被鑒定的Dof轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆，并進(jìn)行非生物脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)分析，以期為大豆Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與非生物脅迫處理

本研究所用植物材料為齊齊哈爾地區(qū)廣泛種植的大豆抗逆品種北豆9號。在Hoagland營養(yǎng)液中水培大豆幼苗。待大豆幼苗第一片三出復(fù)葉完全展開時(shí)進(jìn)行非生物脅迫處理。干旱脅迫，將大豆幼苗置于含15% PEG8000的營養(yǎng)液中；高鹽脅迫，將大豆幼苗置于含150 mmol·L-1NaCl的營養(yǎng)液中；低溫脅迫，將大豆幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中；高溫脅迫，將大豆幼苗置于42 ℃培養(yǎng)箱中。脫落酸(ABA)處理，用含有200 μmol·L-1的ABA溶液噴灑大豆幼苗。分別在脅迫處理的0、1、2、5、10和24 h(其中，高溫脅迫下幼苗生長狀態(tài)不佳，只進(jìn)行到10 h)，剪取0.1 g第一片三出復(fù)葉并迅速置于液氮中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)總RNA的提取。

1.2 基因克隆

利用大豆轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(http://www.plantgdb.org/GmGDB/)和NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，搜索大豆Dof轉(zhuǎn)錄因子基因，獲得一個(gè)功能未知的Dof基因mRNA序列。使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取大豆葉片總RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Novoprotein)合成第一鏈cDNA。根據(jù)Dof基因ORF序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-ATGGGCGAGGAATCTCAA-3′；下游引物5′-TCAAGACACGCTTTGGTCC-3′，以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因ORF序列。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體(TaKaRa)，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

在線軟件ExPASy (http://expasy.org/tools/pi_tool.html)預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)預(yù)測蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域與位置；在線軟件PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位；在線軟件NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測蛋白磷酸化位點(diǎn)；用MEGA 5軟件構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取各樣本的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和D260/D280值檢測提取RNA的質(zhì)量。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Novoprotein)合成第一鏈cDNA。使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物，上游引物5′-TGGATGGGCGTGCCTATGA-3′；下游引物5′-TTGGTCCCTCGCTGCTGAA-3′。以大豆β-Tubulin基因(GenBank登錄號：GMU12286)作為內(nèi)參基因[15]，上游引物5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′；下游引物5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′。使用BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀，參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共循環(huán)40次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×TB Green Premix ExTaqⅡ(TaKaRa) 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL，補(bǔ)水至總體積20 μL。所有處理均做3次重復(fù)，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmDof1.5的克隆與序列分析

通過RT-PCR技術(shù)獲得一個(gè)大豆中功能未知的Dof轉(zhuǎn)錄因子基因GmDof1.5(GenBank登錄號：XM014767503)(圖1)。GmDof1.5位于大豆基因組15號染色體上，含有一個(gè)內(nèi)含子序列。其mRNA編碼序列全長540 bp(圖2)，編碼含有179個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為20.15 ku，等電點(diǎn)為9.82。GmDof1.5蛋白序列中含有1個(gè)59個(gè)氨基酸殘基組成的Zf-Dof結(jié)構(gòu)域(圖2)，由此推測其為Dof轉(zhuǎn)錄因子家族成員。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析顯示，GmDof1.5蛋白含有12個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)，這些氨基酸可能在維持蛋白的空間結(jié)構(gòu)、活性與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用。

M，DL 2000相對分子質(zhì)量標(biāo)記物；1-2，GmDof1.5 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。M， DL 2000 marker; 1-2， PCR product of GmDof1.5.圖1 大豆GmDof1.5 PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of GmDof1.5 from soybean

下劃線代表Zf-Dof結(jié)構(gòu)域；黑體代表磷酸化位點(diǎn)；*代表終止密碼子。Zf-Dof domain was underlined; Phosphorylation sites were indicated by boldface type; Stop codon was shown in *.圖2 GmDof1.5的核苷酸與氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of GmDof1.5

2.2 Dof蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

將大豆GmDof1.5蛋白序列與GenBank中已登錄的其他15種植物Dof轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果如圖3所示，大豆GmDof1.5與雞血藤SsDof4的親緣關(guān)系最近；此外，它們與野生大豆GsDof1.5、鷹嘴豆CaDof4和赤豆VaDof1.5也具有較近的親緣關(guān)系。

2.3 GmDof1.5非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測了GmDof1.5基因在ABA、干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫處理下的表達(dá)動態(tài)。從圖4中可以看出，GmDof1.5對5種非生物脅迫的響應(yīng)存在差異。干旱處理后(圖4-A)，GmDof1.5表達(dá)量先升高，在處理10 h時(shí)達(dá)到最大值，是未處理對照表達(dá)量的14倍，之后表達(dá)量下降，但仍然高于對照；高鹽處理后(圖4-B)，GmDof1.5表達(dá)量持續(xù)升高，在處理24 h時(shí)達(dá)到最大值，是未處理對照表達(dá)量的32倍；高溫處理后(圖4-C)，GmDof1.5表達(dá)量先升高，在處理5 h時(shí)達(dá)到最大值，是未處理對照表達(dá)量的117倍，之后表達(dá)量下降，但仍然高于對照；低溫處理后(圖4-D)，GmDof1.5表達(dá)量先下降后升高，在處理5 h時(shí)達(dá)到最大值，是未處理對照表達(dá)量的7倍；ABA處理后(圖4-E)，表達(dá)量持續(xù)升高，在處理24 h時(shí)達(dá)到最大值，是未處理對照表達(dá)量的83倍。由此推測GmDof1.5在大豆中可不同程度地響應(yīng)非生物脅迫，且對高溫脅迫的響應(yīng)最為明顯。

3 討論

Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中起重要的調(diào)控作用[16-18]。目前，Dof轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中于不同植物Dof家族全基因組的預(yù)測分析[1，19]，而Dof基因的克隆與抗逆功能研究也主要集中在模式植物擬南芥中[7，17]。關(guān)于大豆Dof基因與非生物脅迫關(guān)系的研究尚未系統(tǒng)開展。本研究從大豆中克隆了GmDof1.5基因，并對其蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測。蛋白序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GmDof1.5是一個(gè)典型的Dof轉(zhuǎn)錄因子家族成員。不同植物中Dof轉(zhuǎn)錄因子理論等電點(diǎn)存在差異，但基本處于5.41～6.97，且堿性氨基酸數(shù)目普遍高于酸性氨基酸[20]。但GmDof1.5等電點(diǎn)為9.82，偏堿性類型，這與王海波等[21]的研究結(jié)果相符，可能意味著GmDof1.5在功能上具有特殊性。Dof蛋白保守結(jié)構(gòu)域側(cè)翼序列對Dof蛋白與DNA的結(jié)合存在一定影響[22]，GmDof1.5蛋白序列中含有大量磷酸化位點(diǎn)，推測它們可能通過磷酸化與去磷酸化共價(jià)修飾調(diào)節(jié)GmDof1.5蛋白與DNA順式作用元件的結(jié)合[23]。Dof蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，大豆GmDof1.5、雞血藤SsDof4、野生大豆GsDof1.5、鷹嘴豆CaDof4和赤豆VaDof1.5具有較近的親緣關(guān)系，可能與大豆、雞血藤、野生大豆、鷹嘴豆和赤豆均屬于豆科植物相關(guān)。

圖3 Dof蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Dof proteins

**和*分別代表在1%和5%概率水平上差異顯著。** and * indicate significant difference at P<0.01 and P<0.05， respectively.圖4 干旱(A)、高鹽(B)、高溫(C)、低溫(D)和ABA(E)處理下GmDof1.5在大豆幼苗中的表達(dá)Fig.4 Expression of GmDof1.5 under drought(A)， salt(B)， high temperature(C)， low temperature(D) and ABA(E) treatments in soybean seedlings

基因表達(dá)量的不同是由其轉(zhuǎn)錄水平不同所造成的，逆境誘導(dǎo)下基因表達(dá)量的檢測結(jié)果對于功能基因的篩選與鑒定具有重要的參考價(jià)值[24]。本實(shí)驗(yàn)對非生物脅迫下GmDof1.5的表達(dá)量進(jìn)行了檢測。盡管在響應(yīng)時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度上存在差異，但干旱、高鹽、高溫和低溫4種非生物脅迫均可明顯誘導(dǎo)GmDof1.5的表達(dá)，說明GmDof1.5在大豆非生物脅迫中具有調(diào)控作用。且高溫脅迫對GmDof1.5表達(dá)的影響最為顯著，據(jù)報(bào)道馬鈴薯和茶樹中的Dof轉(zhuǎn)錄因子也被高溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[20，25]。ABA是非生物脅迫響應(yīng)途徑中的重要信號物質(zhì)之一，且GmDof1.5對ABA處理存在應(yīng)答，說明GmDof1.5對非生物脅迫的響應(yīng)可能依賴于ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。由此推測，GmDof1.5參與大豆對非生物脅迫的響應(yīng)，但其調(diào)控機(jī)制等問題仍有待進(jìn)一步研究。