高 競，方 偉，顧佳悅，嚴淑嫻，邵 帥，梁辰飛，秦 華，陳俊輝，徐秋芳

(浙江農(nóng)林大學 環(huán)境與資源學院，浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點實驗室，浙江 杭州 311300)

山核桃(CaryacathayensisSarg.)主要分布在浙江、安徽和福建等地。由葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的山核桃干腐病是山核桃上最嚴重的病害之一。近年來，山核桃干腐病病情越來越嚴重，部分地區(qū)的發(fā)病率達到80%～90%，造成大面積林地死亡，嚴重制約了山核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。目前，防治山核桃干腐病主要采取化學防治和物理防治的手段[2]，但是大量使用化學農(nóng)藥導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，且易造成環(huán)境污染；而物理防治又易對樹體造成創(chuàng)傷，且不能解決根本問題[3]。因此，生物防治植物病害的探索近年來成為相關(guān)研究的熱點。劉鳳英[4]從小麥新鮮根分離內(nèi)生菌，在防治小麥紋枯病上取得了較好的效果；宋光桃等[5]從油茶林土壤中分離出對油茶炭疽病具有拮抗作用的放線菌CF17；司美茹[6]從青海省5個縣的土壤中分離得到4株木霉菌、10株毛殼菌和2株放線菌，發(fā)現(xiàn)其對辣椒疫病均具有較好的抑制效果。然而，有關(guān)山核桃干腐病生物防治技術(shù)的報道還甚少。

當前，植物病害生物防治中應用較多的生防菌主要有木霉菌[7]、芽孢桿菌[8-10]、叢枝菌根真菌、毛殼菌等。芽孢桿菌是自然環(huán)境中廣泛存在的一類菌群，對許多植物病原菌具有較好的防病效果，被廣泛用作生防制劑[11-12]。研究人員現(xiàn)已圍繞芽孢桿菌生防菌的鑒定與篩選、促生作用、抗菌機制、防病能力與定殖效果等開展研究[13-15]。常文智等[16]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamylolyticus)能夠提高土壤酶活性，改善土壤微生物區(qū)系，從而提高土壤肥力，同時還對植物有促生作用和抗病作用，其中的活性物質(zhì)是脂肽類和聚酮類化合物的次級代謝產(chǎn)物[17]。在抗菌化合物中，環(huán)狀脂肽(LPs)，包括表面活性素surfactin、iturin和fengycin家族等賦予芽孢桿菌在植物根表定殖的能力[18]。實際應用中，生防菌常受環(huán)境因素影響，生防效果的穩(wěn)定性差異較大。如果生防菌能在植物體內(nèi)長期定殖，其生防效果就更能得到保證。

解淀粉芽孢桿菌WK1是作者團隊從土壤中篩選獲得的優(yōu)良菌株。前期室內(nèi)試驗表明，該菌株對葡萄座腔菌具有較好的抑制效果，且具有抑制多種植物病原菌的能力[19]，可用作山核桃干腐病的潛在生防菌。將用該菌株制成的菌液涂抹于發(fā)病樹樹干上有較好的控制效果，但山核桃樹干潰瘍的病斑很多，菌液涂抹的工作量太大，不適合大面積推廣。如果WK1菌株能定殖到根系表面或植物體內(nèi)則可起到植物自身免疫的作用。綠色熒光蛋白(GFP)標記[20]在實時、原位研究微生物的空間定位、微生物與環(huán)境和宿主的相互作用等方面展示了良好的應用前景[21-23]。為探尋WK1菌株在植物體內(nèi)和土壤中有效定殖的施用技術(shù)，本研究應用GFP標記法，開展盆栽試驗，探尋適宜WK1定殖的土壤pH值范圍，并在林地中使用不同的接種方式，尋找最佳的菌液施用方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

解淀粉芽孢桿菌WK1，菌種保藏號CGMCC No.11640。病原菌葡萄座腔菌系本實驗室分離保存。pNW33n-gfp質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院提供。

1.2 GFP-WK1菌株的構(gòu)建與檢驗

1.2.1 GFP-WK1菌株的熒光效果與基因檢驗

WK1的電擊轉(zhuǎn)化參考亓雪晨等[24]的方法。將轉(zhuǎn)化后的菌株立即移入LB復蘇液試管中，在30 ℃、180 r·min-1的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)3 h，涂布在含有氯霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取少量菌體涂片固定，在熒光顯微鏡下觀察，標記成功的會有明亮綠光。將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒利用gfp基因特異性引物(ATGAGTAAAGGAGAAGAACT、TTATTTGTATAGTTCATCCATG)進行PCR驗證，將成功標記的菌株命名為GFP-WK1。引物合成與基因測序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2 GFP-WK1菌株的遺傳穩(wěn)定性測定

挑取轉(zhuǎn)化子單菌落進行平板劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h，以未標記菌株WK1為對照，在SteREO Discovery.V12體式熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss)下檢測熒光?；罨疓FP-WK1，按照0.1%(體積分數(shù))的比例轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 h；再以相同比例將菌液轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，相同條件重復培養(yǎng)10次。每次轉(zhuǎn)接前，梯度稀釋10倍并均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計綠色熒光的菌落數(shù)和菌落總數(shù)，計算GFP-WK1在非選擇壓力下的穩(wěn)定性。

1.2.3 GFP-WK1菌株的生長動力學測定

挑取GFP-WK1單菌落接種至100 mL含有25 μg·mL-1氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1過夜培養(yǎng)，將菌懸液濃度稀釋到108CFU·mL-1，取100 μL菌液接種到含有25 μg·mL-1氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)，用WK1菌株作為對照，在相同處理下培養(yǎng)，每4 h測量一次菌液D600值，設(shè)置4個重復，測得WK1和GFP-WK1的生長特性。

1.2.4 GFP-WK1菌株的抑菌能力測定

采用平板對峙法測定GFP-WK1菌株的抑菌能力，簡述如下：采用穿刺接種法將病原菌接種在PDA平板中央，將WK1和GFP-WK1菌株分別接種至距離病原菌1.5 cm 處，并設(shè)置未接種菌株的對照CK，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到朝向菌株方向的病原菌菌落不再生長為止。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。

1.3 GFP-WK1菌株的定殖試驗

1.3.1 GFP-WK1在大田山核桃樹體和土壤中的定殖

在位于浙江省杭州市臨安區(qū)湍口鄉(xiāng)的山核桃林地和浙江農(nóng)林大學校園內(nèi)的山核桃林地開展試驗。分別采用葉面噴施(噴葉法)、根系澆灌(灌根法)和樹干滴注(掛液法)的方式接種GFP-WK1，菌液濃度均為4.8×109CFU·mL-1，每個處理3個重復，以無菌水處理為對照。噴葉法，使用噴霧器將菌液均勻噴于山核桃樹半側(cè)的葉片上，每株200 mL；灌根法，將200 mL菌液稀釋在山核桃根部直徑1 m范圍內(nèi)，用澆液瓶均勻地噴灑在土壤表面；掛液法，在山核桃樹根部30 cm處掛200 mL菌液，使用塑料針管緊密地插入樹干，避免菌液流出。分別在3、7、15、30、60 d對山核桃樹的根、莖、葉和土壤進行取樣，樹體各部位和土壤分別取3份樣品混勻。為了避免噴葉時部分液體落到土壤，采集未噴葉的另一側(cè)土壤。將植物樣品用無菌水漂洗后分為2份：一份用作莖、葉切片的原位鏡檢觀察；另一份植物樣品用作定量分析，稱取山核桃根、葉部位樣品0.5 g，表面使用75%(體積分數(shù))乙醇溶液消毒5 min，無菌水漂洗5次，加入2 mL無菌水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管，定容，搖勻振蕩30 min，2次梯度稀釋，吸取50 μL稀釋液，涂布于氯霉素平板上，30 ℃過夜培養(yǎng)，熒光顯微鏡下統(tǒng)計菌株定殖數(shù)量。土壤樣品浸提液涂平板后鏡檢觀察拍照或定量讀數(shù)。

1.3.2 GFP-WK1在不同pH土壤條件下的定殖規(guī)律

選擇臨安當?shù)厣胶颂移贩N，采集山核桃林土壤進行盆栽試驗，調(diào)節(jié)土壤pH值，設(shè)置3個處理：(1)pH=7.9，使用石灰石粉調(diào)節(jié)；(2)pH=6.8，原土壤；(3)pH=5.6，使用硫酸亞鐵調(diào)節(jié)。每個處理4個重復。將長出2片真葉的山核桃幼苗移栽至盆缽(直徑23 cm、高21.5 cm，內(nèi)含2.0 kg土壤)中，待幼苗穩(wěn)定成活后，將濃度為4.8×109CFU·mL-1的GFP-WK1菌液以3%的體積質(zhì)量比接種至土壤中，定期澆水，在培養(yǎng)3、7、15、30、60 d時取幼苗根系土壤和植物組織，運用與1.3.1節(jié)相同的方法對樣品進行處理，通過稀釋涂布平板法在熒光顯微鏡下統(tǒng)計標記菌株的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件整理所有數(shù)據(jù)，并采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，對有顯著(P<0.05)差異的處理采用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP-WK1的構(gòu)建與特性檢驗

2.1.1 GFP-WK1影像觀察和質(zhì)粒PCR驗證

用接種環(huán)挑取綠色熒光蛋白標記轉(zhuǎn)化后的菌株，接種于LB固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下檢測到菌株發(fā)綠色熒光(圖1)。將綠色熒光蛋白標記菌記為GFP-WK1，以菌體提取的質(zhì)粒作為模板，利用設(shè)計的gfp特異性引物進行擴增，在750 bp位置得到了一條清晰條帶，和預期的片段大小一致。以上結(jié)果說明，gfp基因已轉(zhuǎn)入標記菌株中。

2.1.2 GFP-WK1的遺傳穩(wěn)定性

連續(xù)稀釋培養(yǎng)試驗表明，隨著培養(yǎng)時間延長，質(zhì)粒仍能在WK1細胞中保持穩(wěn)定；繼代培養(yǎng)10次(50 h)后，含有氯霉素抗性且會發(fā)熒光的菌株占菌落總數(shù)的比例為92%，與前人研究結(jié)果一致[25]，表明質(zhì)粒在WK1細胞中較為穩(wěn)定。芽孢桿菌在實驗室環(huán)境、營養(yǎng)豐富的條件下20～30 min分裂1次，在自然條件下繁殖一代所需的時間為50～100 h[26]。據(jù)此認為，標記菌株適合長時期的定殖研究。

M為DNA相對分子質(zhì)量標準，1和2為GFP-WK1，3為WK1。M was DNA molecular marker， 1 and 2 were GFP-WK1， and 3 was WK1.圖1 GFP-WK1在熒光顯微鏡下的影像(A)和GFP質(zhì)粒PCR驗證結(jié)果(B)Fig.1 Fluorescence microscope image of GFP-WK1 (A) and PCR inspection result of GPF plasmid (B)

2.1.3 GFP-WK1的生長曲線

從GFP-WK1菌株和未標記菌株(WK1)的生長曲線(圖2)可以看出，GFP-WK1的生長趨勢和WK1基本一致。這表明外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入和綠色熒光蛋白的表達對菌株WK1的生長沒有明顯影響。

2.1.4 GFP-WK1的抑菌特性

通過平板對峙法比較GFP-WK1菌株和WK1菌株對葡萄座腔菌的抑制效果，由圖3可知， GFP-WK1對葡萄座腔菌的抑菌效果與WK1無明顯差異。以上結(jié)果說明，GFP-WK1可用來對WK1的生防效果和定殖規(guī)律進行研究。

圖2 WK1和GFP-WK1菌株的生長曲線Fig.2 Growth curve of WK1 and GFP-WK1

圖3 未標記菌株(WK1)和GFP-WK1菌株的抑菌效果Fig.3 Bacteriostatic effect of GFP-WK1 and WKI

2.2 GFP-WK1在山核桃樹體和土壤中的定殖動態(tài)

位于臨安區(qū)湍口鄉(xiāng)山核桃林地和浙江農(nóng)林大學校園內(nèi)的2處試驗點上GFP-WK1定殖的原位觀察結(jié)果如圖4所示。采用噴葉法、灌根法和掛液法接種均能使GFP-WK1菌株進入植物組織并在不同組織中轉(zhuǎn)移。灌根后，土壤中定殖的GFP-WK1數(shù)量豐富，噴葉法處理下葉片內(nèi)的GFP-WK1數(shù)量最多(部分圖片未呈現(xiàn))。

2.2.1 不同方法接種后GFP-WK1的定殖動態(tài)

對浙江農(nóng)林大學校園內(nèi)試驗點3種接種方式下60 d內(nèi)土壤、根、葉的菌株定殖量變化進行統(tǒng)計，結(jié)果如表1所示。采用噴葉法處理的山核桃樹根與土壤中GFP-WK1的定殖量在接種后呈先升高后下降的趨勢，噴葉第7天根部與土壤中GPF-WK1的定殖量達到最高，分別為0.91×106、0.32×106CFU·g-1，60 d時土壤中GFP-WK1的定殖量仍達到104CFU·g-1，表明GFP-WK1能夠通過葉面向下傳遞并定殖在土壤和山核桃樹根部。葉片部位GFP-WK1的定殖量一直呈下降趨勢，30 d后穩(wěn)定在105CFU·g-1。

采用掛液法處理后，山核桃樹根和葉部位的GFP-WK1定殖量呈先增加后穩(wěn)定的趨勢，其中，山核桃根部的GFP-WK1定殖量在30 d時最多(0.68×106CFU·g-1)，而葉面中GFP-WK1的定殖量在第7天時達到最多(0.61×106CFU·g-1)。土壤中GFP-WK1的定殖量表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，在60 d時仍保持在105CFU·g-1的水平，說明GFP-WK1能通過掛液法進入樹干，并可通過導管向根部和葉面?zhèn)鬟f，且菌數(shù)能保持在較高水平。

圖中箭頭所指亮點為GFP-WK1菌體。a，不接種菌株的空白對照在綠色熒光下的土壤樣品；b，接種WK1菌株在綠色熒光下的山核桃樹皮樣品；c，灌根法接種GFP-WK1菌株在綠色熒光下的土壤樣品；d，灌根法接種GFP-WK1在白光下的樹皮樣品；e，灌根法接種GFP-WK1在綠色熒光下的樹皮樣品；f，灌根法接種GFP-WK1在綠色熒光下的樹葉樣品；g，掛液法接種GFP-WK1在白光下的樹皮樣品；h，掛液法接種GFP-WK1在綠色熒光下的樹皮樣品；i，掛液法接種GFP-WK1在綠色熒光下的樹葉樣品。The bright spot indicated by the arrow in the figure is GFP-WK1. a， Soil of blank control under green fluorescence without strain inoculation; b， Carya cathayensis bark inoculated with WK1 under green fluorescence; c， Soil inoculated with GFP-WK1 by root irrigation under green fluorescence; d， Carya cathayensis bark inoculated with GFP-WK1 by root irrigation under white light ; e， Carya cathayensis bark inoculated with GFP-WK1 by root irrigation under green fluorescence; f， Carya cathayensis leaf inoculated with GFP-WK1 by root irrigation under green fluorescence; g， Carya cathayensis bark inoculated with GFP-WK1 by trunk injection under white light; h， Carya cathayensis bark inoculated with GFP-WK1 by trunk injection under green fluorescence; i， Carya cathayensis leaf inoculated with GFP-WK1 by trunk injection under green fluorescence.圖4 不同方法接種的GFP-WK1在山核桃林土壤和植物體內(nèi)的定殖示意圖Fig.4 Colonization of GFP-WK1 inoculated with different methods in soil and Carya cathayensis

表1 不同接種方法GFP-WK1的定殖動態(tài)

采用灌根法處理后，GFP-WK1在山核桃林地土壤、根部和葉面的定殖量在第3天最高，之后呈逐漸下降趨勢，且土壤中的定殖量顯著(P<0.05)高于根和葉中的定殖量，在60 d時土壤中GFP-WK1的定殖量為0.11×106CFU·g-1，而根和葉中GFP-WK1的定殖量處于104CFU·g-1水平。

2.2.2 不同土壤pH條件下GFP-WK1的定殖規(guī)律

選擇具有不同pH值的3種土壤開展山核桃幼苗盆栽接種GFP-WK1試驗，結(jié)果表明，在山核桃根、莖、葉組織中均可以分離檢測到GFP-WK1菌株(圖5)。3種土壤下，植物根內(nèi)的定殖量均高于莖和葉中的定殖量，接種初期差異最大，且差異顯著(P<0.05)，隨接種時間延長差異縮小，各部位GFP-WK1的定殖量亦總體下降。接種初期，根內(nèi)GFP-WK1的定殖量高達106CFU·g-1，在60 d時下降到105CFU·g-1水平。比較不同處理發(fā)現(xiàn)，當土壤pH值為7.9時，山核桃幼苗的根和莖中GFP-WK1的定殖量在第3天時最高，前期(3～30 d)下降幅度較大，30～60 d間下降幅度較小，趨于穩(wěn)定；葉中GFP-WK1的定殖量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在7 d時達到最高(3.46×105CFU·g-1)。當土壤pH值為6.8時，山核桃幼苗根內(nèi)GFP-WK1的定殖量變化規(guī)律與土壤pH值為7.9時相似，但莖和葉中GFP-WK1的定殖量均表現(xiàn)為先升后降的趨勢，莖中GFP-WK1的定殖數(shù)量在7 d時達到最高(5.40×105CFU·g-1)，而葉中GFP-WK1的定殖量在15 d時達到最高(5.20×105CFU·g-1)。當土壤pH值為5.6時，山核桃幼苗莖和葉中的GFP-WK1定殖量均呈先升高后下降的趨勢，在7 d時達到最高，分別為4.80×105、3.20×105CFU·g-1，且在各個時期根、莖、葉部位GFP-WK1的定殖量均存在顯著差異(P<0.05)。

同一時間柱上無相同字母的表示不同部位間差異顯著(P<0.05)。Bars marked without the same letters indicated significant difference within different parts at P<0.05 in the same time.圖5 當土壤pH值分別為5.6(A)、6.8(B)、7.9(C)時GFP-WK1在山核桃苗上的定殖動態(tài)Fig.5 Colonization dynamics of GFP-WK1 in pecan seedlings under soil pH of 5.6 (A)， 6.8 (B)， and 7.9 (C)

同一時間柱上無相同字母的表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。Bars marked without the same letters indicated significant difference within treatments at P<0.05 in the same time.圖6 GFP-WK1在不同pH值土壤上的定殖動態(tài)Fig.6 Colonization of GFP-WK1 in soil under different pH value

不同pH條件下，GFP-WK1在土壤上的定殖動態(tài)結(jié)果如圖6所示，可以看出，不同pH處理下土壤中GFP-WK1的定殖量隨時間推進基本呈下降趨勢，在30 d后趨于穩(wěn)定，且均以pH值6.8下最高。7 d時，pH值6.8土壤中的GFP-WK1定殖量顯著(P<0.05)高于pH值7.9土壤中GFP-WK1的定殖量，但其他時期不同處理間并無顯著差異。

3 討論

本研究表明，WK1菌株可被綠色熒光蛋白基因成功標記，并具有良好的遺傳穩(wěn)定性，其生長曲線和抑制效果與原菌基本一致，說明外源質(zhì)粒的導入對解淀粉芽孢桿菌WK1影響較小[27-28]，可用其追蹤菌株運動和定殖軌跡。

生防菌在自然環(huán)境中的作用取決于其在土壤或植物體的定殖能力和一定的定殖數(shù)量，這是其發(fā)揮生防作用的關(guān)鍵。原位觀察與定量結(jié)果表明，噴葉法、灌根法、掛液法這3種接種方法均能使GFP-WK1侵入山核桃樹體的不同部位，并能在山核桃樹體和土壤之間傳遞。GFP-WK1在葉面中主要定殖在葉細胞間和葉脈處，這和王珍等[29]報道的巨大芽孢桿菌在小白菜上的定殖規(guī)律基本一致。蔣曉玲等[30]研究發(fā)現(xiàn)，接種芽孢桿菌40 d后仍能從玉米根圍的土壤，以及玉米根、莖和葉部位分別檢測到106、105、104、103CFU·g-1的熒光標記菌。雖然隨著時間延長，土壤和植物各組織內(nèi)GFP-WK1的定殖量總體呈下降趨勢，但在60 d時仍能達到每克鮮樣(土/植物)104～105CFU的水平，說明WK1在植物體內(nèi)的定殖能力較強，且能夠達到發(fā)揮生防菌作用的水平[31-33]。

以植物體內(nèi)定殖量判斷，噴葉法接種GFP-WK1的效果在15 d時優(yōu)于掛液法，但15 d后掛液法的GFP-WK1定殖量高于灌根法和噴葉法。灌根法接種GFP-WK1后，山核桃根部GFP-WK1的定殖量在整個試驗期內(nèi)呈先下降再穩(wěn)定的趨勢，從長期定殖效果看，不如其他2種方法。灌根法效果差的原因是，GFP-WK1一次性接種于山核桃林土壤，自然環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)等條件改變導致菌株大量死亡。掛液法的接種過程中GFP-WK1定殖雖較為緩慢，但菌液袋內(nèi)的GFP-WK1能持續(xù)輸入山核桃樹體。噴葉法接種前期，GFP-WK1在葉片內(nèi)的定殖量較多，而土壤和根內(nèi)定殖量較少。這是因為葉表面積較大且具有氣孔，生防芽孢桿菌能夠較快速且大量地通過葉面進入山核桃樹體。雖然不同接種方法下GFP-WK1在山核桃樹內(nèi)和土壤中的定殖量隨著接種時間的變化規(guī)律不同，但從60 d時植物體內(nèi)菌種的接種數(shù)量看，掛液法能保證植物體內(nèi)有較多的GFP-WK1。

不同土壤pH條件下，根中菌株的定殖量均高于莖、葉部位，這與田濤等[34]得出的芽孢桿菌在根表定殖的菌體相對比莖葉定殖更為牢固的結(jié)論一致。原因可能是，根部代謝旺盛，可供芽孢桿菌利用的養(yǎng)分較多。在pH值6.8和5.6的土壤條件下，GFP-WK1在山核桃幼苗莖和葉中的定殖量呈先上升后下降的趨勢，而在pH值7.9的條件下僅葉部呈先上升后下降的趨勢。這表明解淀粉芽孢桿菌的最適pH值接近中性，堿性條件下其生長繁殖會受到抑制[35]。當前，山核桃林地中大部分土壤呈酸性，而施肥管理土壤較多呈中性。由此推測，解淀粉芽孢桿菌有望在當下的山核桃林中發(fā)揮較大作用。

總的來看，本研究發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白標記的解淀粉芽孢桿菌GFP-WK1和原始未標記菌株WK1相比，其生長曲線、抑菌能力無差異。據(jù)本試驗的研究結(jié)果判斷， WK1能夠通過噴葉法、灌根法和掛液法3種方式在土壤和山核桃樹體定殖和移動，定殖量隨時間的延長而下降。從60 d時植物體內(nèi)菌株的定殖量看，掛液法處理下山核桃樹體內(nèi)的GFP-WK1定殖量最多。不同土壤pH條件下，GFP-WK1在山核桃幼苗根、莖、葉部位的數(shù)量分布規(guī)律基本一致，在pH值為6.8的土壤中定殖量最多。鑒于GFP-WK1可在山核桃樹體和土壤中定殖，并能在樹體上下雙向移動，從短期定殖效果和施用方便的角度出發(fā)，推薦田間使用灌根法。將土壤pH值調(diào)到6.8，最有利于該菌株的作用發(fā)揮。長期使用的話，建議選擇掛液法，可使樹體菌株的定殖量保持穩(wěn)定。