徐 海，王 健，郭長(zhǎng)明，董洪燕，鄧碧華，侯繼波，*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014)

1985年Smith首次利用絲狀噬菌體表達(dá)外源基因，開啟了噬菌體展示技術(shù)的研究[1-2]。將外源DNA片段插入噬菌體基因組中，使外源基因與噬菌體衣殼蛋白基因融合表達(dá)，所編碼的外源蛋白被展示在噬菌體的表面，其最大優(yōu)勢(shì)在于將基因型與表型進(jìn)行統(tǒng)一。噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建與應(yīng)用進(jìn)一步擴(kuò)展了該技術(shù)的應(yīng)用范圍，例如蛋白質(zhì)之間的互作[3-4]、配體與受體的篩選[5-6]、生物標(biāo)記[7]、抗原表位發(fā)掘[8-9]、疫苗和藥物研制[10-12]等。用于構(gòu)建文庫(kù)的噬菌體包括絲狀噬菌體、T7噬菌體、T4噬菌體、λ噬菌體與MS噬菌體[13]等，不同噬菌體展示拷貝數(shù)、多肽長(zhǎng)度、展示末端，以及氨基酸偏好等方面有差異。目前，以氨基端展示的絲狀噬菌體和羧基端展示的T7噬菌體應(yīng)用較為廣泛，可以展示隨機(jī)氨基酸多肽文庫(kù)，也可構(gòu)建抗體可變區(qū)文庫(kù)。

1993年Hamers-Casterman等[14]發(fā)現(xiàn)駱駝血清中同時(shí)存在2種結(jié)構(gòu)免疫球蛋白：2條重鏈和2條輕鏈組成的傳統(tǒng)4鏈抗體；天然缺失2條輕鏈，僅有2條重鏈的特殊結(jié)構(gòu)抗體。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，駝科動(dòng)物、鯊魚和一些軟骨魚類的體內(nèi)也存在類似的抗體分子[15]。克隆該特殊抗體的重鏈可變區(qū)即可為單域抗體(Variable domain of heavy chain antibody， VHH)，由于VHH的相對(duì)分子質(zhì)量約為15 ku，僅為常規(guī)抗體的十分之一，因此也被稱為納米抗體。納米抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有較高的親和力和抗原結(jié)合特性，相對(duì)分子質(zhì)量小容易穿透組織屏障，易于生產(chǎn)制備和進(jìn)行基因工程改造，憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為替代單克隆抗體的理想選擇[16]。近年來，通過構(gòu)建納米抗體文庫(kù)進(jìn)行生物淘選已有廣泛的報(bào)道，涌現(xiàn)出許多新的研究成果，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步、納米抗體進(jìn)一步的完善，必將產(chǎn)生更加深遠(yuǎn)的影響[17-18]。

由于展示文庫(kù)的序列多樣性、拷貝數(shù)直接關(guān)系到生物淘選的得率，構(gòu)建高品質(zhì)的展示文庫(kù)一直是研究人員不斷的追求。本研究在常規(guī)噬菌體展示文庫(kù)構(gòu)建方法基礎(chǔ)上，通過擴(kuò)大羊駝血樣來源、優(yōu)化VHH基因擴(kuò)增引物、噬菌體載體的選擇，以及多次建庫(kù)等方式，構(gòu)建高品質(zhì)的羊駝源天然納米抗體T7噬菌體展示文庫(kù)，為后續(xù)文庫(kù)篩選工作的順利開展提供保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

健康成年羊駝6只，雌雄各半，分別飼養(yǎng)于揚(yáng)州、泰州動(dòng)物園，未經(jīng)過主動(dòng)免疫。外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自索萊寶公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、T4連接酶、T載體、限制性內(nèi)切酶等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自大連寶生物公司；T7 select 415-1b克隆試劑盒購(gòu)自Merck公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19-20]使用的引物以與GenBank公布的Lamapacos單鏈抗體序列進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，設(shè)計(jì)2對(duì)引物進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。其中F1位于抗體編碼的前導(dǎo)序列保守區(qū)，R1位于抗體CH2結(jié)構(gòu)域保守區(qū)，該對(duì)引物可擴(kuò)增出大小約1 000 bp的VH-CH1-CH2和700 bp的VHH-CH2片段；F2和R2-1、R2-2用于從VHH-CH2片段中擴(kuò)增約400 bp的VHH片段，如圖1所示。T7 select up和T7 select down擴(kuò)增T7噬菌體載體多克隆位點(diǎn)上下游片段，用于檢測(cè)外源基因的插入。文庫(kù)構(gòu)建與鑒定引物由擎科生物公司合成，如表1所示。

1.3 淋巴細(xì)胞總RNA提取與cDNA合成

頸靜脈采集6只羊駝抗凝血各5 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離，具體操作步驟參照說明書進(jìn)行。提取總RNA，Nanodrop測(cè)定含量。以總RNA為模板，分別以Random 6和Oligo dT2種引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 40 min；70 ℃ 15 min；12 ℃終止，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 VHH基因擴(kuò)增

以cDNA為模板，F(xiàn)1、R1為引物，PCR擴(kuò)增羊駝重鏈抗體可變區(qū)編碼基因，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；52 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，切膠回收約700 bp片段。以回收的片段為模板，再以F2、R2-1和R2-2為引物，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；50 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR擴(kuò)增約400 bp的VHH基因，膠回收目的條帶，Nanodrop定量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建與鑒定

圖1 VHH基因擴(kuò)增與噬菌體表面展示示意圖Fig.1 Schematic of VHH gene PCR amplification and phage surface display

表1 文庫(kù)構(gòu)建與鑒定引物

將回收的VHH基因以摩爾比3∶1與pMD18-T simple連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有Amp+/IPTG/X-gal LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，37 ℃過夜。計(jì)算菌落總數(shù)和藍(lán)色菌落數(shù)，計(jì)算質(zhì)粒文庫(kù)的容量和重組率。質(zhì)粒庫(kù)容量=菌落總數(shù)×轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量；重組率=(菌落總數(shù)-藍(lán)色菌落數(shù))/菌落總數(shù)×100%。剔除藍(lán)色菌落，收集培養(yǎng)皿中所有菌落，LB液體培養(yǎng)基重懸菌落，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，回收400 bp目的片段。

1.6 T7噬菌體展示文庫(kù)構(gòu)建

將質(zhì)粒文庫(kù)中酶切回收的VHH片段與同酶處理的T7 selectEcoRⅠ/HindⅢ載體以摩爾比1∶1.5連接，取5 μL連接產(chǎn)物與25 μL包裝蛋白混合，25 ℃反應(yīng)2 h，反應(yīng)體系中加入270 μL LB液體培養(yǎng)基終止反應(yīng)，即為拯救的噬菌體文庫(kù)。取5 μL包裝產(chǎn)物10倍梯度稀釋并與200 μL過夜培養(yǎng)的T7噬菌體宿主細(xì)菌BLT5403混合，經(jīng)雙層瓊脂夾心法測(cè)定噬菌體滴度，計(jì)算文庫(kù)容量；挑取單噬斑，PCR檢測(cè)目的基因插入情況，計(jì)算重組率。噬菌體庫(kù)容量=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×300；重組率=PCR陽(yáng)性噬斑數(shù)/檢測(cè)噬斑總數(shù)×100%。隨機(jī)挑選20個(gè)噬斑PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，采用DNAStar序列分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.7 T7噬菌體展示文庫(kù)的鑒定

將剩余的295 μL包裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)接100 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BLT5403，37 ℃搖床培養(yǎng)3 h至宿主菌完全裂解，PEG-NaCl沉淀法回收噬菌體，雙層瓊脂夾心法測(cè)定文庫(kù)滴度，Western-blot檢測(cè)噬菌體表面展示的納米抗體，通過揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心掃描電鏡觀察重組噬菌體形態(tài)。以MOI=1∶100轉(zhuǎn)接回收的噬菌體至新的BLT5403培養(yǎng)液，連續(xù)傳5代，噬斑PCR再次檢測(cè)重組率。

2 結(jié)果與分析

2.1 VHH基因擴(kuò)增與質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建

從6份羊駝抗凝血中分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，用F1、R1引物擴(kuò)增重鏈抗體可變區(qū)，分別得到1 000和700 bp兩條帶(圖2-A)。回收700 bp條帶作為模板，用F2、R2-1/R2-2引物擴(kuò)增得到約400 bp的VHH基因(圖2-B)。將VHH基因插入T載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，提質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得與預(yù)計(jì)大小相符的條帶，說明質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建成功(圖2-C)。經(jīng)過10次重復(fù)構(gòu)建，質(zhì)粒文庫(kù)的容量達(dá)到4.05×108CFU (colony-forming units)，見表2。

A、B，套式PCR擴(kuò)增羊駝重鏈抗體可變區(qū)；M，DL2000 marker；1-6，6份羊駝樣品。C，酶切鑒定VHH質(zhì)粒文庫(kù)；M，DL5000 marker；1，VHH質(zhì)粒文庫(kù)雙酶切鑒定。A, B, Heavy chain antibody variable region amplification by nested PCR; M, DL2000 marker; 1-6, Six alpaca samples. C: Identification of VHH plasmid library; M, DL5000 marker; 1, Enzyme digestion of VHH plasmid library.圖2 VHH基因擴(kuò)增與質(zhì)粒文庫(kù)鑒定Fig.2 PCR amplification of VHH gene and enzyme digestion of plasmid library

2.2 T7噬菌體展示文庫(kù)構(gòu)建

將VHH基因插入T7噬菌體p10B基因下游的多克隆位點(diǎn)，通過包裝蛋白包裝拯救重組噬菌體。測(cè)定每一次包裝產(chǎn)物的噬菌體滴度，均能達(dá)到108PFU (plaque forming unit)，混合5次拯救產(chǎn)物即為最終T7噬菌體展示文庫(kù)，庫(kù)容達(dá)到2.73×109PFU，滿足文庫(kù)篩選的要求，結(jié)果見表2。

2.3 T7噬菌體展示文庫(kù)的鑒定

用雙層瓊脂夾心法測(cè)定文庫(kù)滴度，隨機(jī)挑取噬菌體噬斑，用多克隆位點(diǎn)下游引物檢測(cè)VHH基因插入情況，成功插入外源基因的噬斑PCR可擴(kuò)增出約600 bp條帶而未插入外源基因的噬斑可擴(kuò)增出200 bp條帶。從圖3-A可以看出，VHH基因成功插入T7噬菌體基因組，重組率高達(dá)100%。將噬菌體展示文庫(kù)盲傳5代，噬斑形態(tài)大小不均一(結(jié)果未列出)，挑選10個(gè)正常大小噬斑(圖3-B，1-10)、10個(gè)偏大噬斑(圖3-B，11-20)進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中4個(gè)噬斑無(wú)VHH基因插入，該結(jié)構(gòu)說明構(gòu)建的噬菌體展示文庫(kù)中傳代過程中會(huì)出現(xiàn)目的基因丟失，重復(fù)傳代的文庫(kù)不能用于親和篩選。

T7 select 415-1b噬菌體侵染BL21大腸埃希菌，以415個(gè)拷貝形式展示50個(gè)氨基酸以內(nèi)的外源多肽，本研究通過更換BLT5403宿主，以p10B、p10B-VHH兩種蛋白組裝噬菌體頭部，首次嘗試對(duì)150個(gè)氨基酸大小的納米抗體進(jìn)行展示，故對(duì)納米抗體的表達(dá)與重組噬菌體顆粒結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步鑒定。利用p10B蛋白氨基端的Tag標(biāo)簽進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，從圖4可以看出，成功檢測(cè)到p10B、p10B-VHH兩種蛋白，納米抗體在噬菌體表面成功展示，但在p10B和p10B-VHH之間出現(xiàn)2條雜帶，暗示VHH基因在表達(dá)時(shí)存在提前終止現(xiàn)象。電鏡檢測(cè)顯示，T7噬菌體展示文庫(kù)樣品中觀察到完整的重組噬菌體顆粒(圖5-B)與對(duì)照T7 select 415-1b結(jié)構(gòu)相似，這一結(jié)果說明，通過2種結(jié)構(gòu)蛋白的組合可以組裝出完整的噬菌體顆粒，進(jìn)而突破外源蛋白長(zhǎng)度限制，提高噬菌體的展示能力。

2.4 VHH納米抗體序列分析

隨機(jī)挑取20個(gè)陽(yáng)性噬斑PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。通過與GenBank報(bào)道的羊駝源納米抗體序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，構(gòu)建的T7噬菌體文庫(kù)展示的均為羊駝抗體重鏈區(qū)序列。氨基酸多序列比對(duì)可見明顯的納米抗體特征區(qū)域，其中骨架區(qū)(FR1-4)氨基酸序列較為保守，而互補(bǔ)決定區(qū)(CD1-3)氨基酸序列差異較大，20個(gè)克隆的CD3區(qū)各不相同，間接說明構(gòu)建的文庫(kù)具有較高序列多樣性，見圖6。

表2 質(zhì)粒文庫(kù)(A)與噬菌體文庫(kù)(B)庫(kù)容

A，第1代文庫(kù)重組率測(cè)定；M，DL2000 marker；1-20，20個(gè)噬菌體噬斑PCR檢測(cè)；B，第5代文庫(kù)重組率測(cè)定；M，DL2000 marker；1-20，20個(gè)噬菌體噬斑PCR檢測(cè)。A, The recombination rate of the first generation of library; M, DL2000 marker; 1-20, PCR test of 20 unique phage clones; B, The recombination rate of the fifth generation of library; M, DL2000 marker; 1-20, PCR test of 20 unique phage clones.圖3 噬斑PCR檢測(cè)噬菌體展示文庫(kù)重組率Fig.3 Identification of recombinant phage by plaque PCR testing

M，預(yù)染蛋白Marker；1，T7 select 415-1b 噬菌體；2，第1代T7噬菌體展示文庫(kù)；3，第5代T7噬菌體展示文庫(kù)。M, Protein marker; 1, T7 select 415-1b phage; 2, The first generation of T7 phage display library; 3, The fifth generation of T7 phage display library.圖4 T7噬菌體衣殼蛋白Western-blot鑒定Fig.4 Western-blot of T7 phage capsid protein

A，T7 select 415-1b噬菌體；B，T7噬菌體納米抗體展示文庫(kù)。A, T7 select 415-1b phage; B, T7 phage displayed nano-antibody library.圖5 電鏡檢測(cè)噬菌體形態(tài)Fig.5 Electron microscopy observation of T7 phages

3 討論

噬菌體展示抗體文庫(kù)是親和篩選的重要工具，可分為免疫文庫(kù)和天然非免疫文庫(kù)[21]。對(duì)于天然非免疫文庫(kù)，序列多樣性是衡量文庫(kù)質(zhì)量的重要指標(biāo)。構(gòu)建的天然非免疫庫(kù)中應(yīng)避免重復(fù)序列的出現(xiàn)，以保證庫(kù)容量全部為有效容量，這樣可以從文庫(kù)中篩選到更多種類的抗體。為此，本研究通過比對(duì)已報(bào)道的羊駝抗體序列，選擇抗體前導(dǎo)區(qū)、CH2區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)引物，確保PCR擴(kuò)增的特異性；同時(shí)比對(duì)VHH基因并在引物設(shè)計(jì)時(shí)引入兼并堿基，以提高擴(kuò)增產(chǎn)物序列多樣性。另外，考慮到動(dòng)物個(gè)體差異，本研究采集6只羊駝外周血分離淋巴細(xì)胞用于VHH基因的擴(kuò)增，并經(jīng)多次質(zhì)粒文庫(kù)和噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建，進(jìn)一步提高序列的多樣性。隨機(jī)挑取20份陽(yáng)性噬斑PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析(圖6)，所測(cè)得序列的CDR3區(qū)各不相同，說明所采取的策略達(dá)到預(yù)期效果。

圖6 VHH納米抗體隨機(jī)克隆氨基酸多序列分析Fig.6 Nanobody amino acid sequence analysis

除了提高納米抗體序列多樣性，其在噬菌體表面的展示拷貝數(shù)亦至關(guān)重要。T7 select 415-1b載體能夠展示415拷貝50個(gè)氨基酸多肽，T7 select 10-3b載體能夠展示5～15拷貝1 200個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[22]。羊駝納米抗體是150個(gè)氨基酸的小分子蛋白，如何選擇合適的噬菌體載體實(shí)現(xiàn)納米抗體高效展示關(guān)系到后期文庫(kù)篩選親和力的強(qiáng)弱。本研究選擇T7 select 415-1b載體，借用BLT5403宿主表達(dá)的p10B蛋白與重組噬菌體表達(dá)p10B融合蛋白共同完成噬菌體衣殼的組裝，成功拯救出完整的重組噬菌體顆粒，實(shí)現(xiàn)高豐度展示文庫(kù)的構(gòu)建。既突破了T7 select 415-1b載體50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度限制，又比T7 select 10-3b載體展示拷貝數(shù)大幅提高。從Western-blot檢查結(jié)果(圖4)可以看出，宿主表達(dá)的p10B蛋白與重組噬菌體表達(dá)的p10B-VHH融合蛋白WB條帶顯示強(qiáng)度相當(dāng)，間接說明采用該模式可以大幅提高納米抗體表面展示拷貝數(shù)，但每個(gè)重組噬菌體展示的確切拷貝數(shù)目前尚無(wú)法測(cè)定。

由于首次采用T7 select 415-1b載體展示羊駝納米抗體，所構(gòu)建文庫(kù)的傳代穩(wěn)定與文庫(kù)中重組噬菌體的形態(tài)特性有待檢測(cè)。將文庫(kù)盲傳5代，雙層瓊脂夾心法測(cè)定噬菌體滴度發(fā)現(xiàn)，噬斑大小不均一，夾雜成斑快、直徑大的噬斑，PCR檢測(cè)顯示(圖3-B)部分噬菌體已丟失VHH基因，在無(wú)外源基因負(fù)載的情況下，生長(zhǎng)性能得到改善導(dǎo)致噬斑變大。因此，僅低代次噬菌體文庫(kù)可用于親和篩選的研究。T7噬菌體表面高拷貝展示納米抗體分子，分子間的空間位阻可能影響噬菌體頭部的組裝，電鏡觀察顯示，文庫(kù)中的重組噬菌體(圖5-B)與供體噬菌體T7 select 415-1b(圖5-A)表現(xiàn)相同的形態(tài)特征，說明通過p10B與p10B-VHH兩種蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)噬菌體頭部的正確組裝，但二者的比例可能由噬菌體根據(jù)空間位阻情況自行調(diào)整。

噬菌體展示技術(shù)建立以來，構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫(kù)進(jìn)行親和篩選的研究已有諸多報(bào)道[23-24]。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高羊駝天然納米抗體噬菌體展示文庫(kù)的序列多樣性與表面展示拷貝數(shù)，構(gòu)建高品質(zhì)文庫(kù)進(jìn)而應(yīng)用于親和篩選的研究工作。