任百潔，劉 悅，李雨陽，鄒馨穎，孔 晨,王 雷

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科，吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021)

牙周炎是造成牙齒松動(dòng)的主要口腔炎癥性疾病，牙菌斑是其始動(dòng)因子。菌斑堆積引起多種炎癥細(xì)胞因子大量分泌，激活破骨細(xì)胞，最后造成牙槽骨不可逆性吸收，出現(xiàn)牙齒松動(dòng)、脫落[1,2]。抑制牙槽骨吸收，促進(jìn)牙周組織再生已成為當(dāng)今口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[3]。對(duì)于新型藥物或者新型治療方法的研發(fā)在臨床試驗(yàn)階段之前，必須經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。由于大鼠取材方便且操作簡單，因此大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型被大量應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

結(jié)扎絲誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型是建立牙周炎模型最普遍的方法之一[4]。與人牙周炎類似，實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型中同樣可以檢測(cè)到炎癥細(xì)胞因子大量分泌及牙槽骨大量吸收[5]。雖然結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎模型被廣泛應(yīng)用于牙周炎的各類研究中，但缺乏對(duì)其炎癥動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行進(jìn)一步的分析。此外，大鼠的齦溝上皮為角化上皮，與人類不同，其抗炎及自愈能力很強(qiáng)，因此大鼠與人的牙周炎的炎癥動(dòng)態(tài)變化可能略有不同[6]。筆者使用結(jié)扎誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型評(píng)估大鼠牙周炎癥動(dòng)態(tài)變化，為后續(xù)對(duì)牙周炎模型的研究提供新的方向，為更好更準(zhǔn)確地進(jìn)行臨床研究鑒定基礎(chǔ)。

本研究通過觀測(cè)大鼠體重變化，探究結(jié)扎絲的介入對(duì)炎癥過程的影響，通過軟垢指數(shù)、齦溝出血指數(shù)及牙齒松動(dòng)度的監(jiān)測(cè)，評(píng)估結(jié)扎21 d內(nèi)目標(biāo)牙牙周炎癥變化，此外，為了更精確地評(píng)估炎癥階段牙槽骨的動(dòng)態(tài)變化，使用斷層掃描(CBCT)觀察牙槽骨標(biāo)本的顯微三維(3D)結(jié)構(gòu)圖像，從而使被測(cè)樣品復(fù)雜的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)化。通過上述研究手段，更精準(zhǔn)地分析結(jié)扎誘發(fā)的大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的炎癥動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要器械

6～8周雄性SD大鼠(吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，中國)18只,體重(230±20)g。10%福爾馬林、結(jié)扎絲(杭州奧索醫(yī)療器械有限公司，中國)；錐形束CT儀(CBCT)(Carestream Health,美國)。

1.2 方法

1.2.1建立牙周炎模型 參照Breivik等[7]的研究,采用單純結(jié)扎法建立大鼠牙周炎模型,具體如下:大鼠稱重，按每100 克體重腹腔注射麻藥(10%水合氯醛)0.35 μL,仰臥位固定大鼠,開口器輔助開口，完整暴露上頜雙側(cè)第一磨牙,牙齦分離器分離牙齦,結(jié)扎絲環(huán)上頜第一恒磨牙1周后結(jié)扎固定,每只大鼠采取右側(cè)側(cè)結(jié)扎，左側(cè)對(duì)照，結(jié)扎固定處以不妨礙大鼠進(jìn)食及不破壞大鼠頰側(cè)黏膜為準(zhǔn)，最后確保結(jié)扎絲位于齦下,見圖1。

1.2.2分組處理 SD大鼠健康,體重分布均勻，無疾患，飼養(yǎng)條件為(23±1) ℃、(60±5) %相對(duì)濕度和12 h明/暗周期。將大鼠其隨機(jī)分成7組,每組3只,正常對(duì)照組不做任何處理，結(jié)扎組A～F分別結(jié)扎1、3、5、7、14、21 d后處死。此外，結(jié)扎組A～F大鼠均為右側(cè)結(jié)扎，左側(cè)不結(jié)扎，各分組操作流程如圖1。實(shí)驗(yàn)操作都符合吉林大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)及實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，并盡可能減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，同時(shí)操作中減少刺激帶來的不適，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后動(dòng)物以脫臼安樂死的方法處死，動(dòng)物尸體委托學(xué)校動(dòng)物中心處理。

注：黑色箭頭所示為空白對(duì)照第一磨牙，白色箭頭所示為目標(biāo)牙結(jié)扎后，所示為各組處死時(shí)間圖1 大鼠牙周炎模型及分組操作圖Fig 1 Rat periodontitis model and grouping operation diagram

1.2.3體重及臨床指標(biāo)觀察 大鼠適應(yīng)性培養(yǎng)后，以大鼠結(jié)扎后第1天計(jì)為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的第1天，每日于中午12點(diǎn)稱重，直至處死，取平均值作為每一組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

簡化軟垢指數(shù)(debris index simplified,DIS)以視診為主，輔助鐮形探針，根據(jù)目標(biāo)牙面軟垢覆蓋程度分級(jí)記分。0=牙面無軟垢或著色；1=軟垢覆蓋牙面低于頸1/3,或牙面上出現(xiàn)外源性著色；2=軟垢覆蓋牙面1/3以上,但不超過牙面2/3；3=軟垢覆蓋牙面2/3以上,所有牙面軟垢記分總和除以受檢查牙面即為該患者的軟垢指數(shù)分值)[8]。

齦溝出血指數(shù)(sulcus bleeding index,SBI)用鈍頭牙周探針放入齦緣下≤1 mm的位置,因腭側(cè)更易觀察，所以每牙選近中腭、腭側(cè)、遠(yuǎn)中腭側(cè)3個(gè)點(diǎn),輕輕沿齦緣滑動(dòng)后觀察出血程度,取其均值作為此牙的齦溝出血指數(shù)。0表示齦緣和齦乳頭外觀健康,輕探牙齦溝后不出血；1表示齦緣和齦乳頭呈輕度炎癥,輕探齦溝后出血；2表示牙齦呈輕度炎癥,有顏色改變,無腫脹或水腫,探診后點(diǎn)狀出血；3表示牙齦呈中度炎癥,有顏色改變和輕度水腫,探診后出血,血溢在齦溝；4牙齦呈重度炎癥,不但有色的改變,并且有明顯腫脹,探診后出血,血溢出齦溝；5表示牙齦有色的改變,明顯腫脹,有時(shí)有潰瘍,探診后出血或自動(dòng)出血[9,10]。

牙齒松動(dòng)度(tooth mobility,TM)[11]以目標(biāo)牙向頰舌向松動(dòng)為1分,患牙向頰舌向及近中遠(yuǎn)中向均松動(dòng)為2分,患牙向頰舌向及近中遠(yuǎn)中向、垂直向均松動(dòng)為3分。

1.2.4CBCT分析 結(jié)扎后按圖1所示時(shí)間脊椎脫臼法處死大鼠。取雙側(cè)上頜骨,去除結(jié)扎絲及軟組織后將標(biāo)本固定于10%福爾馬林溶液中并使用相機(jī)對(duì)組織進(jìn)行拍照，然后使用CBCT (電壓65 kV,電流2.2 mA,總劑量75 mm Gy·cm2)精確測(cè)量各組第一磨牙牙槽骨吸收情況并進(jìn)行分析。各樣本第一磨牙釉牙骨質(zhì)界 (cemento-enamel junction,CEJ)至牙槽嵴頂 (alveolar bone crest,ABC)的距離作為ABL值，分別測(cè)量頰、腭側(cè)的近、中、遠(yuǎn)6個(gè)位點(diǎn),取均值作為牙槽骨吸收測(cè)量值[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重記錄

所有大鼠為隨機(jī)分組，體重分布較為均勻(220～240 g)，正常對(duì)照組在觀察的21 d內(nèi)體重持續(xù)增長；其余結(jié)扎組在結(jié)扎后3 d體重均為下降趨勢(shì)，第3天體重開始恢復(fù)上升。自3 d后各結(jié)扎組與正常對(duì)照組具有相似的體重增長率，各組實(shí)驗(yàn)3～21 d的體重增長率均在1.0%～1.1%范圍內(nèi)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。說明由于結(jié)扎絲的介入，大鼠會(huì)出現(xiàn)3 d的適應(yīng)性現(xiàn)象，而在結(jié)扎3 d后結(jié)扎絲即對(duì)大鼠生長發(fā)育不會(huì)產(chǎn)生影響。

注：紅色示正常對(duì)照組21 d體重變化，黑色示結(jié)扎組A～F圖2 大鼠體重記錄圖Fig 2 Rat weight record

2.2 臨床指標(biāo)結(jié)果分析

結(jié)扎側(cè)與正常對(duì)照側(cè)在未結(jié)扎前的DIS、SDI、TM均為0，正常對(duì)照側(cè)在21 d內(nèi)DIS、SDI、TM值無變化。結(jié)扎側(cè)DIS在結(jié)扎后第1、3、5、7天較正常對(duì)照側(cè)明顯升高(P<0.05)，且DIS值在前3 d呈上升狀態(tài)，第5天開始逐漸下降，直至結(jié)扎第21天下降至與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)扎側(cè)SDI在第5天明顯升高，第7天達(dá)到峰值后逐漸下降(P<0.05)，直至結(jié)扎第21天與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)扎側(cè)TM第7天開始出現(xiàn)變化，直至第21天逐漸上升，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表1。

A～D依次為：正常對(duì)照側(cè)第一磨牙、結(jié)扎后軟垢、探針出血、牙齦萎縮，黃色箭頭示軟垢已覆蓋目標(biāo)牙，紅色箭頭示探診后出血,血溢出齦溝，白色箭頭示目標(biāo)牙結(jié)扎后第一磨牙與第二磨牙間牙齦已出現(xiàn)萎縮，牙根部分暴露圖3 臨床指標(biāo)檢查圖Fig 3 Examination of clinical indicators

表1 結(jié)扎組和正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)DIS、SDI、TM值比較Tab 1 Comparison of DIS,SDI,and TM values at different time points between the ligation group and the normal control group(n=3,

2.3 CBCT檢測(cè)結(jié)果

直視下可見目標(biāo)牙牙槽骨吸收情況，結(jié)扎組A目標(biāo)牙牙槽嵴頂近釉牙骨質(zhì)界，周圍骨質(zhì)未吸收；結(jié)扎組D、E、F牙槽骨吸收量明顯高于其余組，以第一磨牙與第二磨牙結(jié)扎區(qū)骨吸收最嚴(yán)重，見圖4。CBCT統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：結(jié)扎組A(0.34±0.13)、B(0.38±0.09)、C(0.44±0.08)的CEJ-ABC距離與正常對(duì)照組(0.35±0.11)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)扎組D(0.59±0.08)、E(1.00±0.25)、F(2.03±0.52)的CEJ-ABC距離明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，且F組與D、E組對(duì)比骨吸收更加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

A～F依次為：結(jié)扎組A、結(jié)扎組B、結(jié)扎組C、結(jié)扎組D、結(jié)扎組E、結(jié)扎組F。白色箭頭所示為目標(biāo)牙，紅色箭頭所示為骨吸收。圖4 上頜第一磨牙牙槽骨吸收?qǐng)DFig 4 Alveolar bone resorption of maxillary first molar

注：橫線表示兩組間的比較，*P<0.05，***P<0.01圖5 CBCT示CEJ-ABC距離的比較Fig 5 CBCT shows CEJ-ABC distance comparison

3 討論

牙周炎是一種以牙齒松動(dòng)為主要臨床癥狀的慢性感染性疾病，最新研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎除了與糖尿病、心腦血管疾病密切相關(guān)，還可能導(dǎo)致肝臟損傷及阿爾茲海默癥，嚴(yán)重影響中老年人的身體健康[13,14]，所以牙周炎的研究對(duì)于人類健康至關(guān)重要。牙周炎是一個(gè)連續(xù)的炎癥發(fā)展過程，分為4個(gè)時(shí)期：始發(fā)期、早期病變、病損確立期及進(jìn)展期，每個(gè)階段既互相聯(lián)系、過渡，又各自相對(duì)獨(dú)立[15,16]。始發(fā)期表現(xiàn)為急性滲出性炎癥反應(yīng)：齦溝上皮血管擴(kuò)張，通透性增加，即出現(xiàn)齦溝探診出血現(xiàn)象[17]。進(jìn)展期為持續(xù)性的炎癥破壞過程，深牙周袋形成、牙槽骨吸收破壞明顯,此期臨床可出現(xiàn)明顯牙齒松動(dòng)癥狀[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過大鼠21 d動(dòng)態(tài)體重變化聯(lián)合不同時(shí)間點(diǎn)臨床指標(biāo)分析：所有結(jié)扎組大鼠體重變化在前3 d呈下降趨勢(shì)，軟垢指數(shù)在前3 d呈上升趨勢(shì)，表明大鼠在結(jié)扎后進(jìn)食及正常磨牙受結(jié)扎絲影響很大，造成軟垢大量堆積，在結(jié)扎3 d后大鼠出現(xiàn)適應(yīng)現(xiàn)象，恢復(fù)正常進(jìn)食磨牙，體重逐漸上升，軟垢指數(shù)也隨著大鼠正常磨牙進(jìn)食開始呈下降趨勢(shì)，故結(jié)扎第3天是實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型DIS值的峰值。隨著軟垢堆積，結(jié)扎的第一磨牙在第3天出現(xiàn)明顯的探診出血，即結(jié)扎第3天為牙周炎始發(fā)期。第7天達(dá)到SDI峰值，隨后SDI值開始下降，故隨著軟垢堆積，在結(jié)扎后1周炎癥達(dá)到峰值，故結(jié)扎后3～7 d為急性炎癥期。隨后，結(jié)扎第14天結(jié)扎側(cè)出現(xiàn)明顯的牙齒松動(dòng)，且TM值從出現(xiàn)至21 d一直為上升狀態(tài)，故推測(cè)結(jié)扎后兩周，實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠由急性牙周炎轉(zhuǎn)為慢性牙周炎階段，即為牙周炎的慢性進(jìn)展期。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明結(jié)扎絲結(jié)扎后3 d誘發(fā)大鼠產(chǎn)生牙周組織炎癥，即為牙周炎始發(fā)期；結(jié)扎誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎在結(jié)扎的3～7 d處于急性炎癥期；14～21 d轉(zhuǎn)為慢性炎癥階段，為慢性牙周炎的進(jìn)展期。

本實(shí)驗(yàn)首次根據(jù)炎癥指標(biāo)分析了結(jié)扎誘發(fā)的牙周炎大鼠的炎癥動(dòng)態(tài)變化，更加精細(xì)地定義了炎癥始發(fā)期及進(jìn)展期時(shí)間，為后續(xù)對(duì)大鼠牙周炎模型的研究提供了新的方向，為更好更準(zhǔn)確地進(jìn)行臨床研究奠定基礎(chǔ)。