廖 亮，楊國輝

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院MICU，貴州 貴陽 550004)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是臨床上多發(fā)的幾種惡性腫瘤之一，國外報(bào)道約占肺癌患者總?cè)藬?shù)的80%[1]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究的進(jìn)展，肺癌早期診斷、治療和預(yù)后均取得了長足進(jìn)步，但患者5年生存率仍在15%左右[2]，而其中原因之一是肺癌細(xì)胞在人體內(nèi)的過早轉(zhuǎn)移。在非小細(xì)胞肺癌中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要而獨(dú)特的作用[3-5]，有研究表明它是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的一個(gè)機(jī)制復(fù)雜的生物學(xué)行為[3]。當(dāng)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞將失去原來正常的細(xì)胞極性，并逐步獲得間質(zhì)細(xì)胞的某些特點(diǎn)，例如增強(qiáng)的遷移和侵襲能力等，同時(shí)，還伴隨著相關(guān)基因表達(dá)的改變[6]，其中N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和轉(zhuǎn)錄因子(Snail)等已成為檢測EMT發(fā)生的特異分子標(biāo)記物[7,8]。

嵌合內(nèi)含子(chimeric intron)是由人β-球蛋白第一個(gè)內(nèi)含子5'端剪切序列與人免疫球蛋白IgG重鏈可變區(qū)中內(nèi)含子3'端剪切序列組合而成[9]。有研究表明，嵌合內(nèi)含子能夠提高蛋白在體外的表達(dá)[10-12]以及能顯著促進(jìn)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)在小鼠體內(nèi)的表達(dá)[10]。還有研究證實(shí)，它能提高綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在293T細(xì)胞中的表達(dá)[13]。在中華倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)中還能大幅度提高重組神經(jīng)生長因子的表達(dá)，并且證明其調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有方向性[14]。因此，本研究的目的是通過在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9中表達(dá)嵌合內(nèi)含子重組質(zhì)粒，觀察其對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力的改變以及對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司；Matrigel轉(zhuǎn)移小室由Corning公司生產(chǎn)；DNA轉(zhuǎn)染試劑購自北京碼因生物科技公司；總RNA提取Trizol試劑以及PCR試劑購自Invitrogen公司；gDNA Eraser、Reverse Transcription、T4 DNA Ligase試劑盒以及SYBR?Green試劑盒購自Takara公司；PCR儀購于美國賽默飛公司StepOnePlusTM；雙熒光酶檢測試劑采用購自于GeneCopoeia公司的Luc-PairTMDuo-Luciferase；psiCHECK-2載體購自于美國Promega公司；Western Blotting多克隆抗體以及二抗均購自美國賽默飛(ThermoFisher)公司。PC-9細(xì)胞及E.coliDH5α感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以psiCHECK-2中的內(nèi)含子為模板，根據(jù)psiCHECK-2質(zhì)粒圖譜(圖1)[15]，分別設(shè)計(jì)包含有相關(guān)酶切位點(diǎn)的特異性引物，由上海生工公司合成,見表1。此嵌合內(nèi)含子已存在于psiCHECK-2雙熒光素酶報(bào)告載體SV40啟動子的下游。利用PCR技術(shù)將擴(kuò)增內(nèi)含子目的基因片段。然后將目的基因產(chǎn)物插入并連接到海腎熒光素酶報(bào)告基因的下游多克隆位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布LB平板，挑取單克隆后進(jìn)行增菌培養(yǎng)，分別用于PCR鑒定和基因測序鑒定。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

圖中箭頭方向代表基因轉(zhuǎn)錄方向。hRluc+代表海腎熒光素酶cDNA。hluc+代表螢火蟲熒光素酶cDNA。ApaI和MluI分別代表兩個(gè)酶切位點(diǎn)。hluc+上游∧符號代表插入的嵌合內(nèi)含子基因。圖1 psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖Fig 1 psiCHECK-2-Intron recombinant plasmid vector structure diagram

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基中加入非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9并用移液槍充分吹打混勻，放置在培養(yǎng)箱中，溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，培養(yǎng)48 h，每間隔24 h更換培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞完全貼壁以后，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-9細(xì)胞按照英格恩公司EntransterTM-H4000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 按照Invitrogen公司說明書使用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，并按照Takara公司逆轉(zhuǎn)錄的方法合成cDNA。引物由生工(上海)公司合成(見表1)。PCR反應(yīng)體系分別包括cDNA0.5 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，無菌水8.5 μL。參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性2 min，再進(jìn)行95 ℃，30 s；65 ℃，30 s；72 ℃，30 s(總共30個(gè)循環(huán))，最后72 ℃，5 min延伸。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4雙熒光素酶活性檢測 將PC-9細(xì)胞從-80 ℃冰箱取出，每個(gè)孔加入80 μL細(xì)胞裂解液。在搖床中以250 r/min，20 ℃，10 min充分搖勻使細(xì)胞裂解。準(zhǔn)備一個(gè)黑色96孔檢測板，每個(gè)樣品分3次重復(fù)孔加入，然后每孔分別加入已事先準(zhǔn)備好的兩種底物SubⅠ和SubⅡ，上機(jī)檢測(BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀)。通過計(jì)算海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶底物熒光比值來測定熒光素酶的相對活性。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到12孔板中，并且當(dāng)細(xì)胞粘附至壁后24 h后將其轉(zhuǎn)染。48 h后使用100 μL移液管槍頭在融合細(xì)胞層上垂直劃出一條直線。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的多余細(xì)胞后，加入含4%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，此時(shí)記錄為0 h。在0～24 h內(nèi)，使用顯微鏡記錄同一位置的刮擦寬度。劃痕愈合率(%)= [劃痕寬度(T0-T24)/劃痕寬度T0]×100%(T0表示在0 h處的劃痕寬度，T24表示24 h之后的劃痕寬度)。實(shí)驗(yàn)被獨(dú)立地重復(fù)3遍，并且從每個(gè)孔中隨機(jī)選擇3個(gè)位置記錄，從每個(gè)孔中取平均值以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用Matrigel基質(zhì)膠和1640培養(yǎng)基按1∶8比例混勻稀釋，取100 μL均勻鋪在Transwell上室，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell的上室，并加入200 μL無血清1640培養(yǎng)基。在Transwell的下室加入1640完全培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)48 h后用醫(yī)用滅菌棉棒輕輕拭去上室的細(xì)胞，再用甲醇溶液將細(xì)胞固定30 min，然后用結(jié)晶紫染料進(jìn)行細(xì)胞染色20 min，最后將殘余的染料用PBS緩沖液洗去。重復(fù)3次，每次在顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)觀察野并進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，記錄均數(shù)用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting) 將psiCHECK-2空白載體和psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞中，72 h后，用PIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度并制備樣品。配置SDS-PAGE膠，每孔上樣蛋白樣品25 μg，蛋白質(zhì)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%BSA封閉1 h，再加入稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔(二抗)，37 ℃孵育2 h，TBST重復(fù)漂洗3次，每次10 min，HRP化學(xué)發(fā)光液顯影，GAPDH做為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒的構(gòu)建

以psiCHECK-2載體為模板，利用含ApaI和MluI酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增Intron基因，設(shè)計(jì)長度為133 bp，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，目的片段長度和預(yù)期結(jié)果相符，見圖2A。然后將psiCHECK-2質(zhì)粒和Intron目的片段雙酶切(ApaI和MluI)，回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶在16 ℃水浴中進(jìn)行連接，獲得重組載體psiCHECK-2-Intron后，將其轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)氨芐青霉素LB平板篩選后，挑取單克隆，PCR鑒定，見圖2B。

2.2 重組載體psiCHECK-2-Intron的測序鑒定

將PCR鑒定成功的陽性克隆送至上海生工進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果證實(shí)插入的chimeric intron基因序列正確，無突變和缺失，表明重組質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建成功，見圖3。

A：M:DL2000 DNA Marker;1:Intron基因擴(kuò)增結(jié)果 B：M:DL5000DNAMarker：1：Intron目的片段 2：Intron目的片段雙酶切 3：psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒4：psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒雙酶切圖2 Intron目的基因以及psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒雙酶切及PCR鑒定Fig 2 Intron target gene and psiCHECK-2-Intron plasmid double restriction digestion and PCR identification

圖3 重組質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron部分測序結(jié)果(方框內(nèi)為插入的嵌合內(nèi)含子目的基因片段序列)Fig 3 Partial sequencing results of recombinant plasmid psiCHECK-2-Intron (the sequence of the inserted chimeric intron target gene fragment is in the box)

2.3 RT-PCR鑒定psiCHECK-2-Intron在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

將構(gòu)建成功的psiCHECK-2-Intron重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞并裂解，用Trizol提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用合成引物qRL和qFL；PCR擴(kuò)增出海腎熒光素酶及螢火蟲熒光素酶目的基因片段，見圖4。長度分別122 bp和174 bp。結(jié)果表明，重建的psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒能夠在PC-9細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄。

M:DL2000 DNA Marker;1：海腎熒光素酶基因片段122bp(A圖)&螢火蟲熒光素酶基因片段174 bp(B圖);2：psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒(雙酶切)圖4 psiCHEKC-2-Intron轉(zhuǎn)染PC-9細(xì)胞后PCR鑒定結(jié)果Fig 4 PCR identification results of PC-9 cells transfected with psiCHEKC-2-Intron

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測psiCHECK-2-Intron在真核細(xì)胞中的表達(dá)

將psiCHECK-2空白載體作為對照，轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞中的psiCHECK-2-Intron質(zhì)粒所攜帶的兩種熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)后所發(fā)出的特定波長的熒光均可被BioTekSynergy 2多功能酶標(biāo)儀所檢測到,見圖5。證實(shí)兩種熒光素酶基因均能夠在PC-9細(xì)胞中順利表達(dá)。與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測海腎和螢火蟲兩種熒光素酶表達(dá)活性Fig 5 Dual luciferase reporter gene detection of renilla and firefly luciferase expression activity

2.5 Intron對PC-9細(xì)胞遷移的影響

將psiCHECK-2空白載體作為對照組，psiCHECK-2-Intron作為實(shí)驗(yàn)組，通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測嵌合內(nèi)含子表達(dá)對PC-9細(xì)胞遷移的影響。24 h后，空白對照組劃痕愈合度為(63.460±1.745)%，內(nèi)含子組的愈合度為(41.370±1.672)%,見圖6。以上結(jié)果表明嵌合內(nèi)含子抑制了PC-9細(xì)胞的遷移能力(P?0.001)。

A：細(xì)胞劃痕圖片，B：劃痕愈合度(%)計(jì)數(shù)柱狀圖圖6 chimeric intron表達(dá)對PC-9細(xì)胞遷移能力的影響Fig 6 The effect of chimeric intron expression on the migration ability of PC-9 cells

2.6 Intron對PC-9細(xì)胞侵襲的影響

Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組中穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為(98.430±3.000)個(gè)，Intron組為(41.670±4.163)個(gè),見圖7。提示內(nèi)含子組的PC-9細(xì)胞侵襲能力降低(P<0.001)。

A：細(xì)胞侵襲圖片 B：細(xì)胞計(jì)數(shù)柱狀圖圖7 嵌合內(nèi)含子表達(dá)對PC-9細(xì)胞株侵襲能力的影響Fig 7 The effect of chimeric intron expression on the invasion ability of PC-9 cell line

2.7 Intron對EMT相關(guān)分子標(biāo)記物表達(dá)的影響

將psiCHECK-2-Intron表達(dá)重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞，48 h后通過Western-blotting和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分別從蛋白和mRNA水平檢測N-cadherin、β-catenin、以及Snail 3種EMT相關(guān)分子標(biāo)記物的表達(dá)情況。與對照組相比，Intron組明顯降低了N-cadherin、β-catenin和Snail的表達(dá)(P<0.001，P<0.01)，見圖8。

A：qRT-PCR檢測N-cadherin、β-catenin、Snail的表達(dá)。B：Westernblotting檢測N-cadherin、β-catenin、Snail的表達(dá)圖8 嵌合內(nèi)含子對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的影響Fig 8 The effect of chimeric introns on the expression of molecular markers related to epithelial-mesenchymal transition

3 討論

影響外源基因表達(dá)的因素有很多，比如啟動子、沉默子、增強(qiáng)子、信號肽及所處的表達(dá)條件等[13]。在哺乳動物中，內(nèi)含子作用和功能直到最近才被人們所認(rèn)識[16]。某些特定的內(nèi)含子可能包含一個(gè)或多個(gè)可以促進(jìn)基因表達(dá)的生物學(xué)特征，有研究表明內(nèi)含子可能包括了某些增強(qiáng)元件[17]或特定序列[18]從而促進(jìn)了翻譯的過程。還有一些內(nèi)含子對于基因的表達(dá)有直接或間接的抑制作用[19,20]。而且內(nèi)含子在不同細(xì)胞系中的作用也存在差異，Huang等[21]討論了嵌合內(nèi)含子序列IVS對氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)在不同細(xì)胞中的表達(dá)的影響，他們發(fā)現(xiàn)CAT表達(dá)活性最高的是在中華倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)中，其次是在人腎上皮細(xì)胞系(293T)中，最低的是在海拉細(xì)胞系(Hela)中。另外，內(nèi)含子上游不同的啟動子對其功能的發(fā)揮也存在影響，Xu等[22]比較了內(nèi)含子在兩個(gè)啟動子SV40與CMV的啟動下對熒光素的表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)CMV是SV40作用的兩倍。

為了研究內(nèi)含子在肺癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)通過雙熒光素酶報(bào)告載體將內(nèi)含子插入到海腎熒光素酶下游的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至PC-9細(xì)胞株中得以表達(dá)，研究其對PC-9細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力以及EMT的影響。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤細(xì)胞在人體中的遷移和侵襲過程，顯示PC-9細(xì)胞侵襲能力的降低。然后進(jìn)一步檢測了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)3種分子標(biāo)志物：N-cadherin、Snail和β-catenin的表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)嵌合內(nèi)含子下調(diào)了以上3種標(biāo)志物的表達(dá)，這說明該內(nèi)含子在一定程度上抑制了PC-9細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。本研究選擇PC-9細(xì)胞株作為受試細(xì)胞，是因?yàn)樗哂信囵B(yǎng)簡單，細(xì)胞容易貼壁和高轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)[23]。

本研究中應(yīng)用了由Promega公司研發(fā)的雙熒光素酶報(bào)告載體(psiCHECK-2TM)，它同時(shí)攜帶了以上兩種報(bào)告基因，這樣能夠在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測兩種熒光素酶活性，而不必分開進(jìn)行檢測，從而進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)操作的效率，節(jié)省了時(shí)間，而且也能在很大限度上減少樣本污染的機(jī)率，同時(shí)也在最大程度上減少了不同批次內(nèi)和批次間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異，為科研工作帶來了很大便利。此外，兩個(gè)熒光素酶基因都有獨(dú)立的啟動子和終止位點(diǎn)，二者單獨(dú)表達(dá)且互不干擾[24]。將研究的目的基因克隆到位于海腎熒光素酶下游的多克隆位點(diǎn)，通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后檢測報(bào)告基因的表達(dá)，可以定量檢測miRNA對目的基因的調(diào)控作用[25]，還可以結(jié)合定點(diǎn)突變等方法確定miRNA和靶基因3'UTR的作用位點(diǎn)[26]。本研究中應(yīng)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)快速檢測報(bào)告蛋白表達(dá)活性，從而可以在最短的時(shí)間內(nèi)確認(rèn)質(zhì)粒的構(gòu)建是否成功以及在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。

本研究也存在不足之處。因?yàn)闀r(shí)間的限制，本研究只選擇了PC-9細(xì)胞株作為受試細(xì)胞。將來我們考慮增加另一種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株進(jìn)行驗(yàn)證使結(jié)論更有說服力。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了嵌合內(nèi)含子能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9的EMT轉(zhuǎn)化能力。該結(jié)論為臨床對非小細(xì)胞肺癌診斷、治療提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。

鳴謝

感謝貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)系王琴容副教授對本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。