陳斌偉 劉圣曜 黃帥 王斌 陳元鴻

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州510260）

大段骨缺損和骨不連是骨科的棘手難題，不僅給患者帶來身體及心理傷害，也給其家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展及技術(shù)的不斷提高，牽張成骨成為臨床治療大段骨缺損和骨不連的常用方法［1-2］。然而，治療周期長及新骨生物力學(xué)性能差等缺點(diǎn)限制了牽張成骨在臨床廣泛應(yīng)用［3］。如何加快新骨礦化速度、提高新骨生物力學(xué)強(qiáng)度及縮短治療周期是一個(gè)亟需解決的臨床難題。臨床上使用骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等促進(jìn)成骨，但存在價(jià)格昂貴、半衰期短等缺點(diǎn)［4］。因此，探討促進(jìn)牽張成骨的藥物具有重要的臨床及社會意義。

辛伐他?。╯imvastatin，SIM）是一種常見的他汀類藥物，臨床上主要用于治療心腦血管疾病。近年來，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀除降低血脂等作用外，尚可通過影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化影響發(fā)揮促成骨作用［5-6］，且與Wnt/β-catenin、BMP/Smads 等信號通路密切相關(guān)［7-8］。雖然辛伐他汀及適當(dāng)機(jī)械刺激均能促進(jìn)成骨，但兩者聯(lián)合應(yīng)用是否能起到協(xié)同作用尚無報(bào)道，其相關(guān)機(jī)制研究更少。為此，本研究從體外探討辛伐他汀對機(jī)械牽拉環(huán)境下BMSCs 成骨分化的影響及Wnt/β-catenin信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料普通級80～100 g 雄性SD 大鼠（Sprague Dawley Rats）由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證號：NFYY-2016-129），用于BMSCs分離培養(yǎng)等。低糖DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國），胎牛血清（Gibco，美國），胰蛋白酶（Amresco，美國），CCK-8（日本同仁公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs 培養(yǎng)大鼠頸椎脫臼處死后放入75%酒精浸泡5 min，生物安全柜內(nèi)無菌條件分離出大鼠股骨和脛骨，將附著于骨上的肌肉盡可能剝離干凈后將骨依次浸泡于75%酒精和PBS（phosphate buffer saline）中各5 min，隨后將骨兩端干骺端剪斷暴露骨髓腔，10 mL 注射器吸取低糖DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's medium）培養(yǎng)液沖洗骨髓腔數(shù)次，沖出的骨髓裝于15 mL 離心管。將離心管以1 000 r/min 離心5 min，去掉上層培養(yǎng)基后加4 mL 含F(xiàn)BS（Fetal Bovine Serum）的低糖DMEM 培養(yǎng)基將底層沉淀物制成混懸液，將混懸液加入25 cm2的培養(yǎng)瓶中，第2 天細(xì)胞換液，以后每2～3 天換液1 次，細(xì)胞長至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，第3 代細(xì)胞使用成脂肪誘導(dǎo)液及成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14 d 及21 d 后行油紅O 及茜素紅染色，第3 ～4 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 大鼠BMSCs 表面抗原分子的檢測第3 代BMSCs 長至80%～90%時(shí)將0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，將消化獲得的細(xì)胞放至15 mL 離心管以1 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞沉淀用PBS 重懸洗滌后，1 000 r/min 再次離心5 min，制成濃度為1 × 106/mL 單細(xì)胞懸液。1 × 105（100 μL）與5 μL熒光標(biāo)記的單克隆抗體混合（抗大鼠CD45-PE、CD11b-FITC、CD79-FITC 和CD90-PE），并在暗室中孵育15 min。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次后立即使用Coulter Elite-ESP 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對照組（CON）、辛伐他汀組（SIM）、機(jī)械牽拉組（STR）及SIM+STR 組。STR 組：第3 代BMSCs 細(xì) 胞以2.0 × 105/孔 接 種 于BioFlex 培養(yǎng)板中，將BioFlex 培養(yǎng)板置于FX-5000T細(xì)胞應(yīng)力裝置進(jìn)行牽拉，以10%機(jī)械牽拉以1 Hz 進(jìn)行牽拉，每天牽拉6 h 連續(xù)牽拉7 d。對照組不予機(jī)械牽拉，STR+SIM 在機(jī)械牽拉的同時(shí)加10-7mol/L辛伐他汀，實(shí)驗(yàn)中每2～3 天換液1 次。此外，添加20 nmol/L 的DKK1 觀察Wnt/β-catenin 通路在聯(lián)合應(yīng)用中的作用。PCR、堿性磷酸酶（ALP）染色、Western blot 等方法檢測各組成骨分化的變化。

1.2.4 ALP 活性檢測各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后按5×104/孔接種于12 孔板，成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d。吸去各孔中的培養(yǎng)液后用PBS 輕洗細(xì)胞3 次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min 后再次用PBS 洗2 次。每孔加入配好的ALP 染色液1.5 mL 常溫避光染色30 min；去掉染液后用PBS 沖洗2 次，在室溫下晾干后顯微鏡下觀察并拍照。ALP 活性檢：PBS 洗滌細(xì)胞2 次利后加入10 mmol/L 的Tris-HCL裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞于4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)上以10 000 g 的速度離心10 min，收集上清液行ALP 活性檢測。用0.1 mol/L 的NaOH 溶液中斷后在波長405 nm 處測其OD值，并于波長570 nm 處用BCA試劑盒測總體蛋白含量，ALP 活性用總蛋白進(jìn)行對照。

1.2.5 基因的定量分析方法（RT-PCR）各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后檢測成骨及β-catenin 相關(guān)基因，具體方法如下：提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈，于20 μL 反應(yīng)體系中加入引物、cDNA 模板和SYBR Green Master Mix。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；然后進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；循環(huán)結(jié)束后72 ℃再延伸5 min。各基因引物序列如下：GAPDH：5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'（正義鏈），5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'（反義鏈）；RUNX2：5'-GGCCACTTACCACAGAGCTA-3'（正義鏈），5'-GAGGCGGTCAGAGAACAAAC-3'（反義鏈）；Collagen I（Col 1a）：5'-CATGTTCAGCTTTGTGGACC-3'（正義鏈），5'-TTAGGGACCCTTAGGCCATT-3'（反義鏈）；ALP：5'-AACAACCTGACTGACCCTTC-3'（正義鏈），5'-TCCACTAGCAAGAAGAAGCC-3'（反義鏈）；β-catenin：5'-TTGTACGAGCACATCAGGAC-3'（正義鏈），5'-GCACCCTTCAACTATCTCCTC-3'（反義鏈）；Osteocalcin（OCN）：5'-GACTGCATTCTGCCTCTCTG-3'（正義鏈），5'-ATTCACCACCTTACTGCCCT-3'（反義鏈）；LPR5：5'-CCTGGCGCTGTGACGGCTTCC-3'（正義鏈），5'-CAATGGCGCTGCTGTGGGCTGGTA-3'（反義鏈）。

1.2.6 Western blot 檢測各組干預(yù)結(jié)束后，去掉牽拉板中上清液，PBS 清洗2 次，加RAPI 裂解液后收集細(xì)胞加入15 mL 離心管中以2 000 r/min 離心20 min，收集上清按Bradford 法測定各組蛋白濃度。取25 μg 蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后用TBST洗3 次，再加入一抗anti-β-catenin 和anti-GAPDH單克隆抗體，將其置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日以TBST 洗3 次后加入HRP 標(biāo)記的IgG 二抗室溫孵育30 min，用TBST 洗滌3 次后加入超敏發(fā)光底物，曝光顯影并用Image J 分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有的統(tǒng)計(jì)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析用于比較不同組別間的差異，兩組之間的差異用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs 性能及表面抗原分子的鑒定顯示第3 代細(xì)胞以長梭形為主（圖1A），BMSCs 經(jīng)機(jī)械牽拉（圖1B）BMSCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21 d 后茜素紅染色顯示大量鈣結(jié)節(jié)形成（圖1C），BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14 d后油紅O染色示脂滴形成（圖1D），這些結(jié)果表明分離的細(xì)胞具有成骨及成脂分化能力，具有干細(xì)胞特性。流式細(xì)胞儀行細(xì)胞表面抗原分子鑒定結(jié)果示：CD79 和CD90 呈陽性表達(dá)，表達(dá)量分別為（96.9±1.2）%和（97.4±1.5）%，而CD11b和CD45呈陰性表達(dá)，表達(dá)量分別為（9.4 ± 0.8）%和（5.9±0.5）%（圖2），這些表面抗原表達(dá)符合BMSCs免疫表型。通過經(jīng)典干細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)出大鼠BMSCs，為后面實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。

2.2 機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化ALP 活性結(jié)果顯示：與CON 組相比，SIM 組、STR 組以及STR+SIM 組均能不同程度促進(jìn)大鼠BMSCs 的成骨分化，且STR + SIM 組對大鼠BMSCs的成骨分化作用最明顯（P＜0.05，圖3A）。

進(jìn)一步檢測各組成骨基因表達(dá)，COL 1a 是骨形成的關(guān)鍵因子，主要由成骨細(xì)胞分泌。ALP 是成骨早期的標(biāo)志物，其含量高低與成骨細(xì)胞分化密切相關(guān)。OCN 是成骨晚期基質(zhì)礦化相關(guān)因子。RUNX2 是成骨分化過程的轉(zhuǎn)錄因子，直接反映成骨分化的程度。PCR 結(jié)果顯示SIM 組、STR 組以及STR+SIM 組成骨基因相對表達(dá)量較CON 組均上升，其中STR+SIM 組上升最明顯（P＜0.05），表明辛伐他汀、機(jī)械牽拉以及辛伐他汀聯(lián)合機(jī)械牽拉均能不同程度促進(jìn)大鼠BMSCs 的成骨分化，對BMSCs 早期和晚期成骨分化均有促進(jìn)作用，且辛伐他汀聯(lián)合機(jī)械牽拉對大鼠BMSCs 成骨分化作用最明顯（P＜0.05，圖3B）。

2.3 機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀增加Wnt/β-catenin信號通路β-catenin 等基因表達(dá)PCR 及WB 結(jié)果顯示：與CON 組相比，SIM 組、STR 組以及STR+SIM組β-catenin 基因及蛋白表達(dá)含量均升高，且STR+SIM 組升高最明顯（P＜0.05，圖4），表明各組均能激活β-catenin 通路。

圖1 BMSCs 體外培養(yǎng)不同階段觀察結(jié)果Fig.1 Observation of BMSCscultured in vitro at different stage

圖2 第3 代BMSCs 表面抗原表達(dá)流式結(jié)果Fig.2 The immunophenotypic characterization of the third generation BMSCsanalyzed by Flow Cytometry

圖3 各組ALP 活性及成骨相關(guān)基因表達(dá)Fig.3 The ALP activity and the expression of osteogenesisrelated genes

2.4 抑制Wnt/β-catenin 通路降低機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀促BMSCs 成骨分化效果為進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt/β-catenin 信號通路在STR+SIM 組促BMSCs 成骨分化中的作用，使用Wnt/β-catenin 特異性阻滯劑DKK1 進(jìn)行處理，結(jié)果顯示使用DKK1 后STR+SIM 組ALP 活性下降（P＜0.05，圖4D），表明STR+SIM 通過Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)BMSCs 成骨分化。

3 討論

辛伐他汀已被證明具有促成骨分化能力，但其在牽張成骨中的作用及具體機(jī)制尚不清楚。本研究從體外探討辛伐他汀對機(jī)械刺激環(huán)境下BMSCs 增殖及成骨分化的影響及其機(jī)制，結(jié)果顯示適量的機(jī)械牽拉及辛伐他汀均能促進(jìn)BMSCs 成骨分化，辛伐他汀能增加機(jī)械牽拉促BMSCs 成骨分化效果，且這一過程與激活Wnt/β-catenin 信號通路密切相關(guān)。

圖4 各組β-catenin 通路基因蛋白表達(dá)及ALP 活性Fig.4 The expression of β-catenin and the level of ALP activity in each group

大量的研究［9］探討機(jī)械牽拉對BMSCs增殖及成骨分化的影響，但研究結(jié)果尚不完全一致。CHEN等［10］設(shè)置機(jī)械牽拉裝置為1 Hz，以2.5%、5%及10%機(jī)械牽拉作用于人BMSCs，探討不同大小的機(jī)械牽拉刺激對人BMSCs 氧化及成骨分化的影響，結(jié)果表明機(jī)械牽拉對人BMSCs 具有抗氧化應(yīng)激及促成骨分化作用；TAN 等［11］研究發(fā)現(xiàn)過度的機(jī)械刺激可通過誘發(fā)BMSCs 氧化應(yīng)激減弱BMSCs 成骨分化。機(jī)械牽拉對BMSCs 增殖及成骨分化的影響主要受牽拉裝置類型、牽拉應(yīng)變率、牽拉頻率及作用時(shí)間等因素影響［12］。且機(jī)械牽拉對BMSCs 的影響與刺激力的大小密切相關(guān)，過小或過大的機(jī)械刺激對BMSCs 無明顯作用甚至有害，只有適量的機(jī)械刺激可引起B(yǎng)MSCs 增殖及成骨分化［13］。本研究選擇頻率為1 Hz 的10%牽拉力作用于大鼠BMSCs 7 d，結(jié)果表明其能促進(jìn)BMSCs 成骨分化，這一結(jié)果與既往文獻(xiàn)及以往研究結(jié)果一致［14］，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

MUNDY 等［15］首次發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能提高細(xì)胞成骨基因表達(dá)。隨后大量體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有促成骨分化能力。FENG 等［8］發(fā)現(xiàn)適量濃度的辛伐他汀可通過BMP-2/Smads 信號通路促進(jìn)BMSCs 成骨分化發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。LIN等［16］發(fā)現(xiàn)辛伐他汀在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用。楊建輝等［17］探討不同濃度辛伐他汀對成骨細(xì)胞成骨分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對成骨細(xì)胞增殖與濃度相關(guān)，辛伐他汀大于10-8mol/L可以增加成骨ALP 的表達(dá)含量，過低則無明顯促成骨作用，表明辛伐他汀對成骨細(xì)胞增殖存在明顯的量效關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)10-7mol/L 辛伐他汀能夠促進(jìn)BMSCs 成骨分化，與以往文獻(xiàn)結(jié)果一致。

辛伐他?。ㄉ镆蜃樱┘皺C(jī)械牽拉（物理因子）均能促進(jìn)BMSCs 增殖和成骨分化，但聯(lián)合應(yīng)用辛伐他汀及機(jī)械牽拉對BMSCs 成骨分化的影響尚不清楚。本研究聯(lián)合應(yīng)用10-7mol/L 辛伐他汀及10%機(jī)械牽拉作用于BMSCs，檢測其對BMSCs 成骨分化的影響，結(jié)果表明辛伐他汀能夠增加10%機(jī)械牽拉促BMSCs 成骨分化效能，ALP 及OCN 反應(yīng)了BMSCs 成骨分化的早期和晚期階段，結(jié)果顯示機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀對BMSCs 早期及晚期成骨分化均有促進(jìn)作用。這些結(jié)果表明辛伐他汀可協(xié)同機(jī)械牽拉促進(jìn)BMSCs 成骨分化，為辛伐他汀促牽拉成骨提供理論基礎(chǔ)。

Wnt/β-catenin 信號通路是Wnt 通路中的“經(jīng)典途徑”，與骨代謝密切相關(guān)［18-19］。Wnt 蛋白將信號導(dǎo)入后與frizzled 受體結(jié)合，Wnt 信號通路激活時(shí)，GSK-3β被募集并磷酸化LRP6，而不能磷酸化βcatenin 從而避免被其降解［20］。以往研究表明辛伐他汀及機(jī)械牽拉均可通過Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)BMSCs 增殖及成骨分化。本研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀、機(jī)械牽拉及機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀均能增加BMSCs 中β-catenin 基因及蛋白表達(dá)含量，且機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀組β-catenin 表達(dá)升高最明顯。為進(jìn)一步驗(yàn)證機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀是否通過Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)BMSCs 成骨分化，采用Wnt/β-catenin 通路阻滯劑DKK1 預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DKK1 能夠抑制機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀促BMSCs 成骨分化效能。這些結(jié)果表明機(jī)械牽拉聯(lián)合辛伐他汀通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進(jìn)BMSCs 成骨分化。

綜上所述，適當(dāng)大小機(jī)械牽拉及辛伐他汀均能促進(jìn)BMSCs 成骨分化，辛伐他汀能提高機(jī)械牽拉促BMSCs 成骨分化能力，且與激活Wnt/β-catenin 信號通路密切相關(guān)。該研究為辛伐他汀用于促牽張成骨提供理論基礎(chǔ)，今后將進(jìn)一步建立牽拉成骨模型探討辛伐他汀對牽張成骨的影響并深入探討Wnt/β-catenin 信號通路在其中的作用。