孫小涵，孫洪浩，陳秀秀，呂福軍

（遼寧波爾萊特農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110127）

近年來(lái)，由于在食品和飼料中使用化學(xué)添加劑的情況越來(lái)越多，給消費(fèi)者帶來(lái)的危害越來(lái)越大，因此人們對(duì)不含化學(xué)防腐劑的天然新鮮食品需求越來(lái)越高。乳酸菌具有良好的安全性和抗菌活性，在食品和飼料中得到了廣泛的應(yīng)用，是公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物。在乳酸菌中，最大的類(lèi)群是乳桿菌屬，它有150多個(gè)不同的物種[1]，其中包括一些對(duì)宿主健康有益的乳桿菌屬[2]。例如，植物乳桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，其分布廣泛，包括乳制品和發(fā)酵食品，牛糞、青貯飼料和污水等環(huán)境，以及人和動(dòng)物口腔、腸道和糞便等。

在以往研究中乳桿菌的抗菌物質(zhì)主要是有機(jī)酸[3]、脂肪酸[4]、短肽[5-6]等物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，乳酸菌能產(chǎn)生6種有機(jī)酸，可抑制霉菌的生長(zhǎng)，包括乳酸、乙酸和丙酸等[7]。后來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸也具有抗菌特性，如植物乳桿菌MILAB14中的3-羥基脂肪酸[8]。副酸桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)丙酸桿菌有明顯的抑制作用[9]。

乳酸菌的抗菌機(jī)制很復(fù)雜。一些研究人員指出，發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的有機(jī)酸可以通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)的pH，從而影響致病菌的生長(zhǎng)和代謝[10]。此外，有研究人員還認(rèn)為有機(jī)酸可以與某些成分結(jié)合，如細(xì)胞膜上的脂多糖，從而破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，達(dá)到抑菌作用[11]。Strom等[12]還發(fā)現(xiàn)苯乳酸能抑制絲狀真菌的蛋白表達(dá)。Bergsson等[13]證實(shí)脂肪酸能穿透致病細(xì)胞并與其質(zhì)膜結(jié)合，進(jìn)而改變膜的通透性，達(dá)到抑菌作用。Khalaf等[14]發(fā)現(xiàn)從乳酸菌中分離出的細(xì)菌素也能夠通過(guò)破壞病原體外膜的完整性而起抗菌作用。

植物乳桿菌具有重要的抗菌活性和益生菌特性，已被用于開(kāi)發(fā)功能性食品并大規(guī)模生產(chǎn)，但存在抑菌效率低、抑菌譜窄、抑菌活性不穩(wěn)定等問(wèn)題，因此篩選優(yōu)良的菌株，包括菌株的抗菌物質(zhì)特性，都是值得我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。本研究擬從豬腸道中篩選出對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用的菌株，并對(duì)其抑菌物質(zhì)展開(kāi)初步分析，以進(jìn)一步提供優(yōu)良的菌種資源，為抑菌物質(zhì)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年12月至2020年7月在遼寧波爾萊特農(nóng)牧實(shí)業(yè)有限公司肽制劑研發(fā)中心進(jìn)行。

1.2 材料

金黃色葡萄球菌（SA）、大腸埃希氏菌（K88）由本實(shí)驗(yàn)室保存；植物乳桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離得到并保存；MRS肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。過(guò)氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵上清液的制備 首先將保藏的菌種復(fù)蘇、傳代，后按2%的接種量接入50 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，細(xì)菌培養(yǎng)液10 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm濾器過(guò)濾，備用。

1.3.2 指示菌菌懸液的制備 把大腸桿菌和金黃色葡萄球菌按2%接種量接入LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)16～18 h。

1.3.3 植物乳桿菌抑菌能力的篩選 采用牛津杯平板法測(cè)定發(fā)酵上清液抑菌活性。首先，加入已經(jīng)高壓滅菌的LB瓊脂培養(yǎng)基于平板中，靜止放置待培養(yǎng)基凝固后，將指示菌菌懸液（108cfu/mL）均勻地涂在LB瓊脂培養(yǎng)基上，將牛津杯置于平板上，每個(gè)牛津杯中加入200 μL已制備好的發(fā)酵上清液，于4 ℃冰箱中擴(kuò)散4 h，37 ℃培養(yǎng)16～18h后，測(cè)量抑菌圈直徑大小，以未接種的MRS肉湯培養(yǎng)基上清液作為空白對(duì)照，做3次重復(fù)。測(cè)量抑菌圈直徑，評(píng)估抗菌活性。

1.3.4 不同發(fā)酵時(shí)間上清液的抑菌活性研究 植物乳桿菌LP-01按照2%的接種量轉(zhuǎn)接100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)48 h，分別在0、4、8、12、16、20、24、32、40、48 h取發(fā)酵液，測(cè)定其OD600值；用牛津杯法測(cè)定發(fā)酵上清液在每個(gè)時(shí)間段對(duì)指示菌的抑菌活性。

1.3.5 過(guò)氧化氫抑菌作用的消除 在發(fā)酵上清液中加入1.5 mg/mL的過(guò)氧化氫酶，對(duì)照組不用過(guò)氧化氫酶處理，在37 ℃水浴作用2 h，排除發(fā)酵液中過(guò)氧化氫的作用，用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，牛津杯平板法進(jìn)行抑菌能力測(cè)定。

1.3.6 pH對(duì)抑菌物質(zhì)的影響 在發(fā)酵上清液中起到抑菌作用的可能是細(xì)菌素，或是有機(jī)酸等物質(zhì)。為排除酸性物質(zhì)的干擾，用2 mol/L的氫氧化鈉將發(fā)酵上清液調(diào)至pH 7.0，用牛津杯平板法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，未被堿中和的發(fā)酵上清液做對(duì)照，比較處理前后抑菌圈的變化。

1.3.7 溫度對(duì)發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 將發(fā)酵上清液分別于65、85和100 ℃水浴20 min，對(duì)照組為無(wú)高溫處理的發(fā)酵上清液原液，用牛津杯平板法比較處理前后抑菌能力的變化。具體方法參照1.3.3。

1.3.8 蛋白酶對(duì)發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 將發(fā)酵上清液分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K在各自最適宜的溫度和pH下作用2 h，酶濃度為2.5 mg/mL，再將發(fā)酵上清液pH調(diào)回至初始值，空白對(duì)照組不加酶并用相同條件處理發(fā)酵上清液，用指示菌進(jìn)行抑菌能力的測(cè)定。牛津杯法比較處理前后抑菌能力的變化。

2 結(jié)果

2.1 不同植物乳桿菌的抗菌活性比較

用牛津杯方法測(cè)定5種植物乳桿菌的抗菌能力，結(jié)果表明，5種植物乳桿菌對(duì)指示菌均具有良好的抗菌活性。如表1所示，根據(jù)各菌株對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，LP-01具有最高的抗菌活性，抑菌圈直徑分別為18.08 mm和18.93 mm。因此，選擇此菌進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 指示菌抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果 mm

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間抑菌活性比較

由圖1可知，植物乳桿菌LP-01從2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16～20 h后開(kāi)始趨于平穩(wěn)生長(zhǎng)。發(fā)酵上清液在初始階段（0～4 h）沒(méi)有明顯的抑菌活性，從8 h開(kāi)始明顯改善，抑菌活性隨著時(shí)間增加逐漸增強(qiáng)。到20 h抑菌活性趨于穩(wěn)定，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌指示菌抑菌圈直徑分別達(dá)到18.73 mm和19.32 mm。同時(shí)，從圖1可直觀地看出表明發(fā)酵上清液的抗菌作用與細(xì)菌的生長(zhǎng)情況呈正相關(guān)。

2.3 溫度、pH、酶對(duì)植物乳桿菌LP-01抑菌活性的影響

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌株，測(cè)定了pH、溫度和酶對(duì)LP-01發(fā)酵上清液抑菌活性的影響，其抑菌效果如表2所示。結(jié)果表明，在100 ℃處理20 min后，發(fā)酵上清液抑菌活性無(wú)顯著變化，說(shuō)明抑菌物質(zhì)具有很好的耐熱性；當(dāng)發(fā)酵液pH為7.0時(shí)，抑菌活性徹底喪失，表明抑菌物質(zhì)只有在酸性條件下才有良好的抑菌作用；同時(shí)，用過(guò)氧化氫酶、胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K處理的發(fā)酵上清液與對(duì)照組相比沒(méi)有出現(xiàn)明顯差異（P＞0.05），對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性影響不大，表明LP-01發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生過(guò)氧化氫，且發(fā)酵上清液中的蛋白質(zhì)沒(méi)有抑菌作用，說(shuō)明抑菌物質(zhì)對(duì)消化液蛋白酶不敏感。

表2 不同條件處理下LP-01的抑菌圈直徑 mm

3 討論

在本研究中，筆者比較了幾種植物乳桿菌的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LP-01具有優(yōu)良的抗菌活性，可有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。筆者對(duì)LP-01發(fā)酵上清液的抗菌物質(zhì)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該抗菌物質(zhì)在酸性條件下具有良好的熱穩(wěn)定性和抗菌活性，在堿性條件下失去抗菌活性，表明發(fā)酵上清液中含有具有熱穩(wěn)定的有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)。此外，經(jīng)過(guò)蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抗菌活性無(wú)明顯變化，表明蛋白質(zhì)在LP-01發(fā)酵上清液中的抗菌作用有限。

乳酸菌的抑菌作用涉及各種代謝物。例如，乳酸菌產(chǎn)生的乙酸和丁酸對(duì)霉菌有抑制作用[15-16]；Guo等[17]從植物乳桿菌IMAU10014中提取的苯乳酸具有抑菌作用；有研究者從植物乳桿菌中分離出了其他抗菌物質(zhì)如3-羥基癸酸和癸酸，對(duì)真菌具有良好的抗菌活性。此外，Atanasova等[18-19]還發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和其他物質(zhì)也顯示出了抗菌活性。為此，許多研究者對(duì)代謝物中的抗菌機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究。共同的研究機(jī)制是有機(jī)酸可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性或降低細(xì)胞內(nèi)的pH，從而影響致病菌的代謝，起到抑制作用。而細(xì)菌素是通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性，引起細(xì)胞內(nèi)各離子的滲漏和能量的消耗，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

綜上所述，乳酸菌的抑菌作用與其代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，不同乳酸菌的代謝產(chǎn)物不同。筆者通過(guò)試驗(yàn)探究乳酸菌的抑菌物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)LP-01上清液的主要抗菌物質(zhì)為含有熱穩(wěn)定的有機(jī)酸，有機(jī)酸通過(guò)破壞了細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌不能正常生長(zhǎng)和繁殖，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，發(fā)揮其抑菌作用。其抑菌物質(zhì)及機(jī)制還需要進(jìn)一步地研究加以佐證。