劉林清，李慶崗，蘇世廣，周 梅，張 威，王重龍

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，豬分子數(shù)量遺傳學(xué)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

ALAS1基因，一個吡哆醛5'磷酸（PLP）限速酶，它屬于α-氧基胺合成酶家族。ALAS1基因參與血紅素生物合成的第一步反應(yīng)，并且對血紅素的合成起到限速酶的作用，以維持細(xì)胞內(nèi)血紅素的水平[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在ALAS1基因的5'側(cè)翼序列存在兩個cAMP應(yīng)答元件（CRE）識別序列，cAMP調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在卵巢卵泡發(fā)育和黃體化過程中起到主要作用，并可誘導(dǎo)ALAS1基因的表達(dá)[2]。還有研究者們發(fā)現(xiàn)，ALAS1基因還在卵巢中參與調(diào)節(jié)與排卵過程有關(guān)的線粒體細(xì)胞色素P450和類固醇代謝及類固醇激素的產(chǎn)生[3-6]。此外，Lawrence等[7]在小鼠卵巢中注射HCG（人絨毛膜促性腺激素）0～39 h后發(fā)現(xiàn)，ALAS1基因在早期排卵過程中在卵泡組織中上調(diào)表達(dá)，并且可能參與卵泡黃體化過程。這些研究結(jié)果進(jìn)一步暗示了ALAS1基因在卵巢卵泡發(fā)育及排卵過程后都發(fā)揮著作用。

為此，本研究建立了ALAS1基因的PCR-MspIRFLP分型技術(shù)，并在3個中外豬種中進(jìn)行多態(tài)性分型，還在兩個豬群中檢測該位點(diǎn)的多態(tài)性并與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為提高豬產(chǎn)仔數(shù)提供一個有用的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物及組織采集 試驗(yàn)地點(diǎn)在安徽省科鑫養(yǎng)豬育種有限公司；試驗(yàn)動物：于2014年7月采集58頭淮豬、75頭長白豬及85頭淮豬新品系Ⅱ系豬的耳組織放置于75%酒精的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫伙曫B(yǎng)管理?xiàng)l件和飼糧營養(yǎng)水平一致。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法，TE溶解，-20 ℃冷凍保存。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)ALAS1基因DNA序列，應(yīng)用Premier 5.0軟件在多態(tài)位點(diǎn)（第9內(nèi)含子）兩側(cè)，設(shè)計(jì)1對引物，突變位點(diǎn)可用限制性內(nèi)切酶MspI識別，引物由上海生工生物公司合成。引物信息如下：ALAS1基因的上游引物：5'-CACACCCCGCAGATGATGAC-3'，下游引物：5'-AAATAGAAGTGCAGAGCCCAGC-3'，片段長度為359 bp，退火溫度為62.5 ℃。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中PCR×2Taqmix 12.5 μL，10 mmol/μL的引物各0.5 μL，DNA模板1 μL（DNA約100 ng），加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為第1步95 ℃變性5 min；第2步95 ℃變性45 s；第3步62.5 ℃復(fù)性40 s；第4步72 ℃延伸45 s；重復(fù)第2至第4步35個循環(huán)，之后再72 ℃延伸10 min，最后降溫至4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察，可見到片段大小為359 bp的清晰條帶。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切（RFLP）ALAS1基因的PCR產(chǎn)物用MspI內(nèi)切酶酶切，反應(yīng)體系為：10×Buffer 1 μL，MspI酶0.20 μL（20 U/μL），加PCR產(chǎn)物至10 μL；37 ℃反應(yīng)8～12 h；然后，酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

1.3.1 統(tǒng)計(jì)分析的軟件 采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件（SAS Institute Inc, Version 8 Edition）的GLM程序進(jìn)行標(biāo)記方差分析，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.3.2 基因效應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析模型 依據(jù)Liu等[8]所述方法建立的單標(biāo)記回歸統(tǒng)計(jì)模型，除了豬個體為隨機(jī)效應(yīng)以外，其他因素均為固定效應(yīng)。所采用模型如下：Y=平均值+基因型+胎次效應(yīng)+殘差，其中Y為性狀表型值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬ALAS1基因的多態(tài)位點(diǎn)檢測

PCR擴(kuò)增片段長度為359 bp，經(jīng)檢測與預(yù)期結(jié)果一致（圖1），片段本身就存在一個MspI酶切位點(diǎn)，經(jīng)MspI酶切后產(chǎn)生3種基因型（圖2）。當(dāng)多態(tài)位點(diǎn)為CC基因型時，則造成了2個MspI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)MspI消化后產(chǎn)生3個片段（277 bp+35 bp+47 bp），記為等位基因C；當(dāng)多態(tài)位點(diǎn)為TT基因型時，則一個酶切位點(diǎn)消失，PCR產(chǎn)物經(jīng)MspI消化后產(chǎn)生1個片段（324 bp+35 bp），記作等位基因T。

2.2 豬ALAS1基因在不同豬群體中的基因型和等位基因的頻率分布

由表1可見，ALAS1基因MspI酶切位點(diǎn)在所檢測的3個豬群中，國內(nèi)地方品種淮豬豬群中C等位基因占優(yōu)勢，而從國外引進(jìn)的長白豬和自主培育的淮豬新品系Ⅱ豬群中T等位基因頻率較高。

表1 ALAS1基因PCR-MspI-RFLP基因型頻率和等位基因頻率分布

2.3 豬ALAS1基因MspI多態(tài)位點(diǎn)基因型與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用基因效應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析模型，采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的GLM程序分別在長白豬和淮豬新品系Ⅱ豬群體中進(jìn)行豬ALAS1基因PCR-MspI-RFLP多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析。

在長白豬和淮豬新品系Ⅱ豬群體中，所有胎次產(chǎn)仔數(shù)均呈現(xiàn)CC＞TC＞TT的趨勢，其中CC型個體和TC型個體的所有胎次產(chǎn)仔數(shù)分別顯著高于TT型個體（P＜0.05），詳見表2。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CC型母豬具有較高的產(chǎn)仔數(shù)，C等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。

表2 ALAS1基因PCR-MspI-RFLP基因型與長白豬、淮豬新品系Ⅱ產(chǎn)仔數(shù)性狀的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

淮豬是我國地方豬種，具有生長速度慢、繁殖力高等特性。長白豬是引進(jìn)的外來豬種，其具有生長速度快、繁殖力不高等特性。而淮豬新品系Ⅱ是以安徽省優(yōu)良地方品種淮豬為母本，以國外優(yōu)質(zhì)瘦肉型品種長白豬、大白豬為父本，經(jīng)過雜交育種組建基礎(chǔ)群，然后運(yùn)用標(biāo)記輔助選擇BLUP估計(jì)育種值進(jìn)行群體繼代選育的。ALAS1基因，一個吡哆醛5'磷酸（PLP）限速酶，它屬于α-氧基胺合成酶家族。筆者前期采用RTPCR方法的分析豬ALAS1基因在用PMSG（孕馬血清促性腺激素）和HCG（人絨毛膜促性腺激素）處理卵巢顆粒細(xì)胞不同時間后的表達(dá)情況，結(jié)果表明，ALAS1基因在卵泡顆粒細(xì)胞生長、發(fā)育等過程中瞬時表達(dá)[9]，這與其他研究者的結(jié)果是一致的[7]。這些研究結(jié)果進(jìn)一步顯示了ALAS1基因在卵巢卵泡發(fā)育及排卵過程后都發(fā)揮著作用。所以，我們選擇ALAS1基因作為研究豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的候選基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，ALAS1基因MspI酶切位點(diǎn)在所檢測的3個豬群中，國內(nèi)地方品種淮豬豬群中C等位基因占優(yōu)勢，而從國外引進(jìn)的長白豬和自主培育的淮豬新品系Ⅱ豬群中T等位基因頻率較高。并且在長白豬和淮豬新品系Ⅱ豬群體中，所有胎次產(chǎn)仔數(shù)均呈現(xiàn)CC＞TC＞TT的趨勢。其中，CC型個體和TC型個體的所有胎次產(chǎn)仔數(shù)分別顯著高于TT型個體（P＜0.05），從以上結(jié)果表明，CC型母豬具有較高的產(chǎn)仔數(shù)，C等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。因此選擇CC型個體留種可提高群體的產(chǎn)仔數(shù)，在今后選育中可適當(dāng)提高等位基因C的頻率。