鐘光華 鄭守鏈 唐娉

膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的惡性腦腫瘤，患者預后極差。多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是膠質瘤中最惡性的病理類型[1-3]。患者在接受最大安全的手術切除、大劑量放射治療和標準化學治療后，總體中位總生存率仍然較短[4]。導致GBM 患者治療效果不理想的一個重要因素是，腫瘤內部細胞異質性以及膠質瘤腫瘤干細胞的存在，導致了腫瘤細胞內部存在耐受現(xiàn)有的免疫治療和分子靶向治療[5-7]。因此，發(fā)現(xiàn)新的生物標志物有助于腫瘤精準治療的發(fā)展。驅動蛋白家族成員15（Kinesin Family Member 15，KIF15）是一種蛋白質編碼基因，編碼的蛋白與21q22.11q22.12 微缺失綜合征和乳腺癌的發(fā)病有關[8-9]。目前，國內關于KIF15 在膠質瘤中的表達特征及臨床意義的研究報道罕見。本研究通過挖掘美國癌癥基因圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和中國腦膠質瘤基因圖譜計劃（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）膠質瘤患者的腫瘤樣本的全轉錄組數(shù)據(jù)，結合相關基因和蛋白表達數(shù)據(jù)庫，初步探討了KIF15 在膠質瘤中的表達特征及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)庫

人類基因蛋白表達庫數(shù)據(jù)（https://www.proteinatlas.org/）用于分析KIF15 在人體器官組織中的表達特征。TCGA 和CGGA 基因全轉錄組數(shù)據(jù)（mRNAseq） 用于分析KIF15 在各級別膠質瘤中的表達差異。

二、膠質瘤芯片及免疫組織化學染色

包含94 例膠質瘤樣本（含WHO 標準下Ⅱ～Ⅳ級，其中Ⅱ級24 例，Ⅲ級31 例，Ⅳ級39）的腫瘤組織芯片（武漢谷歌生物科技有限公司）用于KIF15的免疫組織化學染色。染色方法：組織芯片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇脫水后，用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，3%H2O2溶液去除內源性過氧化物酶活性。KIF15抗體（1∶400，ab251836，Abcam 公司，美國）用于一抗孵育（4℃冰箱中孵育16 h）。Polink-2 plus 聚合物HRP 檢測系統(tǒng) （北京中杉金橋生物技術有限公司）檢測抗體。KIF15 的染色強度評分采用Image-Pro Plus 軟件進行評估。評分標準為：未見染色為0 分，陽性細胞＜10%為1 分，陽性細胞在10%～70%為2分，陽性細胞＞70%為3 分。

三、轉錄組的生信分析

將TCGA 的轉錄組數(shù)據(jù)樣本根據(jù)KIF15 的mRNA 水平進行分組，KIF15 的mRNA 水平排序在四分位數(shù)P75 及以上的作為KIF15 高水平組，KIF15的mRNA 水平排序在四分位數(shù)P25 及以下的作為KIF15 低水平組，比較2 組間所有基因轉錄水平和中位生存期差異，按照差異倍數(shù)在2 或以上，且P＜0.05作為篩選條件，篩選出所有的差異基因（differential expressed genes，DEGs），并以熱圖的形式進行表示。所有DEGs 進行基因本體（gene ontology，GO）分析和信號通路富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，轉錄組mRNAseq 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，組間分析采用計量資料的t 檢驗，免疫組化染色強度評分轉化為秩次，比較采用等級資料的Mann-Whitney U 檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier 生存分析法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、KIF15 的正常人體組織及神經(jīng)系統(tǒng)中的表達特征

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大腦中，各部位組織可檢測到KIF15 的蛋白水平和轉錄水平均較低。在正常人各組織器官中，KIF15 的蛋白水平均在中等水平或以下，近半數(shù)組織器官中幾乎不能檢測到KIF15 的蛋白表達。其中，KIF15 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中為低表達。同時，KIF15 的轉錄水平（mRNA）除在胸腺、睪丸、骨密質中較高外，而在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內的絕大多數(shù)各組織器官中極為低下（圖1）。

二、膠質瘤患者腫瘤組織KIF15 轉錄水平的特征

TCGA 和CGGA 轉錄組數(shù)據(jù)分析顯示，膠質瘤WHO 級別越高，KIF15 的mRNA 水平顯著增高，WHO Ⅱ級和Ⅲ級分別與WHO Ⅳ級比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2A～B）。并且，在膠質母細胞瘤中KIF15 的mRNA 水平最高，相比較于星形膠質細胞、少突膠質細胞瘤、少突星形膠質細胞瘤、間變性星形膠質細胞瘤、間變性少突膠質細胞瘤，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2C～D）。在中位生存期上，KIF15 高水平組患者的中位生存期較KIF15 低水平組更短，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2E～F）。膠質瘤組織芯片染色結果顯示，WHO 級別越高，膠質瘤組織染色強度評分趨向更高，WHO Ⅳ級膠質瘤評分以2 分（20.51%）、3 分（74.36%）為主，而WHO Ⅱ級以0 分（29.17%）、1 分（50.00%）為主（圖2G～H）。

三、KIF15 轉錄水平與相關腫瘤增殖指標Ki67的相關性

在TCGA 轉 錄 組 數(shù) 據(jù) 中，KIF15 和Ki67 的mRNA 水平之間為顯著性正相關關系 （r=0.725，P＜0.001，圖3A）；在CGGA 轉錄組數(shù)據(jù)庫中，KIF15 和Ki67 的mRNA 水平之間也呈顯著性正相關關系（r=0.706，P＜0.001，圖3B）。

四、KIF15 參與調控的分子信號通路

共篩選到707 個DEGs，KIF15 高水平組相比較于KIF15 低水平組，表達水平升高的DEGs 有328個，表達水平降低的DEGs 有379 個（圖4A）。GO 分析顯示，這些DEGs 參與的生物學過程前10 位包含細胞周期轉換和細胞有絲分裂調控（圖4B）。分子信號通路富集，KEGG 分析顯示，DEGs 參與的分子信號通路包括細胞周期、P53 通路和DNA 復制（圖4C）。

討論

GBM 是腦腫瘤中最為常見且惡性程度最高的腫瘤。膠質瘤內部細胞的異質性以及存在一類“腫瘤干細胞”，可引起術后化學治療藥物的耐受及脫靶效應，以至于常規(guī)治療效果不盡如人意，患者中位生存期較短[1-3]。GBM 的致病基因突變極為復雜，對致病基因的識別是腫瘤精準治療的前提，目前越來越多的特異性腫瘤靶點被發(fā)現(xiàn)，為疾病的個性化治療提供了科學線索和依據(jù)。

圖1 KIF15 的正常人體組織及神經(jīng)系統(tǒng)中的表達特征

圖2 KIF15 在膠質瘤中的表達及臨床意義

圖3 KIF15 轉錄水平與相關腫瘤增殖指標Ki67 的相關性

圖4 KIF15 參與調控的分子信號通路

驅動蛋白家族（kinesin family members，KIFs）是包含40 多個蛋白成員的超家族，參與了細胞內蛋白質和細胞器的運輸、細胞有絲分裂等重要過程[10]。在KIFs 家族中，KIF15 是一種基于微管的、正端導向的運動蛋白，參與多種細胞過程，如紡錘體裝配、質膜運輸和細胞分裂[11-13]。據(jù)報道，KIF15 和KIF11 可促進雙極紡錘體的形成[14]。近年來研究報道，KIF15 也被證實參與多種腫瘤的生長，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌等[15-18]。但KIF15 在膠質瘤腫瘤中的表達及與預后的關系尚不清楚，國內KIF15 在膠質瘤中的相關報道少見。本研究基于目前全國兩大膠質瘤基因譜——TCGA 和CGGA，挖掘了KIF15 在膠質瘤中的表達特征及臨床意義，并初步探討了KIF15 在分子機制上的功能。首先，通過人類基因和蛋白表達數(shù)據(jù)庫探究了KIF15 在健康人神經(jīng)系統(tǒng)中的表達特征，結果顯示，KIF15 在人類絕大部分組織器官中是較低表達的，尤其是在腦組織中蛋白水平和轉錄水平的表達量均極低。然而，TCGA 和CGGA 膠質瘤患者樣本轉錄組數(shù)據(jù)提示，無論是在WHO 不同級別分組比較，抑或是根據(jù)腫瘤病理學分組比較，均顯示KIF15 在膠質母細胞瘤中異常高表達；并且，KIF15 高表達患者的中位生存期顯著縮短。由此可見，KIF15 異常高表達與膠質母細胞瘤的發(fā)生及臨床預后有較大的臨床聯(lián)系，KIF15 很可能是膠質母細胞瘤的一個特征性蛋白標記物。而且，KIF15 的轉錄水平與腫瘤惡性指標Ki67 存在顯著正相關，說明高水平表達KIF15 的膠質瘤細胞增殖能力也相應更強，腫瘤惡性程度更高，因此患者的中位生存期越差。最后，本研究對KIF15 高表達組和低表達組間篩選出的DEGs 進行GO 分析和信號通路KEGG 分析，結果顯示，DEGs 顯著富集在了細胞增殖相關的生物學過程以及分子信號通路中，如細胞周期、P53等經(jīng)典腫瘤信號通路。研究已經(jīng)證實，P53 是重要的抑癌基因，其在通過調控細胞周期檢查點上發(fā)揮重要的作用，通過對細胞周期的調控影響了腫瘤細胞的惡行增殖速度[19]。這就提示，KIF15 明顯參與調控了細胞分裂信號通路。由此，筆者初步得出了KIF15是膠質母細胞瘤的一個特征性標志物，具有重要的臨床研究價值。

綜上所述，KIF15 在膠質瘤中高表達，并且高水平KIF15 預示膠質瘤惡性程度高，患者生存期較差。KIF15 參與調控了腫瘤細胞周期通路，可能是一個潛在的膠質瘤基因治療靶點。對于該基因的后續(xù)研究，應結合其DEGs 的GO 分析和KEGG 分析結果，著重對P53 信號通路和細胞周期分析信號軸進行研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突