何仁穎，何 威，李航宇，張 斌,4△

1.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，重慶 400037；2.重慶市人民醫(yī)院皮膚科，重慶 400014；3.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，重慶 400038；4.重慶市中醫(yī)院/重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科，重慶 400011

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是一種來源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的常見惡性腫瘤，好發(fā)于顏面部，且隨著時(shí)間的推移容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的外貌及健康。隨著環(huán)境污染的加重，鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率逐年升高。近年來研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和在維持皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是重要的調(diào)節(jié)者和參與者[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在人皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中有TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的存在，且其中幾種TGF-β1受體的表達(dá)存在變化[2]。然而，TGF-β1的表達(dá)是否與人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖過程有關(guān)，相關(guān)報(bào)道甚少。為此，本研究通過觀察A431細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞在不同TGF-β1作用濃度和作用時(shí)間后，細(xì)胞的增殖情況和細(xì)胞中TGF-β受體mRNA表達(dá)的變化情況，來進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料來源 人角質(zhì)形成細(xì)胞 HaCaT 細(xì)胞和人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431 細(xì)胞均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2儀器與試劑 人重組 TGF-β1 (美國 PEPROTECH 公司)、胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司)、DMEM培養(yǎng)液(美國 Gibco公司)、胰蛋白酶和 Tripure Isolation Reagent(美國Roche公司)、SYBR?Premix Ex TaqTM和 PrimeScriptTMRT Reagent Kit(日本TaKaRa Bio公司)、DMSO(常州市科豐化工有限公司)、MTT試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。凝膠成像分析儀(美國Alpha Innotech公司)、熒光定量 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增儀和酶標(biāo)儀(Model 550 version 2.24，美國Bio-Rad公司)、DU800核酸/蛋白檢測(cè)儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HaCaT 細(xì)胞和A431細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板，在5% CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)24 h至貼壁。按以下分組要求向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加TGF-β1后換液培養(yǎng)：(1)濃度組，按TGF-β1終濃度0、5、10、20、100 ng/mL分為5組，持續(xù)作用48 h。(2)時(shí)間組，TGF-β1終濃度為20 ng/mL時(shí)，分別作用12、24、48、72 h。另設(shè)空白對(duì)照。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，結(jié)果重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3.2MTT法檢測(cè)TGF-β1對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將50 μL MTT溶液加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液。加入DMSO液150 μL，充分震蕩溶解后于490 nm處測(cè)定各孔吸光度值(A490 nm)，計(jì)算細(xì)胞活性率。

1.3.3RT-PCR測(cè)定TGF-β1對(duì)細(xì)胞中TGF-β受體mRNA表達(dá)的影響 分別將培養(yǎng)好的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，并對(duì)各自RNA樣本的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明中的具體操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明配制相應(yīng)的反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1相同作用時(shí)間下不同濃度的TGF-β1對(duì)細(xì)胞增殖的影響 在作用時(shí)間相同的情況下，不同濃度的TGF-β1對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖均能產(chǎn)生顯著的抑制作用，見圖1，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在不同濃度的TGF-β1對(duì)A431細(xì)胞的增殖無明顯抑制作用，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這提示TGF-β1對(duì)A431細(xì)胞產(chǎn)生的抑制作用不明顯。

圖1 不同濃度TGF-β1對(duì)HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞增殖的影響(MTT法)

2.2相同濃度的條件下TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響 在TGF-β1濃度均為20 ng/mL的情況下，分別作用不同時(shí)間，TGF-β1對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了明顯的抑制作用，見圖2，與對(duì)照組細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TGF-β1對(duì)A431細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抑制作用不明顯，與對(duì)照組細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖2 TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

圖3 TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響

2.3TGF-β1對(duì)HaCaT細(xì)胞TGF-β受體mRNA表達(dá)的影響 在相同的作用時(shí)間下(均為48 h)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著TGF-β1濃度的增加，HaCaT細(xì)胞的TGF-β受體Ⅰ mRNA(TGF-βRⅠ mRNA)、TGF-β受體Ⅱ mRNA(TGF-βRⅡ mRNA)的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，見表1。在TGF-β1濃度均為20 ng/mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞TGF-βRⅠ mRNA、TGF-βRⅡ mRNA的表達(dá)隨著TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，見表2。

表1 不同濃度TGF-β1對(duì)HaCaT細(xì)胞TGF-β受體mRNA表達(dá)的影響

表2 TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞TGF-β受體mRNA表達(dá)的影響

2.4TGF-β1對(duì)A431細(xì)胞TGF-β受體mRNA表達(dá)的影響 在作用相同48 h條件下，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著TGF-β1濃度的增加，A431細(xì)胞的TGF-βRⅠ mRNA、TGF-βRⅡ mRNA的表達(dá)逐漸下降，見表3。在TGF-β1濃度均為20 ng/mL的條件下，A431細(xì)胞中TGF-βRⅠ mRNA的表達(dá)在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，見表4。

表3 不同濃度TGF-β1對(duì)A431細(xì)胞TGF-β受體mRNA表達(dá)的影響

表4 TGF-β1不同作用時(shí)間對(duì)A431細(xì)胞TGF-β受體mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路十分復(fù)雜，主要由TGF-β受體介導(dǎo)。TGF-β受體分為Ⅰ型受體(TGF-βRⅠ)、Ⅱ型受體 (TGF-βRⅡ) 和Ⅲ型受體(TGF-βRⅢ)[3]。經(jīng)典的Smads信號(hào)通路主要是由TGF-β與TGF-βRⅡ的胞外段相結(jié)合后磷酸化激活TGF-βRⅠ，通過下游的Smad4蛋白完成TGF-β信號(hào)由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的過程[4]。TGF-βRⅢ因結(jié)構(gòu)上不含激酶活性區(qū)，故不直接參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要起調(diào)節(jié)的作用[5]。TGF-β/Smad信號(hào)途徑異常與多種上皮來源的惡性腫瘤密切相關(guān)，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌等腫瘤中均存在TGF-β的過度表達(dá)；在人的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)、食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)和皮膚鱗狀細(xì)胞癌中也存在TGF-β1過表達(dá)的情況[6]。TGF-β在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，不僅可以直接影響腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，還能刺激血管生長(zhǎng)，起到促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用[7]。TGF-β 對(duì)腫瘤的直接影響可以通過Smads依賴途徑或干擾Smads依賴途徑介導(dǎo)完成，除經(jīng)典的Smads信號(hào)通路外[8-9]，還有其他非經(jīng)典的不依賴于Smads蛋白信號(hào)通路的交互作用，如MAPK信號(hào)通路，它包括 ERK、JNK、p38、MAP 激酶等[10-11]。

對(duì)于大部分上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤而言，TGF-β1主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡來發(fā)揮作用[3]。但也有研究者觀察到，部分腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β的抑制作用不敏感，可以逃避TGF-β介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用，這可能與腫瘤細(xì)胞表面TGF-β受體的表達(dá)異常有關(guān)，同時(shí)，TGF-β 介導(dǎo)的抑制作用與TGF-βRⅠ或者TGF-βRⅡ的表達(dá)密切相關(guān)，在人類ESCC中，約53.8%的患者表現(xiàn)出TGF-βRⅠ的表達(dá)降低，這與腫瘤的侵襲深度、轉(zhuǎn)移和病理分期有關(guān)[12]。在人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，HOUGAARD等[13]發(fā)現(xiàn)TGF-βRⅡ的表達(dá)明顯降低。此外，編碼TGF-β受體和Smads的基因耗竭或突變會(huì)導(dǎo)致小鼠模型自發(fā)性腫瘤的發(fā)生，且與人類癌癥的不良存活率相關(guān)[14]。如果兩種受體的表達(dá)存在缺陷，或者其中一種存在表達(dá)缺陷，就可能直接導(dǎo)致其抑制增殖的作用喪失。在HNSCC患者中也發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，TGF-βRⅠ發(fā)生突變的概率較小，但70%以上的患者會(huì)出現(xiàn)TGF-βRⅡ表達(dá)的降低或消失[15]。TGF-βRⅡ耗竭可以使內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)增加，由此產(chǎn)生的TGF-β1過度表達(dá)可能會(huì)增加血管生成和炎性反應(yīng)，從而促進(jìn)HNSCC中腫瘤的進(jìn)展[14]。TGF-βRⅡ發(fā)生突變的概率較大，較多見。研究表明，在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者中TGF-βRⅡ表達(dá)出現(xiàn)降低或消失，在晚期OSCC患者中，TGF-βRⅡ的E221V/N238I突變可增強(qiáng)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)、導(dǎo)致更具侵入性的表型改變[16]。TGF-βRⅡ的缺陷與SCC的病情進(jìn)展密切相關(guān)。

本研究也發(fā)現(xiàn)，在一定劑量和作用時(shí)間范圍內(nèi)，TGF-β1對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用十分明顯；而在A431細(xì)胞中，TGF-β1的抑制作用卻不顯著。當(dāng)TGF-β1作用后，在A431細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞中均出現(xiàn)了TGF-β受體mRNA表達(dá)水平的下降，說明與HaCaT細(xì)胞相比，TGF-β1對(duì)A431細(xì)胞的作用更加明顯。TGF-β受體是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的必要條件，如果TGF-β受體表達(dá)水平下降或缺失，會(huì)導(dǎo)致TGF-β信號(hào)下傳受阻。由此推測(cè)，A431細(xì)胞可能通過誘導(dǎo)TGF-β受體的表達(dá)下調(diào)，使得TGF-β信號(hào)下傳受到阻礙，其抑制作用失效，使得表皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞，導(dǎo)致皮膚腫瘤細(xì)胞的抑癌基因功能喪失，癌基因被激活，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。