趙明智，李雪

（邯鄲市第一醫(yī)院，邯鄲 056000）

乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首，全球每年新診斷患者約150萬例、年死亡病例超過50萬，并且以約年度2%的速度增長[1]，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。手術(shù)切除是臨床治療乳腺癌的首選方案，而手術(shù)前后給予化療、內(nèi)分泌治療可明顯延緩疾病進(jìn)展、延長患者生存期[2]。順鉑是乳腺癌化療一線用藥，但腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥的產(chǎn)生所致藥物敏感性降低是導(dǎo)致治療失敗甚至死亡的重要原因[3]。因此，研發(fā)高效、低毒的化療耐藥逆轉(zhuǎn)劑對乳腺癌治療具有重要意義。

大蒜素（Allicin）是由蔥科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種有機(jī)硫化合物，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物，具有廣泛的抗腫瘤活性，對胃癌[4]、小細(xì)胞肺癌[5]、舌鱗狀細(xì)胞癌[6]等均具有一定的抑制作用，并且大蒜素能夠逆轉(zhuǎn)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞[7]、人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞[8]順鉑耐藥性。本實(shí)驗(yàn)將以人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞為受試細(xì)胞，研究大蒜素對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞順鉑耐藥性的影響并探索其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人乳腺癌耐順鉑細(xì)胞系MCF-7/DDP購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑 大蒜素注射液購自上海禾風(fēng)制藥有限公司（規(guī)格：5 mL∶60 mg，批號：4E38006）；順鉑注射液購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司（規(guī)格：6 mL∶30 mg，批號：20190125）；DMEM 培養(yǎng)基（高糖）、胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司（批號：190509、190611）；胰蛋白酶購自美國Sigma公司（批號：190106）；噻唑藍(lán)（MTT）購自美國AMRESCO公司（批號：1324B37）；AnnexinV-FITC試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（批號：20190417）；碘化丙啶（PI）購自 Sigma-Aldrich 公司（批號：P4170）；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān) X 蛋白（Bax）、細(xì)胞周期素 D1（CyclinD1）、周期蛋白依賴激酶 2、4、6（CDK2、CDK4、CDK6）抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號 ：201905014、201903008、201904025、201904001、201903012、201904011）；ECL 超敏化學(xué)發(fā)光液購自美國 Thermo Fisher Scientific公司（批號：34580）。

1.3 主要儀器 DL-CJ-1N型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；TC20型細(xì)胞計(jì)數(shù)器、GelDoc EZ型凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；Spectramax M2型酶標(biāo)儀（美國Medtronic公司）；BB5060U型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Hereaus公司）；TD5．5型離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Tetra Systerm型垂直電泳槽、Power Pac Basic轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-Bad公司）；WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）；CKX41型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱設(shè)置條件：5%二氧化碳、恒溫37℃、飽和濕度，每2天換液1次，觀察并記錄細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.5 MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期MCF-7/DDP細(xì)胞經(jīng)0．25%胰酶消化后計(jì)數(shù)、制備濃度1×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，每孔50μL接種于96孔板，設(shè)空白對照組（DMSO）、大蒜素組（20 μg/mL）[9]、順鉑組（6 μg/mL）[10]、聯(lián)合組（大蒜素 20 μg/mL+順鉑6 μg/mL），每組10個(gè)復(fù)孔。給藥干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL濃度為5 μg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄培養(yǎng)液、每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度值（OD490nm），細(xì)胞增殖抑制率（%）=（空白對照組OD490nm值-實(shí)驗(yàn)組OD490nm值）/空白對照組OD490nm值×100%

1.6 Annexin V-FITC染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取“1．5”制備的 MCF-7/DDP細(xì)胞懸液，每孔1 mL接種于6孔板，設(shè)空白對照組（DMSO）、大蒜素組（20 μg/mL）、順鉑組（6 μg/mL）、聯(lián)合組（大蒜素20 μg/mL+順鉑 6 μg/mL），每組 10 個(gè)復(fù)孔。給藥干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，經(jīng)0．25%胰酶消化后計(jì)數(shù)、取1×106個(gè)細(xì)胞并加入500 μL濃度為1%的FITC染液混勻后制備單細(xì)胞懸液，恒定4℃繼續(xù)避光孵育10 min后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡率，每組均重復(fù)3次取平均值。

1.7 PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布 取“1．5”制備的 MCF-7/DDP細(xì)胞懸液，每孔 1 mL接種于6孔板，設(shè)空白對照組（DMSO）、大蒜素組（20 μg/mL）、順鉑組（6 μg/mL）、聯(lián)合組（大蒜素20 μg/mL+順鉑 6 μg/mL），每組 10 個(gè)復(fù)孔。給藥干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，經(jīng)0．25%胰酶消化后離心（1 500 r/min，離心半徑 10 cm，5 min）取沉淀細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌后加入5 mL濃度75%的乙醇，-20℃固定1 h，離心取細(xì)胞、PBS洗滌后加入 5 μL水解酶Rnase，37℃放置1 h，加入PI染液行避光孵育0．5 h，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析細(xì)胞周期分布。

1.8 Western blot 法 檢測 Bax、Bcl-2、Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期MCF-7/DDP 細(xì)胞經(jīng) 0．25%胰酶消化，離心（1 500 r/min，離心半徑10 cm，5 min）棄上清取沉淀細(xì)胞，低溫4℃超聲破碎處理后離心（12 000 r/min，離心半徑8 cm，10 min）取上清液，BCA法定量蛋白濃度、沸水浴變性后取30 μg總蛋白，依次行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉1 h，滴加一抗4℃孵育12 h，滴加二抗37℃孵育1 h，用PBS溶液充分洗滌后滴加ECL顯色，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)獲得條帶；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量Bax、Bcl-2、Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6 蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）方式表示，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，取檢測限α=0．05，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞增殖抑制率 與空白對照組比較，大蒜素單藥組、順鉑單藥組、聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0．01）；與順鉑單藥組比較，聯(lián)合組 MCF-7/DDP細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0．01）。見表1。

2.2 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡狀況 如圖1所示，空白對照組MCF-7/DDP細(xì)胞僅可見少量凋亡細(xì)胞，大蒜素單藥組、順鉑單藥組、聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，聯(lián)合組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于順鉑組。與空白對照組比較，大蒜素單藥組、順鉑單藥組、聯(lián)合組MCF-7/DDP 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0．01）；與順鉑單藥組比較，聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0．01）。見表 1。

2.3 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞周期分布 與空白對照組比較，大蒜素單藥組、順鉑單藥組、聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞處于G0/G1期比例顯著升高而 G2/M 期比例顯著降低（P＜0．01）；與順鉑單藥組比較，聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞處于G0/G1期比例顯著升高而G2/M期比例顯著降低（P＜0．01）。見表 2。

表1 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞增值抑制率和凋亡率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rate and apoptosis rate of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）%

表1 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞增值抑制率和凋亡率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rate and apoptosis rate of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）%

注：與空白對照組比較，**P＜0．01；與順鉑單藥組比較，##P＜0．01。

組別空白對照組大蒜素單藥組順鉑單藥組聯(lián)合組增值抑制率 凋亡率0．00±0．00 6．17±0．92 27．41±3．86** 30．46±4．25**16．95±2．67** 19．81±2．30**40．58±4．73**## 39．52±4．75**##

圖1 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡狀況Fig.1 Apoptosis of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group

2.4 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及Bax/Bcl-2比值 與空白對照組比較，大蒜素單藥組、順鉑單藥組、聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量顯著升高而Bcl-2表達(dá)量顯著降低、Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0．05或 P＜0．01）；較順鉑單藥組，聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞Bax表達(dá)量顯著升高而Bcl-2表達(dá)量顯著降低、Bax/Bcl-2 比值顯著升高（P＜0．05 或 P＜0．01）。見圖 2 和表3。

表2 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞周期分布（±s）Tab.2 The proliferation inhibition rate and apoptosis rate of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）%

表2 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞周期分布（±s）Tab.2 The proliferation inhibition rate and apoptosis rate of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）%

注：與空白對照組比較，**P＜0．01；與順鉑單藥組比較，##P＜0．01。

組別空白對照組大蒜素單藥組順鉑單藥組聯(lián)合組G0/G1期 S期 G2/M期22．13±3．46 34．15±3．68 43．72±5．68 35．94±4．32** 33．65±3．76 30．41±3．42**28．57±3．63** 36．91±4．18 34．52±4．01**44．08±4．71**## 37．58±4．40 18．34±2．76**##

圖2 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of Bax，Bcl-2 proteins of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group

表3 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及 Bax/Bcl-2 值（±s）Tab.3 The expression of Bax，Bcl-2 proteins and Bax/Bcl-2 of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）

表3 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及 Bax/Bcl-2 值（±s）Tab.3 The expression of Bax，Bcl-2 proteins and Bax/Bcl-2 of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與順鉑單藥組比較#P＜0．05，##P＜0．01。

組別空白對照組大蒜素單藥組順鉑單藥組聯(lián)合組Bax/β-actin Bcl-2/β-actin Bax/Bcl-2 0．42±0．09 1．47±0．24 0．29±0．07 1．02±0．16** 1．14±0．18** 0．89±0．13**1．10±0．19** 1．20±0．25* 0．92±0．18**1．35±0．21**# 0．85±0．13**## 1．59±0．34**##

2.5 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá) 較空白對照組，大蒜素單藥組、順鉑單藥組、聯(lián)合組MCF-7/DDP細(xì)胞 Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）；較順鉑單藥組，聯(lián)合組MCF-7/DDP 細(xì)胞 Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見圖 3 和表4。

3 討論

圖3 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6 蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of Cyclin D1，CDK2，CDK4，CDK6 proteins of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group

大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物，既往研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡而逆轉(zhuǎn)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞順鉑耐藥性[7]、能夠通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程而逆轉(zhuǎn)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞順鉑耐藥性[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)大蒜素具有逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞順鉑耐藥性的作用。

順鉑抗腫瘤主要是通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡兩種途徑[11]。Shapiro[12]研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1-CDK4/CDK6復(fù)合體過表達(dá)將誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖而病變形成腫瘤，多個(gè)瘤種中均可見該復(fù)合物活性異常。本研究發(fā)現(xiàn)，與順鉑單藥組比較，大蒜素+順鉑聯(lián)合治療能夠顯著降低人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞 Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6 蛋白表達(dá)量；與空白對照組比較，大蒜素單藥組MCF-7/DDP細(xì)胞Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6 蛋白表達(dá)量顯著降低，這可能是大蒜素抑制MCF-7/DDP細(xì)胞增殖及逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞順鉑耐藥的重要分子機(jī)制。

Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡對腫瘤細(xì)胞化療敏感性非常重要，Bax、Bcl-2在線粒體凋亡通路調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用，Bax能夠激活促凋亡Caspase-3蛋白、促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C（Cyt-C）等而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Bcl-2則能夠抑制Caspase-3活化、保護(hù)線粒體膜而抑制Cyt-C釋放等而抑制細(xì)胞凋亡[14]。此外，體內(nèi)Bax以同源二聚體Bax-Bax形式或異源二聚體Bax-Bcl-2形式存在，Bax-Bax表現(xiàn)為促凋亡作用，但Bax-Bax的穩(wěn)定性低于Bax-Bcl-2，所以Bax/Bcl-2表達(dá)比值反映兩者對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用更加準(zhǔn)確[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與順鉑單藥組比較，大蒜素+順鉑聯(lián)合治療能夠顯著提高人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Bax表達(dá)量并降低Bcl-2表達(dá)量，提高Bax/Bcl-2值；與空白對照組比較，大蒜素單藥干預(yù)能夠顯著提高Bax表達(dá)量并降低Bcl-2表達(dá)量，提高Bax/Bcl-2值，這可能是大蒜素促進(jìn)MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡及逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞順鉑耐藥的重要分子機(jī)制。

綜上所述，大蒜素具有逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞順鉑耐藥性的藥理學(xué)作用，可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、周期相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡、阻滯其細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)。

表4 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 The expression of Cyclin D1，CDK2，CDK4，CDK6 of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）

表4 各組人乳腺癌耐順鉑MCF-7/DDP細(xì)胞Cyclin D1、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 The expression of Cyclin D1，CDK2，CDK4，CDK6 of human breast cancer cisplatin-resistant MCF-7/DDP cells in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與順鉑單藥組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別空白對照組大蒜素單藥組順鉑單藥組聯(lián)合組Cyclin D1/β-actin 0．52±0．08 0．36±0．07**0．43±0．09*0．28±0．05**##CDK2/β-actin CDK4/β-actin CDK6/β-actin 0．55±0．09 0．98±0．13 1．21±0．26 0．38±0．06** 0．84±0．15* 0．93±0．17**0．24±0．05** 0．82±0．13* 0．87±0．14**0．18±0．04**## 0．47±0．08**## 0．74±0．10**#