任 飛 張佳琦 胡恒康 梁 璧 黃有軍 婁和強(qiáng) 張啟香

(浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300)

報(bào)告基因是編碼易被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因。在含有或被轉(zhuǎn)入報(bào)告基因的細(xì)胞內(nèi)，報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物可以直接產(chǎn)生信號(hào)或通過特定的酶促反應(yīng)催化底物間接產(chǎn)生信號(hào)(Jawedetal., 1990)。相比于內(nèi)源性生色團(tuán)、化學(xué)染料和納米探針，報(bào)告基因的編碼產(chǎn)物具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)(李登峰等, 2018)。目前，在轉(zhuǎn)基因植物中，使用最為廣泛的為β-葡糖苷酸酶(GUS)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至今已獲得了上千種融合GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植物(Honmaetal., 2019)。其優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高，然而，由于其不能進(jìn)行活體染色，組織化學(xué)染色后試驗(yàn)材料失去繼續(xù)培養(yǎng)的可能，在檢測(cè)植物莖稈和葉片等時(shí)會(huì)對(duì)材料造成很大的傷害和損失(李新鋒等, 2016)。

熒光蛋白家族是從水螅蟲綱(Hydrozoa)和珊瑚蟲綱(Anthozoa)動(dòng)物中分離出的一類同源性蛋白，由熒光蛋白基因編碼，包括綠色、紅色、黃色和青色熒光蛋白等，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位以及動(dòng)態(tài)示蹤等方面有著廣泛的應(yīng)用(楊宇等， 2011)。相較于其他分子標(biāo)記，熒光蛋白更加易于與目的基因蛋白融合，對(duì)活細(xì)胞毒性小，應(yīng)用更加便利(王文旭等, 2019)。目前應(yīng)用最為廣泛的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是從維多利亞多管發(fā)光水母(Aequoreavictoria)中分離所得，由于其可以自發(fā)熒光，無需輔助因子和底物，無毒性，因此適用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞或生物體中蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化(吳瑞等， 2005)。GFP通過一系列體外分子進(jìn)化，發(fā)展出了多種熒光波長不同、發(fā)光強(qiáng)度極高的熒光蛋白，如增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、青色熒光蛋白(CFP)等。但這些熒光蛋白的發(fā)射波長均在440～529 nm之間，極易激發(fā)胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生熒光，導(dǎo)致成像時(shí)背景較高，在一定程度上限制了這些熒光蛋白的應(yīng)用。

紅色熒光蛋白(red fluorescent protein, RFP)是從香菇珊瑚(Discosomasp.)中提取的一種與綠色熒光蛋白同源的生物發(fā)光蛋白(Alfordetal., 2012)。Clontech公司將其進(jìn)行低毒、低寡聚化處理后形成突變體DsRED，其激發(fā)波長和發(fā)射波長均較長，具有對(duì)動(dòng)植物組織損傷小、光漂白作用低等優(yōu)點(diǎn)(Yanushevichetal., 2002)，目前已被廣泛用于動(dòng)植物以及酵母等真核細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的報(bào)告基因(Yarbroughetal., 2001； Jachetal., 2001； Czymmeketal., 2002； 劉娜等, 2005； Zhangetal., 2015)。然而，盡管DsRED已作為報(bào)告基因轉(zhuǎn)入多種植物，但成功獲得再生植株的案例報(bào)道不多(高嵩等, 2017)。

目前，探究外源基因在植物中表達(dá)的穩(wěn)定性和時(shí)空差異等研究多以當(dāng)年再生植株為試驗(yàn)材料(陳盼飛等, 2016)，多年生林木方面的研究較少，尤其果樹該方面的研究更為鮮見(王倩倩等， 2013)。在果樹轉(zhuǎn)基因研究中，番木瓜(Caricapapaya)、蘋果(Malusdomestica)、核桃(Juglansregia)等的研究比較深入。在核桃中，較早轉(zhuǎn)化的外源基因如GUS基因、卡那霉素抗性基因(nptⅡ)、蘇云金芽孢桿菌基因[BtcryIA(c)]、查耳酮合成反義基因(CHS)等(Mcgranahanetal., 1990； Dandekaretal., 1998； El-Euchetal., 1998； 湯浩茹等, 2000)，已轉(zhuǎn)入核桃并得到表達(dá)，但外源基因在核桃中表達(dá)的后續(xù)報(bào)道較少。本研究以前期通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)法獲得的攜帶外源報(bào)告基因DsRED的體細(xì)胞胚(簡(jiǎn)稱“體胚”)和體胚再生植株(Zhangetal., 2015)為研究對(duì)象，利用熒光顯微鏡和PCR、qRT-PCR、Western Blot等技術(shù)檢測(cè)DsRED基因在核桃體胚、組培苗以及溫室3年生苗中表達(dá)的穩(wěn)定性，以探討紅色熒光蛋白基因DsRED作為外源報(bào)告基因能否在核桃再生植株中穩(wěn)定表達(dá)，及其對(duì)核桃再生植株生長發(fā)育的影響，為進(jìn)一步拓寬DsRED作為報(bào)告基因的應(yīng)用范圍以及開展果樹嫁接專用砧木的分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料 植物材料來源于課題組2015年獲得、2017年再次經(jīng)熒光和PCR檢測(cè)為DsRED陽性的核桃體胚和再生植株(Zhangetal., 2015； Liuetal., 2017)。 其中DsRED基因?yàn)閜KGW-RR載體所攜帶，該pKGW-RR載體包含擬南芥(Arabidopsisthaliana)的組成型泛素啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因，載體結(jié)構(gòu)見Smit等(2005)。本研究所用組培苗為同一無性系DsRED體胚的子葉胚于2017年經(jīng)脫水萌發(fā)獲得的再生植株增殖并生根獲得； 3年生苗則是將上述組培苗于2017年經(jīng)生根、煉苗、馴化并定植于溫室，培養(yǎng)生長3年。

1.2 試驗(yàn)方法 1)培養(yǎng)條件 核桃體胚增殖培養(yǎng)、植株再生以及組培苗增殖、生根培養(yǎng)等的培養(yǎng)條件見Zhang等(2015)，光照時(shí)間每天16 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，培養(yǎng)溫度(25±2)℃。體胚每周繼代培養(yǎng)1次，組培苗每2周繼代培養(yǎng)1次。3年生苗培養(yǎng)于浙江農(nóng)林大學(xué)智能溫室中，常規(guī)管理。

2)臨時(shí)切片制作 分別取組培苗和3年生苗的根、莖和小葉，用5%(W/V)的瓊脂糖進(jìn)行包埋，冷卻凝固后，切割修理組織塊。將組織塊固定到振動(dòng)切片機(jī)VT1200(Leica公司)底座上，設(shè)定切片厚度100 μm后對(duì)組織進(jìn)行切片。并將切片置于載玻片上制成臨時(shí)切片，顯微鏡下觀察并拍照。每樣品選10個(gè)植株，生物學(xué)重復(fù)3次(下同)。

3)熒光檢測(cè) 取核桃DsRED體胚、組培苗的根、莖、小葉以及3年生苗的根和小葉(包括對(duì)照體胚、對(duì)照組培苗以及對(duì)照3年生苗的相應(yīng)結(jié)構(gòu))，置于體視顯微鏡SteREO Discovery V12(Zeiss 公司)下，分別在明場(chǎng)和熒光光照(激發(fā)波長540 nm)條件下利用ZEN lite成像軟件進(jìn)行連續(xù)拍照。

將制作的核桃DsRED組培苗的根、莖和小葉橫切面以及3年生苗的根和小葉橫切面臨時(shí)切片(含對(duì)照)，放置于正置熒光顯微鏡BX60(OLYMPUS公司)下，分別在明場(chǎng)和熒光光照(激發(fā)波長540 nm)條件下利用DP Controller成像軟件對(duì)各組織切片進(jìn)行連續(xù)拍照。

4)莖葉生長參數(shù)測(cè)定 對(duì)DsRED組培苗和3年生苗復(fù)葉的小葉數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； 用直尺分別測(cè)量組培苗和3年生苗的株高、株幅、莖粗、單葉長、單葉寬，并用掃描儀V330(EPSON公司)對(duì)每片單葉掃描成像，通過Image J軟件計(jì)算葉面積。

5)DsRED基因檢測(cè) 以CTAB法分別提取DsRED體胚、組培苗的根、莖、小葉(包括對(duì)照體胚、對(duì)照組培苗)的DNA，并進(jìn)行PCR檢測(cè)。引物由上海生工生物工程公司合成，正反向引物序列為F: 5′-ACGATGGTGTAGTCCTCGTTGT-3′； R: 5′-CTCC TCCAAGAACGTCATCAAG-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性4 min; 95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸4 min。最后1% TAE瓊脂糖凝膠電泳中若出現(xiàn) 681 bp大小的條帶，則為陽性。

6)DsREDmRNA的檢測(cè) 用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441，天根)，分別提取DsRED體胚、組培苗的根、莖、小葉(包括對(duì)照體胚、對(duì)照組培苗)總RNA。于上海生工合成正反向引物F: 5′-GCCGAACGGGAAATTGTC-3′和R: 5′-AGAGATGGCTGGAAGAGG-3′，以β-肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)部參照，正反向引物為F: 5′-GCCGAAC GGGAAATTGTC-3′和R: 5′-AGAGATGGCTGGAA GAGG-3′，對(duì)DsRED外源基因的表達(dá)量進(jìn)行校正，來實(shí)現(xiàn)對(duì)DsRED基因表達(dá)量的定量解析(Guoetal.， 2012)，用2-ΔΔCT法計(jì)算得出植物各組織部位中DsRED的表達(dá)量。

7)紅色熒光蛋白DsRED的檢測(cè) 分別稱取DsRED體胚、組培苗的根、莖、小葉(包括對(duì)照體胚、對(duì)照組培苗)各100 mg鮮組織，用植物蛋白抽提試劑盒(C500053, 生工)提取蛋白。Western Blot免疫表達(dá)條件如下： 以100 V 120 min為條件進(jìn)行12%(W/V)SDS-PAGE垂直電泳，以110 V 70 min為條件轉(zhuǎn)膜至孔徑為0.22 μm的硝酸纖維素印跡膜，5%脫脂牛奶(W/V)封閉1 h， Anti-RFP Taq(D195308, 生工)與β-Actin(AC009, ABclonal)以1∶1 000比例稀釋作為一抗孵育2 h，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(D110087, 生工)以1∶1 000比例稀釋作為二抗孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影后用Amersham Imager 600成像儀(美國通用電氣公司)成像拍照。利用ImageJ軟件對(duì)WB條帶進(jìn)行灰度分析(牛東東等， 2014)，計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。

圖1 紅色熒光蛋白基因DsRED在核桃體胚中穩(wěn)定表達(dá)Fig.1 Red fluorescent protein gene DsRED expressed stably in walnut somatic embryosA. 核桃體胚正常增殖 1,2: DsRED體胚; 3,4: 對(duì)照體胚。B. 核桃體胚發(fā)育階段(標(biāo)尺： 500 μm) 1-4: 分別為白光視野下DsRED體胚的球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚表型; 5-8: 分別為熒光視野下DsRED體胚的球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚表型; 9-12： 分別為白光視野下對(duì)照體胚的球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚表型； 13-16： 分別為熒光視野下對(duì)照體胚的球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚表型。A. Walnut somatic embryo proliferation 1,2: DsRED somatic embryos; 3,4: Control somatic embryos. B. Walnut somatic embryo developmental stages(Bar: 500 μm) 1-4: Globular embryo, heart-shaped embryo, torpedo embryo, cotyledonary embryo of DsRED somatic embryos in bright field; 5-8: Globular embryo, heart-shaped embryo, torpedo embryo, cotyledonary embryo of DsRED somatic embryos in fluorescent field; 9-12: Globular embryo, heart-shaped embryo, torpedo embryo, cotyledonary embryo of control somatic embryos in bright field; 13-16: Globular embryo, heart-shaped embryo, torpedo embryo, cotyledonary embryo of control somatic embryos in fluorescent field.

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，利用GraphPad Prism 7作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅色熒光蛋白基因DsRED在核桃體胚中表達(dá)穩(wěn)定 本研究所用的攜帶DsRED熒光蛋白的核桃體胚于2015年通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法成功獲得， 2017年再次通過熒光和PCR鑒定其陽性。目前，核桃DsRED體胚在自然光下呈粉紅至紅色，而對(duì)照體胚在自然光下呈白色，二者均可正常生長與增殖(圖1A)。DsRED體胚經(jīng)過3年增殖和繼代培養(yǎng)后，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，DsRED基因在核桃陽性體胚中表達(dá)穩(wěn)定，陽性體胚呈比較均一的粉紅色至紅色，形態(tài)正常，增殖良好； DsRED核桃體胚的增殖途徑大多為直接發(fā)生途徑，即次生胚不經(jīng)歷愈傷組織途徑而主要從母胚的子葉表面產(chǎn)生，體胚發(fā)育經(jīng)歷了球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚4個(gè)階段，各發(fā)育階段體胚在白光下呈粉紅至紅色，540 nm熒光激發(fā)下呈現(xiàn)明亮的紅色(圖1B 1-8)。同樣胚齡的對(duì)照體胚生長增殖良好，增殖途徑為體胚直接發(fā)生途徑，體胚發(fā)育同樣經(jīng)歷了球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚4個(gè)階段，各發(fā)育階段體胚在白光下呈白色至乳白色，540 nm熒光下無激發(fā)(圖1B 9-16)。以上結(jié)果表明DsRED基因?qū)颂殷w胚生長和增殖無不良影響且可以在體胚中穩(wěn)定表達(dá)。為了排除體胚熒光假陽性，對(duì)DsRED體胚DsRED基因在DNA和mRNA層面的表達(dá)水平分別進(jìn)行PCR和qRT-PCR檢測(cè)。研究結(jié)果表明，DsRED體胚擴(kuò)增獲得目的條帶，條帶大小與預(yù)期一致(681 bp)，對(duì)照體胚無相應(yīng)條帶(圖2A)。進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測(cè)DsRED體胚mRNA的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)體胚mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照體胚具顯著性差異，將DsRED體胚DsREDmRNA相對(duì)表達(dá)量定為1.0，則對(duì)照體胚的DsREDmRNA相對(duì)表達(dá)量為0(圖2B)。

為了檢測(cè)DsRED基因的翻譯水平，進(jìn)一步對(duì)DsRED體胚進(jìn)行Western Blot免疫表達(dá)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，DsRED體胚具有強(qiáng)陽性條帶，而對(duì)照體胚中無特異性條帶(圖3A)。進(jìn)一步利用ImageJ軟件進(jìn)行WB條帶灰度分析，計(jì)算結(jié)果表明，DsRED體胚熒光蛋白表達(dá)量與對(duì)照相比具顯著性差異。將DsRED體胚熒光蛋白相對(duì)表達(dá)量定義為1.0，則對(duì)照組體胚的表達(dá)量為0(圖3B)。表明DsRED在核桃體胚中可正常翻譯并穩(wěn)定表達(dá)。

圖2 PCR和qRT-PCR對(duì)核桃體胚和組培苗的DsRED基因的檢測(cè)Fig.2 PCR and qRT-PCR assay of DsRED gene in walnut somatic embryos and tissue-cultured plantletsA. DsRED基因的PCR檢驗(yàn) M： Marker； 1： 對(duì)照體胚； 2： DsRED體胚； 3-5： 對(duì)照組培苗根、莖、小葉； 6-8： DsRED組培苗根、莖、小葉。B. DsRED mRNA的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。A. PCR assay of DsRED gene M: Marker; 1: Control somatic embryo; 2: DsRED somatic embryo; 3-5: Root, stem, leaflet of control tissue-cultured plantlet; 6-8: Root, stem, leaflet of DsRED tissue-cultured plantlet. B. Relative expression of DsRED mRNA(P<0.05).

圖3 Western Blot檢測(cè)核桃體胚和組培苗中的DsRED紅色熒光蛋白Fig.3 Western Blot assay of red fluorescent protein DsRED in walnut somatic embryos and tissue-cultured plantletsA. DsRED紅色熒光蛋白的免疫印跡； B. DsRED紅色熒光蛋白的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。A. Western Blot of DsRED red fluorescent protein; B. Relative expression of DsRED red fluorescent protein (P<0.05).

2.2 紅色熒光蛋白基因DsRED在核桃組培苗中表達(dá)穩(wěn)定 1)核桃DsRED組培苗表型和熒光表達(dá)分析 將熒光檢測(cè)呈明亮紅色且PCR、qRT-PCR驗(yàn)證為陽性的子葉胚以及對(duì)照子葉胚進(jìn)行植株再生獲得DsRED和對(duì)照組培苗，而后常規(guī)增殖培養(yǎng)(圖4A1,2)。待新芽培養(yǎng)3～4周，分別檢測(cè)其表型，發(fā)現(xiàn)DsRED組培苗為奇數(shù)羽狀復(fù)葉，每復(fù)葉平均小葉數(shù)為7，葉長橢圓形，長平均0.97 cm，寬平均0.48 cm，葉面積平均0.69 cm2，株高平均5.72 cm，株幅平均3.54 cm，莖粗平均0.24 cm； 對(duì)照植株每復(fù)葉平均小葉數(shù)為7，長平均0.98 cm，寬平均0.46 cm，葉面積平均0.74 cm2，株高平均5.69 cm，株幅平均3.43 cm，莖粗平均0.26 cm。DsRED組培苗各指標(biāo)與對(duì)照相比無顯著差異(P<0.05)(表1)。

圖4 紅色熒光蛋白基因DsRED在核桃組培苗中穩(wěn)定表達(dá)Fig.4 Red fluorescent protein gene DsRED expressed stably in walnut tissue-cultured plantletsA. 組培苗 1: DsRED組培苗; 2: 對(duì)照組培苗。 B. 組培苗外部熒光表達(dá)(標(biāo)尺： 3 mm) 1-3: 分別為DsRED組培苗白光下根、莖、小葉外形; 4-6:分別為DsRED組培苗熒光下根、莖、小葉外形; 7-9: 分別為對(duì)照組培苗白光下根、莖、小葉外形; 10-12: 分別為對(duì)照組培苗熒光下根、莖、小葉外形。 C. 組培苗顯微結(jié)構(gòu)熒光表達(dá)(標(biāo)尺： 600 μm) 1-3: 分別為DsRED組培苗白光下根、莖、小葉橫切面; 4-6: 分別為DsRED組培苗熒光下根、莖、小葉橫切面; 7-9: 對(duì)照組培苗白光下根、莖、小葉橫切面； 10-12: 對(duì)照組培苗熒光下根、莖、小葉橫切面。A. In vitro plantlets 1: DsRED tissue-cultured plantlet; 2: Control tissue-cultured plantlet. B. Appearance of tissue-cultured plantlets(Bar: 3 mm) 1-3: Root, stem, leaflets of DsRED tissue-cultured plantlet in bright field; 4-6: Root, stem, leaflets of DsRED tissue-cultured plantlet in fluorescent field; 7-9: Root, stem, leaflets of control tissue-cultured plantlet in bright field; 10-12: Root, stem, leaflets of control tissue-cultured plantlet in fluorescent field. C. Section(Bar: 600 μm) 1-3: Cross section of root, stem, leaflet of DsRED tissue-cultured plantlet in bright field; 4-6: Cross section of root, stem, leaflets of DsRED tissue-cultured plantlet in fluorescent field; 7-9: Cross section of root, stem, leaflets of control tissue-cultured plantlet in bright field; 10-12: Cross section of root, stem, leaflets of control tissue-cultured plantlet in fluorescent field.

為了明確增殖培養(yǎng)對(duì)組培苗中DsRED基因表達(dá)的影響，將DsRED組培苗的莖尖、莖段、小葉和根置于熒光體視顯微鏡下鏡檢，結(jié)果表明，DsRED組培苗的莖尖、莖段、小葉以及根表面均呈現(xiàn)明亮且較為均一的紅色，其中葉柄切除處顏色鮮艷，可能是由于該處維管組織豐富(圖4B 1-6)； 對(duì)照植株的相應(yīng)結(jié)構(gòu)均在熒光下無激發(fā)，視野中呈現(xiàn)黑色(圖4B 7-12)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DsRED紅色熒光蛋白基因在組培苗中表達(dá)的穩(wěn)定性，對(duì)組培苗營養(yǎng)器官的顯微結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了熒光檢測(cè)，結(jié)果表明，在組培苗的根、莖、葉中，DsRED紅色熒光蛋白基因可穩(wěn)定表達(dá)。其中，在根的表皮、皮層、維管柱以及髓薄壁細(xì)胞中均有表達(dá)，且維管柱中顏色最鮮艷，提示該部位表達(dá)量最高； 在莖中，在表皮、皮層、維管形成層以及髓薄壁細(xì)胞中均有表達(dá)，其中維管形成層部位的細(xì)胞熒光表達(dá)量最高，表皮細(xì)胞表達(dá)量次之，皮層薄壁細(xì)胞和髓薄壁細(xì)胞表達(dá)量較弱； 在葉的橫切片中可以發(fā)現(xiàn)，維管束和葉肉細(xì)胞表達(dá)量較高(圖4C 1-6)。對(duì)照植株的根、莖、葉橫切面在540 nm熒光下無激發(fā)，顯微鏡視野中呈現(xiàn)黑色(圖4C 7-12)。

表1 DsRED基因表達(dá)對(duì)核桃組培苗莖、葉生長的影響①Tab.1 Effect of DsRED gene expression on stem and leaf growth of walnut tissue-cultured plantlets

2)核桃組培苗DsRED基因表達(dá)分析 為了排除熒光假陽性，對(duì)DsRED組培苗的DsRED基因在DNA和RNA水平的表達(dá)分別進(jìn)行PCR和qRT-PCR分析。結(jié)果表明，DsRED組培苗的根、莖、葉均擴(kuò)增獲得目的條帶，條帶大小與預(yù)期一致(681 bp)，對(duì)照組培苗無相應(yīng)條帶(圖2A)。通過qRT-PCR檢測(cè)DsRED組培苗的根、莖、葉中DsREDmRNA的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)組培苗根的DsREDmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.97±0.05，莖為1.03±0.08， 小葉為1.02±0.04(將熒光陽性體胚DsREDmRNA相對(duì)表達(dá)量定為1.0)，表明DsRED組培苗的根、莖、葉和DsRED體胚的表達(dá)量無顯著性差異，而對(duì)照組培苗中的DsREDmRNA相對(duì)表達(dá)量均為0(圖2B)。

圖5 DsRED紅色熒光蛋白在3年生苗中穩(wěn)定表達(dá)Fig.5 DsRED red fluorescent protein expressed stably in 3-year-old walnut regenerated plantsA. 3年生苗 1： DsRED 3年生苗; 2： 對(duì)照3年生苗。B. 3年生苗外部熒光表達(dá)(標(biāo)尺 3, 6, 9, 12: 10 μm; 其余: 1 cm) 1-3： 分別為DsRED 3年生苗根、小葉和葉表皮在白光下； 4-6： 分別為DsRED 3年生苗根、小葉和葉表皮在熒光下； 7-9： 分別為對(duì)照3年生苗根、小葉和葉表皮在白光下； 10-12： 分別為對(duì)照3年生苗根、小葉和葉表皮在熒光下。C. 3年生苗顯微結(jié)構(gòu)熒光表達(dá)(標(biāo)尺： 300 μm)1, 2： 分別為DsRED 3年生苗根和小葉在白光下的橫切面； 3, 4： 分別為DsRED 3年生苗根和小葉在熒光下的橫切面； 5, 6： 分別為對(duì)照3年生苗根和小葉在白光下的橫切面； 7, 8： 分別為對(duì)照3年生苗根和小葉在熒光下的橫切面。A. 3-year-old regenerated plants 1: DsRED 3-year-old regenerated plant; 2: Control 3-year-old regenerated plant. B. Appearance of 3-year-old regenerated plants(Bar 3, 6, 9, 12: 10 μm; the rest: 1 cm)1-3: Root, leaflet, leaf epidermis of DsRED 3-year-old regenerated plant in bright field; 4-6: Root, leaflet, leaf epidermis of DsRED 3-year-old regenerated plant in fluorescent field; 7-9: Root, leaflet, leaf epidermis of control 3-year-old regenerated plant in bright field; 10-12: Root, leaflet, leaf epidermis of control 3-year-old regenerated plant in fluorescent field. C. Section(Bar: 300 μm) 1, 2: Cross section of root and leaflet of DsRED 3-year-old regenerated plant in bright field; 3, 4: Cross section of root and leaflet of DsRED 3-year-old regenerated plant in fluorescent field; 5, 6: Cross section of root and leaflet of control 3-year-old regenerated plant in bright field; 7, 8: Cross section of root and leaflet of control 3-year-old regenerated plant in fluorescent field.

為了檢測(cè)DsRED基因在組培苗中的翻譯水平，進(jìn)一步開展了Western Blot免疫表達(dá)分析。結(jié)果表明，DsRED組培苗根、莖和小葉中均有強(qiáng)陽性條帶，而所有對(duì)照組培苗中無特異性條帶(圖3A)。進(jìn)一步利用ImageJ軟件進(jìn)行WB條帶灰度分析，計(jì)算結(jié)果表明，DsRED組培苗根、莖、小葉中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.06±0.14，1.14±0.19，1.13±0.19(DsRED體胚相對(duì)表達(dá)量定為1.0)，各組織間無顯著性差異，而對(duì)照組培苗根、莖、葉中的表達(dá)量均為0(圖3B)。表明DsRED在核桃組培苗中可正常翻譯并穩(wěn)定表達(dá)。

2.3 紅色熒光蛋白基因DsRED在核桃3年生苗中表達(dá)穩(wěn)定 將培養(yǎng)獲得的健壯DsRED組培生根苗(含對(duì)照)移栽至溫室。DsRED組培苗生根馴化后成活率高，成活后移栽至大棚正常生長3年(圖5A)。對(duì)DsRED 3年生苗表型進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)DsRED 3年生苗葉片同樣為奇數(shù)羽狀復(fù)葉，頂端小葉最大，其下對(duì)生小葉依次變小，每片復(fù)葉平均小葉數(shù)11片。小葉長橢圓形，平均長15.32 cm，平均寬5.84 cm，平均葉面積57.41 cm2。每片小葉頂端急尖，基部歪斜，邊緣上部具稀疏細(xì)鋸齒、近基部全緣。植株株高92.88 cm，平均株幅71.78 cm，平均莖粗0.89 cm。對(duì)照苗每復(fù)葉平均小葉數(shù)11，長平均14.52 cm，寬平均5.63 cm，葉面積平均50.33 cm2，株高平均94.14 cm，株幅平均69.24 cm，莖粗平均0.88 cm。DsRED植株各指標(biāo)與對(duì)照相比無顯著性差異(P<0.05)(表2)。表明DsRED基因?qū)颂抑仓耆~形等表型沒有產(chǎn)生影響。

體視顯微鏡熒光鏡檢結(jié)果表明，DsRED 3年生苗小葉及根表面均呈現(xiàn)明亮的紅色，同時(shí)，葉表皮細(xì)胞熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁中熒光表達(dá)量明顯高于原生質(zhì)，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的DsRED熒光表達(dá)量高于其他表皮細(xì)胞，對(duì)照苗的相應(yīng)結(jié)構(gòu)均在熒光下無激發(fā)，視野中呈現(xiàn)黑色(圖5B)。為了進(jìn)一步跟蹤檢測(cè)DsRED紅色熒光蛋白在核桃DsRED 3年生苗顯微結(jié)構(gòu)中的表達(dá)，對(duì)3年生苗也進(jìn)行了根和葉的橫切面熒光檢測(cè)。結(jié)果表明，DsRED紅色熒光蛋白在根的橫切面上有明顯表達(dá)，其中，在初生木質(zhì)部、維管形成層以及周皮中表達(dá)量較高，在皮層薄壁細(xì)胞以及次生木質(zhì)部表達(dá)量稍低，而對(duì)照3年生苗在熒光視野下無激發(fā)，視野中呈現(xiàn)黑色(圖5C)。

表2 DsRED基因表達(dá)對(duì)核桃3年生苗莖、葉生長的影響Tab.2 Effect of DsRED gene expression on stem and leaf growth of 3-year-old walnut regenerated plants

3 討論

報(bào)告基因因其優(yōu)異性狀被廣泛應(yīng)用，DsRED作為一個(gè)新型報(bào)告基因，已在多個(gè)物種中成功應(yīng)用(高嵩等, 2017)。在真菌中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將DsRED熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入從北京玉米(Zeamays)品種‘西玉3號(hào)’病株分離出的新月彎孢(Curvularialunata)菌株中，成功對(duì)玉米新月彎孢菌株進(jìn)行遺傳標(biāo)記并獲得穩(wěn)定遺傳(陳茂功等, 2012)； 將DsRED通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入擬輪生鐮刀菌(Fusariumverticillioides)中，深入探究擬輪生鐮刀菌與水稻間的互作關(guān)系(Wuetal., 2016)。在農(nóng)作物中，采用農(nóng)桿菌侵染萌動(dòng)胚的方法，將DsRED基因轉(zhuǎn)入玉米品種‘鄭單958’中，用于快速篩選含有目標(biāo)基因的種子(高嵩等，2017)；DsRED基因被用于研究水稻(Oryzasativa)胚乳中淀粉體分裂和淀粉合成涉及的分子機(jī)制(Wuetal., 2016)； 將DsRED基因轉(zhuǎn)入陸地棉(Gossypiumhirsutum)愈傷組織中，之后在愈傷組織、體細(xì)胞胚和大多數(shù)再生植株的組織、器官中都可以檢測(cè)到紅色熒光，并獲得多個(gè)品系，進(jìn)一步將其中轉(zhuǎn)基因品系Yz-2-DsRed2作為雄性親本與其他棉花品種雜交后，紅色的遺傳力依舊非常穩(wěn)定(Sunetal.， 2018)； 轉(zhuǎn)入DsRED基因的大豆(Glycinemax)依舊可育，自花授粉得到的T0代種子在熒光顯微鏡下顯示亮紅色熒光，繼續(xù)培養(yǎng)得到T2代種子，其與非轉(zhuǎn)基因大豆生長方式相似，依舊表達(dá)DsRED基因且未出現(xiàn)性狀分離(Nishizawaetal., 2006)。與DsRED在棉花體胚中的表現(xiàn)相似，在本研究中，試驗(yàn)材料自Zhang等(2015)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將DsRED基因轉(zhuǎn)入核桃體胚，至今陽性體胚已繼代培養(yǎng)5年，DsRED基因依然能夠在核桃體胚中穩(wěn)定表達(dá)，陽性體胚外表依舊呈粉紅色，并且能在540 nm激光下發(fā)出明亮紅色熒光?？梢奃sRED基因可在核桃體胚中穩(wěn)定表達(dá)且對(duì)核桃體胚的增殖和生長無不良影響。

轉(zhuǎn)基因植株離體保存需利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)。周瑞金等(2011)研究證明外源基因在繼代培養(yǎng)6～8年的組培苗中穩(wěn)定存在，并在大部分株系中表達(dá)。不僅在組培苗中，外源Bt基因能夠在8年生741楊[Populusalba× (P.davidiana+P.simonii)×P.tomentosa]中穩(wěn)定表達(dá)(陳盼飛等, 2016)。王倩倩等(2013)對(duì)繼代保存了13年的轉(zhuǎn)基因蘋果(Malusdomestica)組培苗和在田間定植 6～8 年的轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的遺傳和表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明所有蘋果轉(zhuǎn)基因株系組培苗中均可檢測(cè)出CpTI特異基因片斷，轉(zhuǎn)入的外源CpTI基因在所測(cè)田間株系的花粉、葉片及大部分的根系中均能檢測(cè)到，但在極少數(shù)株系的根系中未能檢測(cè)到特異條帶，表明外源基因可在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定存在，但在不定根發(fā)生過程中可能會(huì)出現(xiàn)丟失現(xiàn)象，這與曾凡鎖等(2008)對(duì)外源基因(Bgt基因、GUS基因、NptⅡ基因)在轉(zhuǎn)基因白樺(Betulaplatyphylla)中的結(jié)果一致。本研究對(duì)核桃DsRED繼代培養(yǎng)3年的組培苗和溫室3年生苗進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明， 核桃DsRED組培苗和3年生苗各組織部位中均穩(wěn)定高度表達(dá)DsRED基因，可見DsRED基因的表達(dá)對(duì)核桃植株再生和生長無不良影響，且其表達(dá)具有高度的穩(wěn)定性。

然而，經(jīng)過多代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因組培苗還涉及材料變異和外源基因是否丟失的問題。如香蕉(Musanana)(朱靖杰, 1995)、草莓(Fragaria×ananassa)(Swartz, 1981)、番木瓜(李衛(wèi)東等, 2006)的離體培養(yǎng)后代有明顯的變異，且隨繼代次數(shù)的增加，變異機(jī)率會(huì)大大增加，朱靖杰(1995)和李衛(wèi)東等(2006)分別提出，香蕉與番木瓜離體培養(yǎng)代數(shù)應(yīng)分別控制在10代和32代內(nèi)。此外，外源基因的插入可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂過程的異常，從而造成外源基因的丟失(李小方等, 2001)。外源基因進(jìn)入受體后因拷貝數(shù)大小不一、插入位點(diǎn)不定、整合的DNA結(jié)構(gòu)變異大及受外界環(huán)境因素誘導(dǎo)等可能會(huì)導(dǎo)致受體植物中的外源基因出現(xiàn)失活、沉默、丟失等現(xiàn)象，從而影響外源基因在受體植物及其后代中的穩(wěn)定性(趙彥平等, 2011)。報(bào)告基因作為外源基因能否在試驗(yàn)對(duì)象生長過程及后代繁殖中穩(wěn)定表達(dá)需要進(jìn)一步研究。Taylor(1997)認(rèn)為外源基因的表達(dá)水平在后代延續(xù)過程中會(huì)發(fā)生變化。有研究發(fā)現(xiàn)，植物的生長發(fā)育及復(fù)雜的外界環(huán)境都會(huì)對(duì)導(dǎo)入植物材料的外源基因造成失活和沉默，從而影響外源基因的表達(dá)穩(wěn)定性，報(bào)告基因也不例外(Stemetal., 1997； 夏蘭芹等, 2000)。轉(zhuǎn)玉米二氫酮醇還原酶基因(A1)的矮牽牛(Petuniahybrida)移栽至大田后，由于環(huán)境溫度升高、光照增強(qiáng)，DNA的甲基化引起外源基因的失活(Meyer, 2000)。研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫在一定程度上可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因107楊(Populus×euramericana‘4/76’)的外源Bt基因、BADH基因表達(dá)加強(qiáng)，推測(cè)正常條件下外源基因表達(dá)受到植物的某種抑制，脅迫改變了植物的代謝，緩解對(duì)外源基因的表達(dá)抑制(陳盼飛等, 2017)?？梢?，不同外源基因在不同試驗(yàn)材料中的表達(dá)穩(wěn)定性有所不同。在報(bào)告基因中，有研究發(fā)現(xiàn)紅、綠、黃熒光蛋白標(biāo)記根瘤菌接合子在傳代 5、10、20 代的過程中，熒光質(zhì)粒丟失率不斷增加(楊曉玫等, 2018)。同樣地早期GUS染色為陽性的橡膠樹(Heveabrasiliensis)，在連續(xù)繼代再生植株的過程中出現(xiàn)了基因丟失的現(xiàn)象(李季等, 2013)。在轉(zhuǎn)GUS基因白樺中，11個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中有2株出現(xiàn)了GUS基因沉默,其余植株均有不同水平的GUS表達(dá)，且這種差異與GUS基因的拷貝數(shù)沒有必然聯(lián)系(曾凡鎖等, 2009)。

本研究中，盡管DsRED在核桃體胚、組培苗及3年生苗中表達(dá)穩(wěn)定，但后續(xù)表達(dá)是否會(huì)降低或丟失，表達(dá)部位是否具有組織特異性，如在花、果實(shí)和種子中是否會(huì)表達(dá)等，還需要進(jìn)一步跟蹤研究。此外，有關(guān)熒光蛋白的研究目前主要集中于熒光蛋白的實(shí)際應(yīng)用(Dongetal., 2018)，缺乏對(duì)熒光蛋白本身的功能性和遺傳動(dòng)態(tài)的研究(Webbetal., 1995； 楊曉玫等, 2019)。若能深入了解熒光蛋白的發(fā)光機(jī)理、標(biāo)記條件、適用結(jié)構(gòu)等，可更有針對(duì)性地選擇相應(yīng)的熒光蛋白用于科學(xué)研究，對(duì)于指導(dǎo)熒光蛋白的精準(zhǔn)定位具有十分重要的意義。

4 結(jié)論

紅色熒光蛋白基因DsRED轉(zhuǎn)入核桃體胚后，不僅能夠在體胚中穩(wěn)定表達(dá)，并且在繼代培養(yǎng)3年的組培苗和3年生溫室苗中同樣能夠穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)一步在DNA、mRNA和蛋白水平分析表明，DsRED基因在核桃各組織部位中均有表達(dá)，是核桃理想的遺傳轉(zhuǎn)化報(bào)告基因。本研究結(jié)果可為DsRED作為報(bào)告基因在果樹中的應(yīng)用提供參考。